Ngoài ra, một số nghiên cứu cho thấy lợi ích lớn của hợp chấtpolyphenol đối với sức khỏe con người, như tác dụng chống lại sự phá hủynội tạng, làm chậm sự lây lan của các tế bào ung thư
Trang 1LỜI CẢM ƠN
Để hoàn thành được khóa luận này, em đã nhận được sự giúp đỡ, chỉbảo tận tình cùng những ý kiến đóng góp quý báu của các thầy cô, những lờiđộng viên chân tình nhất từ bạn bè
Trước hết, em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới T.S Đào Văn Tấn,thầy đã tận tình chỉ bảo, hướng dẫn để em có thể học tập, nghiên cứu và thựchiện đề tài
Em xin chân thành cảm ơn các thầy cô trong tổ bộ môn Hóa sinh và Tếbào học, Trung tâm Nghiên cứu Hệ sinh thái Rừng ngập mặn đã tạo mọi điềukiện thuận lợi, giúp đỡ em trong suốt thời gian vừa qua
Cuối cùng, em xin cảm ơn gia đình, người thân, bạn bè đã luôn sátcánh, tin tưởng, giúp đỡ em ngay từ khi tiến hành cho đến khi hoàn thànhkhóa luận này
Hà Nội, tháng 4 năm 2014
Tác giả
Ngô Thị Thơ
Trang 2DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
MH Dịch keo chiết bằng phương pháp ngâm
trong methanolMSM Dịch keo chiết bằng phương pháp Soxhlet
và hòa tan keo trong methanol 10%
MSH Dịch keo chiết bằng phương pháp Soxhlet
và hòa tan keo trong nước cất
TN Thí nghiệmDPPH 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazylSC% Scavenging capacity, khả năng quétRNM Rừng ngập mặn
VQG Vườn Quốc giaI% % Inhibition, % ức chế
Trang 3DANH MỤC BẢNG
Bảng 2 Tỉ lệ khối lượng khô các bộ phận của cây bần chua (%) 23
Bảng 3 Hàm lượng polyphenol tổng số của các dung dịch keo khác
Bảng 4 Kết quả thử hoạt tính kháng khuẩn của các dung dịch keo chiết
Bảng 5a So sánh giá trị trung bình (cm) rễ mầm cải củ trước khi xử lí
với dịch keo chiết bằng phương pháp ngâm trong methanol (MH) của vỏ
thân, lá bần chua
33
Bảng 5b So sánh giá trị trung bình (cm) rễ mầm cải củ trước khi xử lí
với dịch keo chiết bằng phương pháp Soxhlet hòa tan keo bằng dung
môi nước (MSH) của các bộ phận cây bần chua
34
Bảng 5c So sánh giá trị trung bình (cm) rễ mầm cải củ trước khi xử lí
với dịch keo chiết bằng phương pháp phương pháp Soxhlet hòa tan keo
bằng dung môi methanol 10% (MSM) của các bộ phận cây bần chua
35
Bảng 6a So sánh giá trị trung bình (cm) rễ mầm cải củ sau khi xử lí với
Bảng 6b.1 So sánh giá trị trung bình (cm) rễ mầm cải củ sau khi xử lí
với dịch keo chiết MSH của vỏ thân, lá bần chua 36
Bảng 6b.2 So sánh giá trị trung bình (cm) rễ mầm cải củ sau khi xử lí
với dịch keo chiết MSH của thịt quả, hạt bần chua 37
Bảng 6c.1 So sánh giá trị trung bình (cm) rễ mầm cải củ sau khi xử lí
với dịch keo chiết MSM của vỏ thân, lá bần chua 37
Bảng 6c.2 So sánh giá trị trung bình (cm) rễ mầm cải củ sau khi xử lí
với dịch keo chiết MSM của thịt quả, lá bần chua 38
Bảng 7 Hoạt tính ức chế sinh trưởng rễ mầm cải củ I (%) của các dịch
keo chiết chưa pha loãng từ các bộ phận của cây mẫu 38
Bảng 8 Nồng độ chất hòa tan (µg/ml) trong các dung dịch keo từ các bộ
Bảng 9 Giá trị IC50 (µg/ml) của các dịch keo chiết từ các bộ phận cây
Bảng 10 Nồng độ chất hòa tan (µg/ml) trong các dung dịch keo từ vỏ 44
Trang 4thân của cây bần chua
Bảng 11 Hoạt tính chống oxy hóa của các dung dịch keo chiết từ vỏ
Trang 5DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 2 Cấu trúc phân tử của catechine và gallocatechine 5Hình 3 Cấu trúc phân tử của quercetin và kaempferol 6
Hình 6a Tương quan giữa nồng độ và khả năng ức chế sinh
trưởng của dịch keo chiết MH từ vỏ thân, lá cây bần chua
39
Hình 6b Tương quan giữa nồng độ và khả năng ức chế sinh
trưởng của dịch keo chiết MSM từ các bộ phận cây bần chua
40
Hình 6c Tương quan giữa nồng độ và khả năng ức chế sinh
trưởng của dịch keo chiết MSH từ các bộ phận cây bần chua
41
Hình 7 Tương quan giữa nồng độ các dịch keo chiết của vỏ
thân bần chua và % quét gốc tự do DPPH (%SC)
45
Trang 6MỤC LỤC
Trang 7Phần I MỞ ĐẦU 1.1 Lý do chọn đề tài
Rừng ngập mặn (Mangroves) không chỉ có tác dụng to lớn trong việcbảo vệ bờ biển, điều hòa khí hậu, lưu giữ và phân hủy các chất ô nhiễm làmsạch môi trường biển, chống gió bão, hạn chế xói lở, giữ phù sa, tạo điều kiện
mở rộng đất đai ra biển, mà còn cung cấp những sản phẩm có giá trị dược liệunhư: tannin, các chất kháng khuẩn, các chất chống oxy hóa, nhiều loài câyđược sử dụng trong dân gian để chữa bệnh có giá trị như cây ráng chữa bỏng,mụn nhọt; cui biển chữa tiêu chảy, kiết lị; sài hồ nam chữa đau đầu, giảm sốt[8] Phân bố từ 30o vĩ Bắc tớ 38o vĩ Nam, đặc trưng ở vùng nhiệt đới và cậnnhiệt đới, rừng ngập mặn trên thế giới chiếm diện tích 181007 km2 [50] ỞViệt Nam diện tích RNM là 156000 ha tính đến năm 2003 [18], đến nay xấp
xỉ 200000 ha Vì thế, rừng ngập mặn trên thế giới nói chung và rừng ngậpmặn Việt Nam nói riêng là nơi cho các nhà khoa học nghiên cứu không chỉ
về đa dạng sinh học mà còn là khu vực hấp dẫn trong nghiên cứu về hoạt tínhsinh học của các loài thực vật ngập mặn
Trên thế giới bắt đầu đã có những nghiên cứu về thành phần các chất từthực vật rừng ngập mặn, đăc biệt là các hợp chất có tính độc và có tính khángsinh, trong đó, có hợp chất polyphenol Polyphenol là hợp chất có tính chốngoxy hóa, có thể kháng khuẩn và ngăn chặn sự tấn công của sâu hại cây ngậpmặn Ngoài ra, một số nghiên cứu cho thấy lợi ích lớn của hợp chấtpolyphenol đối với sức khỏe con người, như tác dụng chống lại sự phá hủynội tạng, làm chậm sự lây lan của các tế bào ung thư vú, giúp động mạchkhông bị tích trữ chất béo, co giãn để duy trì lưu lượng máu và giữ cho độngmạch không bị xơ vữa… Một số chi thực vật rừng ngập mặn trong đó có chi
Derris đã được chỉ ra rằng có tính độc ở một số bộ phận như rễ [55] Zubairi (2004) đã tách được chất độc từ cây cổ rùa (Derris elliptica) [54] Năm 2005,
công trình nghiên cứu của Jianxin Cui đã phân tích limonoid trong thành
Trang 8phần cây xu ổi Xylocarpus granatum có khả năng trị bệnh cúm [32] Năm
2006, Jithesh cũng đề cập đến khả năng chống oxy hóa của nhóm cây ngậpmặn [34]
Những nghiên cứu về các chất có hoạt tính sinh học từ cây ngập mặn ởViệt Nam chưa nhiều Vườn Quốc gia Xuân Thủy là một khu rừng ngập mặnthuộc khu Dự trữ Sinh quyển Châu thổ Sông Hồng, là rừng ngập mặn đầu tiên
ở Việt Nam được quốc tế công nhận theo công ước Ramsar và là rừng ngậpmặn thứ 50 của thế giới Những nghiên cứu về đa dạng sinh học khu vực nàytương đối kĩ: có tổng số 184 loài thuộc 137 chi của 60 họ thực vật có mạch[9]; thân mềm chân bụng có 40 loài, thuộc 25 giống, 5 bộ, 3 phân lớp [11].Những năm gần đây cũng đã có một số nghiên cứu về giá trị dược liệu cũngnhư các hợp chất có hoạt tính sinh học như nghiên cứu các hoạt tính độc củacây cóc kèn, hoạt tính chống oxy hóa, kháng khuẩn, ức chế sinh trưởng thựcvật của cây ô rô, cây bần không cánh, cây sài hồ nam Cây bần chua
(Sonneraia caseolaris) là một trong hai loài cây ngập mặn thuộc chi Bần (Sonneratia), họ Bần (Sonneratiaceae) được trồng tại Vườn Quốc gia Xuân
Thủy Đây là loài cây mới chỉ được nghiên cứu kĩ về một số đặc tính sinh lí,sinh trưởng, sinh thái, phân bố… mà những nghiên cứu về các chất hoạt tínhsinh học của loài cây này ở Việt Nam nói chung và VQG Xuân Thủy nóiriêng đến nay vẫn chưa được quan tâm
Vì những lí do trên, chúng tôi thực hiện đề tài: “Định lượng polyphenol tổng số và một số hoạt tính sinh học của chiết xuất methanol từ cây bần chua (Sonneratia caseolaris (L.) Engl.) thu thập Vườn Quốc gia Xuân Thủy”.
1.2 Mục tiêu nghiên cứu
- Xác định hàm lượng polyphenol tổng số của một số bộ phận khác
nhau của cây bần chua
- Kiểm tra khả năng kháng một số chủng vi khuẩn kiểm định của dịchkeo chiết bần chua bằng các phương pháp chiết mẫu khác nhau
Trang 9- Kiểm tra khả năng ức chế sinh trưởng thực vật của dịch keo chiết các
bộ phận khác nhau của bần chua theo các phương pháp chiết rút khác nhau
- Kiểm tra hoạt tính chống oxy hóa của dịch keo chiết bần chua bằngcác phương pháp chiết mẫu khác nhau
1.3 Nội dung nghiên cứu
- Thu hái và tiến hành chiết dịch thô bằng dung môi là methanol từ các
bộ phận khác nhau của cây bần chua (Sonneraia caseolaris) thu hái tại VQG
Xuân Thủy
- Xác định hàm lượng polyphenol tổng số của thân và lá
- Thử hoạt tính kháng khuẩn với 4 chủng vi sinh vật: Escherichia coli, Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus, Salmonella typhimurium của dịch
keo chiết vỏ thân, lá bằng phương pháp ngâm trong methanol và của dịch keochiết thân, lá, quả, hạt bằng phương pháp chiết Soxhlet với dung môimethanol
- Đánh giá khả năng ức chế sinh trưởng rễ mầm cải củ của dịch keochiết vỏ thân, lá bằng phương pháp ngâm trong methanol và của dịch keochiết thân, lá, quả, hạt bằng phương pháp chiết Soxhlet với dung môimethanol
- Xác định khả năng quét gốc tự do DPPH của dịch keo chiết vỏ thân
bần chua bằng phương pháp ngâm trong methanol và chiết Soxhlet.
1.4 Vài nét về điều kiện tự nhiên của địa điểm thu mẫu
Mẫu nghiên cứu được thu tại VQG Xuân Thủy, Giao Thủy, Nam Định.Giao Thủy là một huyện ven biển thuộc tỉnh Nam Định, gồm 22 xã vàthị trấn, trong đó có 9 xã tiếp giáp với biển, với 32 km đường bờ biển nằmgiữa hai cửa sông là sông Hồng (cửa Bà Lạt) và sông Ninh Cơ (cửa sông sôngNinh Cơ); cách thành phố Nam Định khoảng 45 km về phía Nam, có diện tích
7100 ha Phía Đông giáp biển Đông Phía Tây giáp huyện Xuân Trường PhíaNam giáp huyện Hải Hậu Phía Bắc giáp huyện Tiền Hải, Thái Bình [56]
Trang 10Hình 1 Bản đồ khu vực nghiên cứu
Vũng lõi VQG Xuân Thủy bao gồm bãi trong cồn Ngạn, toàn bộ cồn
Lu và cồn Xanh.Vùng lõi có diện tích đất khi triều kiệt là 3100 ha, đất cồnngập nước là 4000 ha Bãi bồi của Giao Thủy có độ cao trung bình 0,5- 0,9 m,đặc biệt ở cồn Lu có nơi cao 1,2 – 2,5 m Vùng triều thấp dần từ Bắc xuốngNam và từ Đông sang Tây [56]
Theo Phan Nguyên Hồng và cộng sự thì khí hậu ở VQG Xuân Thủy cómột số đặc điểm sau:
+ Giao Thủy nằm trong khu vực nhiệt đới gió mùa, mùa đông lạnh,mùa hè mưa, thời kì khô từ hai đến ba tháng
+ Khí hậu phân thành hai mùa rõ rệt: Mùa mưa bắt đầu từ tháng 4, kếtthúc vào tháng 10 Mùa khô từ tháng 11 đến tháng 3 năm sau
+ Nhiệt độ trung bình năm là 24oC, nhiệt độ cao nhất trong mùa hè là40,3oC, nhiệt độ thấp nhất trong mùa đông là 6,8oC
+ Độ ẩm trung bình khoảng 84%, lượng mưa 1700-1800 mm/năm.+ Về thủy văn: vùng biển Giao Thủy chịu ảnh hưởng của chế độ thủytriều, nhật triều, có biên độ triều lớn 110-320 cm [9]
Trang 111.5 Tổng quan tình hình nghiên cứu
1.5.1 Giới thiệu về các hợp chất polyphenol thực vật và một số nghiên cứu
về hợp chất này
Phenol là những hợp chất thơm có nhóm hydroxyl đính trực tiếp vớinhân benzen, phân tử có nhiều nhóm hydroxyl đính trực tiếp với vòng benzengọi là polyhydroxylphenol (monomer), nhiều monomer gắn với nhau đượcgọi là polymer [15]
Các hợp chất phenol rất đa dạng về cấu trúc, tùy theo cấu tạo mạchcacbon mà các hợp phenol được chia thành các nhóm sau: phenol đơn giản(C6), axit phenolic (C - C6) và (C3- C6), flavonoid (C6- C3- C6), lignin ((C6-C3))n và tanin [15]
+ Phenol đơn giản nhất (phân nhóm C6), các phenol đơn giản nhất baogồm: diphenol và triphenol
+ Flavonoid (phân nhóm C6- C3- C6) Đây là phân nhóm đa dạng vàphong phú trong thực vật gồm catechine và gallocatechine
Hình 2 Cấu trúc phân tử của catechine và gallocatechine
+ Flavon: Là glucoside làm cho rau quả và hoa có màu vàng Khi thủyphân giải phóng ra glucon màu vàng Các glucoside nhóm flavon rất nhiềunhưng thường gặp hơn cả là quercetin và kamepherol Quercetin có trong vỏ sồi,
lá chè, táo, nho, thuốc lá Kamepherol có trong lá chè, hoa hồng, hoa dẻ [22]
Trang 12Hình 3 Cấu trúc phân tử của quercetin và kaempferol
Hơn 8000 cấu trúc polyphenol đã được tìm thấy, từ các phân tử đơngiản như các acid phenolic đến từ các chất polymer như tannin Các hợp chấtpolyphenol thực vật có tác dụng chống lại tia cực tím hoặc ngăn chặn các tácnhân gây bệnh, kí sinh trùng và động vật ăn thịt cũng như làm tăng các màusắc của thực vật, các hợp chất này còn là vật liệu góp phần vào độ bền chứccủa thực vật và sự thấm của thành tế bào đối với nước và khí, là hợp chất tínhiệu cho sự cộng sinh giữa thực vật và vi khuẩn nốt sần Đối với các thựcphẩm, các hợp chất phenol là những chất hoạt động giữ vai trò chủ đạo quyếtđịnh hương vị của nhiều loại sản phẩm có nguồn gốc từ thực vật Chúng có ởkhắp các bộ phận của cây Đối với sức khỏe con người, các hợp chất phenol
có khả năng chống oxy hóa cao, chống viêm, chống dị ứng và khả năng khángkhuẩn Theo các nghiên cứu dịch tễ học, hấp thụ các hợp chất phenolic sẽgiảm được nguy cơ mắc các bệnh tim mạch, ngăn ngừa được bệnh ung thư.Hơn nữa các polyphenol còn có các tác dụng sinh lí học cụ thể trong việcngăn ngừa và điều trị bệnh [3]
Hiện nay, trên thế giới và tại Việt Nam đã dành nhiều thời gian nghiêncứu về các hợp chất polyphenol có nguồn gốc tự nhiên, từ nhiều nguồnnguyên liệu khác nhau như trà xanh, vỏ vải thiều, lá ổi, lá vối, lá chuối và quảsim bằng những phương pháp khác nhau Các sàng lọc sắc kí lớp mỏng sơ bộ
đã xác định được nhóm hợp chất phenolic trong các phần chiết từ các loài
cây tống quản sủi (Alnus nepalensis, họ Betulaceae), cáng lò (Betula alnoides, họ Betulaceae) và chẹo bông (Engelhardia spicata, họ
Trang 13Lê Tự Hải và cộng sự (2011) đã nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng tớiquá trình tách chiết polyphenol nhóm tannin từ vỏ keo lá tràm như kích thướcnguyên liệu, tỉ lệ dung môi – nguyên liệu Kết quả nghiên cứu cho thấy vỏkeo lá tràm có chứa hai loại polyphenol nhóm tannin, điều kiện tối ưu cho quátrình chiết tách tannin từ vỏ keo lá tràm là: kích thước nguyên liệu dạng bột, tỉ
lệ nước : ethanol (v/v) là 50:50 tại nhiệt độ 80oC, thời gian tối ưu là 75 phút, tỉ
lệ rắn/ lỏng là 2 g/ 70 ml Với điều kiện này thì lượng tannin tách được là21,6% so với nguyên liệu vỏ khô [4] Việc nghiên cứu và chiết xuất thànhphần polyphenol trong thực vật được thực hiện bằng nhiều phương pháp nhưchiết xuất hồi lưu, chiết xuất hỗ trợ siêu âm, chiết xuất ngấm kiệt
Theo Phạm Thành Quân và cộng sự [17] đã sử dụng dung môi tríchtheo hai phương pháp trích thông thường và phương pháp trích có sự hỗ trợ visóng để trích polyphenol lá trà xanh Có một số yếu tố ảnh hưởng như dungmôi, tỉ lệ nguyên liệu với dung môi, pH, nhiệt độ trích, thời gian trích vàngâm của hai phương pháp được khảo sát Ở cùng điều kiện khảo sát, phươngpháp trích với sự hỗ trợ vi sóng cho hiệu suất cao hơn với thời gian ngắn hơn(82,6% trong 360 giây), phương pháp trích ly thông thường (62,1% trong 180phút) Dịch trích trà xanh theo phương pháp trích có hỗ trợ vi sóng có hàmlượng polyphenol là 36% cao hơn phương pháp thông thường
Phạm Thị Ngọc Luyến (2009) nghiên cứu trên quả sim thấy hàm lượngpolyphenol cao, trong quá trình chín của quả sim có sự biến đổi của hợp chấtphenol và khả năng kháng oxy hóa [14]
Qua khảo sát 5 giống trà tại vùng Bảo Lộc, Lâm Đồng, Nguyễn Hải Hà(2006) đã lựa chọn được giống trà HAT có hàm lượng EGCG và catechinetổng cao làm nguyên liệu trích ly Tác giả đã xác định các thông số cho quytrình trích ly polyphenol từ trà bằng phương pháp trích ly có hỗ trợ vi sóngquy mô phòng thí nghiệm Qua thăm dò tinh chế sơ bộ dịch trích, tác giả kếtluận hàm lượng EGCG 35%, catechine tổng 70%, polyphenol tổng 95% Một
số quy trình tách chiết hợp chất polyphenol đã được nghiên cứu Nguyễn Thị
Trang 14Quỳnh Hoa (2012) đã xây dựng được quy trình tách chiết các hợp chấtphenolic phần chiết etyl acetate (EG3), hiệu suất chiết 0,5% so với lượngnguyên liệu khô và phần chiết nước ( EG4) từ lá cây chẹo lá phong [6].
1.5.2 Tình hình nghiên cứu hoạt tính sinh học của thực vật rừng ngập mặn
1.5.2.1 Giá trị dược liệu và đặc tính kháng vi sinh vật của cây rừng ngập mặn
Một số cây rừng ngập mặn có chứa chất độc, các chất có hoạt tính sinhhọc như kháng nấm, kháng khuẩn, khả năng diệt sâu, các loại động vật ănthực vật và diệt côn trùng Chiết xuất từ thực vật rừng ngập mặn khác nhau thì
có đặc tính dược liệu khác nhau
Các chất chiết xuất từ lá của cây vẹt trụ (Bruguiera cylindrica) và vỏ cây đước bộp (Rhizophora mucronata) cho thấy hoạt động kháng virus chống
lại bệnh Newcastle, đậu mùa và các bệnh viêm gan B virus [24]
Natarajan Arivuselvan và cộng sự đã nghiên cứu hoạt tính kháng khuẩn
của lá và vỏ của cây từ bi (Pemphis acidula) và cây dà quánh (Ceriops tagal).
Các tác giả phát hiện dịch chiết từ hai loài này, đặc biệt là cây từ bi có khảnăng ức chế mạnh đối với các chủng vi khuẩn được kiểm tra [26]
Dịch chiết của cây cóc kèn (Derris trifoliata) cũng có hoạt tính kháng khuẩn mạnh đặc biệt là chống lại vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus [5].
V Bobbarala và cộng sự cũng nghiên cứu hoạt tính kháng khuẩn của
dịch chiết methanol của 50 loài thực vật khác nhau đối với Pseudomonas syringae Kết quả nghiên cứu của các tác giả này cho thấy 92% số loài có
hoạt tính kháng đối với vi khuẩn trên [29]
Các đặc tính kháng khuẩn của lá và vỏ cây mắm biển (Avicennia marina), cây mắm lưỡi đòng (A officinalis), cây vẹt đen (Bruguiera sexangula), cây giá (Exoecaria agallocha), cây cóc vàng (Lumnitzera racemosa) và cây đước đôi (Rhizophora apiculata) kháng đối với các vi khuẩn gây bệnh kháng thuốc kháng sinh, Proteus sp và Staphylococcus aureus [24].
Trang 15Đặc tính chữa bệnh từ các cây thuộc chi Đước (Rhizophora) được cho
là phổ biến trong y học dân gian Các chất chiết xuất từ rễ, lá và thân câyđước có tính chất ức chế, ảnh hưởng đến sự phát triển của các sinh vật gâybệnh khác nhau ở người Trong số này có vi khuẩn, nấm và virus Hợp chấtpolysaccharide chiết xuất từ các lá đước (được xem như là RAP) ức chế cácchủng HIV-1 hoặc HIV-2 hoặc SIV trong nuôi cấy tế bào và hệ thống phântích khác nhau Theo báo cáo này, chiết xuất RAP ngăn chặn sự biểu hiện củakháng nguyên HIV-1 trong tế bào MT-4 và hủy bỏ sản xuất kháng nguyênHIV-1 p24 trong tế bào đơn nhân máu ngoại vi (PBMC); RAP cũng làm giảmsản xuất của mRNA virus khi được bổ sung trước khi virus hấp thụ Nhữngkết quả cho thấy RAP có thể ức chế virus AIDS trong giai đoạn đầu của chu
kì cuộc sống của nó Alarcon-Aguilara và cộng sự (1998) báo cáo rằng chiết
xuất của đước Rhizophora mangle chống bệnh tiểu đường và khả năng chống
tăng đường huyết [43]
Ở cây ô rô (Acanthus motanus), Charles Okoli và cộng sự (2008) đã
khảo sát về hoạt tính kháng khuẩn, kháng và miễn dịch đối với mụn nhọt Kếtquả nghiên cứu này cho thấy dịch chiết ức chế vừa phải sự sinh trưởng củacác vi sinh vật thử nghiệm và ức chế 57% phù nề cấp tính ở tai chuột [40].M.J Moshi và cộng sự (2010) đã nghiên cứu về hoạt tính kháng vi sinh vật
và gây độc cho tôm của dịch chiết rễ Acanthus pubescens Kết quả nghiên
cứu của nhóm tác giả này cho thấy dịch chiết có hoạt tính kháng khuẩn và gây
độc với tôm [38] Về hoạt tính kháng vi sinh vật của cây ô rô (Acanthus ilicifolius), V Boddarala và cộng sự (2009) đã nghiên cứu hoạt tính này của dịch chiết bằng các dung môi khác nhau đối với nấm gây bệnh Aspergillus niger và đã chỉ ra rằng so với dịch chiết từ các loại thực vật khác thì hoạt tính
kháng nấm của dịch chiết từ lá ô rô với methanol thuộc nhóm trung bình [29]
Các nghiên cứu của Kathiresan và Thangam cho thấy chất chiết xuất từ
cây ngập mặn giết chết ấu trùng của muỗi Anopheles stephens, Aedes aegypti, Culex tritaeniorhynchu và Culex quinquefasciatus Một hợp chất giống như
Trang 16pyrethrin trong rễ trụ của cây đước đôi (Rhizophora apiculata) cho thấy hoạt
tính diệt ấu trùng muỗi mạnh Khói khí đốt các chất chiết xuất có khả năng xua
đuổi và giết chết cả hai loài Aedes aegypti, Culex quinquefasciatus và chiết xuất áp dụng trực tiếp trên da người đẩy lùi Aedes aegypti trưởng thành [48].
Milon và cộng sự đã nghiên cứu về hoạt tính kháng khuẩn của vỏ cây
bần không cánh (Sonneratia apetala) [37] Nghiên cứu này cho thấy hầu hết
các dịch chiết của cây bần không cánh đều có hoạt tính sinh học chống oxihóa, gây độc tế bào và kháng vi sinh vật Không chỉ thế, V Boddarala vàcộng sự cũng đã nghiên cứu về hoạt tính kháng vi sinh vật của cây bần khôngcánh [30] Nghiên cứu này dùng 17 vi sinh vật kiểm định Kết quả nghiên cứucủa các tác giả cho thấy dịch chiết hexan, chloroform, methanol của các phầnkhác nhau của cây bần đều có hoạt tính kháng khuẩn và kháng nấm trong đódịch chiết chloroform và methanol có hoạt tính mạnh hơn dịch chiết hexan
Gần đây, nhiều chất hóa học thực vật có hoạt tính sinh học và hoạt tính
dược lí đã được phân lập từ thực vật rừng ngập mặn Ví dụ, Bruguierols A, B
& C đã được phân lập từ cây vẹt dù (Bruguiera gymnorrhiza) ngăn chặn sự
tăng trưởng của cả vi khuẩn Gram dương và Gram âm, bao gồm cảmycobacteria và sức đề kháng tại nồng độ 12,5 mg/ml (Han et al, 2004)
FAME (Fatty Acid Methyl Ester) của lá cây dây mủ (Finlaysonia abovata) và cây giá (Excoecaria agallocha) có hoạt tính kháng đối với Micrococus sp., Aeromonas hydrophilla, E.coli, Vibrio alginolyticus, Pseudomonas aeroginosa, Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis, B Pumilus và Ebsiella pneumoniae [25].
Các cây rừng ngập mặn cũng được nhân dân địa phương sử dụng đểchữa bệnh theo dân gian, hoặc những cây có nguồn gốc từ rừng ngập mặn còn
được sử dụng cho các rối loạn về da, ví dụ như cây cóc vàng (Lumnitzera racemosa) Các báo cáo còn cho thấy tác dụng điều trị các loại bệnh như nhức
đầu, nhọt, viêm loét và tiêu chảy [45]
Trang 171.5.2.2 Hoạt tính ức chế sinh trưởng thực vật
Nghiên cứu về hoạt tính ức chế sinh trưởng của các hợp chất từ câyngập mặn đến nay còn rất ít Ở Bangladesh, A.F.M Shahi-UD-Daula và cộng
sự (2009) đã tiến hành khảo sát thành phần hóa học, hoạt tính ức chế sinh
trưởng thực vật của cây xu ổi (Xylocapus granatum) Hoạt tính ức chế sinh trưởng được thử đối với cây lúa mì (Triticum aestivum), kết quả cho thấy dịch
chiết methanol sơ cấp thể hiện tác dụng ức chế sinh trưởng mạnh hơn dịchchiết methanol thứ cấp Cả hai chiết xuất methanol có tác dụng ức chế sinhtrưởng rễ còn nhiều hơn sinh trưởng chồi cây Loại bỏ các hợp chất khôngphân cực (bằng n-hexane và chloroform) từ dịch methanol sơ cấp nhận thấyhoạt tính ức chế trên cả rễ con và sinh trưởng chồi đều giảm, gợi ý rằng cáchợp chất không phân cực có thể chứa các yếu tố sinh trưởng [41, 46]
Ở Việt Nam, nghiên cứu về hoạt tính ức chế sinh trưởng thực vật chưađược quan tâm nhiều Đào Văn Tấn cùng cộng sự (2012) đã nghiên cứu vềhoạt tính ức chế sinh trưởng rễ cây cải củ của dịch chiết các bộ phận cây cóc
kèn (D.trifoliata) Kết quả nghiên cứu của nhóm tác giả này cho thấy dịch
chiết các bộ phận cây cóc kèn đều có khả năng ức chế sinh trưởng, trong đódịch chiết của hạt có khả năng ức chế mạnh nhất (25,7%) [20]
Năm 2013, Đào Văn Tấn và cộng sự [21] đã tiến hành kiểm tra hoạttính ức chế sinh trưởng rễ mầm cải củ của dịch chiết methanol từ các bộ phận
khác nhau của cây ô rô (Acanthus ilicifolius) Các tác giả đánh giá các dịch
chiết với methanol của các bộ phận ô rô đều có khả năng ức chế sinh trưởng
rễ mầm hạt cải củ, từ 65-72% tùy từng bộ phận Các tác giả Hoàng Thị
Lá, Đào Văn Tấn, Đào Thị Sen (2013) khi khảo sát một số hoạt tính sinh học
của dịch chiết methanol cây sài hồ nam (Pluchea pteropoda) thu thập từ
Vườn Quốc gia Xuân Thủy, Nam Định đã đưa ra kết luận dịch chiết methanol
từ các bộ phận của cây hồ sài nam đều ức chế mạnh sự sinh trưởng rễ mầmhạt cải củ với phần trăm ức chế cao nhất từ dịch chiết của hoa ở cây mẫu(72,87%) [12]
Trang 181.5.2.3 Hoạt tính chống oxy hóa
Gần đây, đã có sự quan tâm nghiên cứu về hoạt tính chống oxy hóa củacây ngập mặn Ở Ấn Độ, Suganthy và cộng sự, (2009) đã nghiên cứu về hoạttính chống oxy hóa các chiết xuất methanol từ lá của 8 loài cây ngập mặn.Các đặc tính chống oxy hóa của các chất chiết xuất methanol từ lá được đánh
giá trong điều kiện invitro bằng cách sử dụng các phương pháp kiểm tra chất
chống oxy hóa khác nhau, bao gồm cả DPPH, oxide nitric, hydrogenperoxide, quét gốc tự do hydroxyl, làm giảm ion sắt và ức chế sự peroxy lipid
Trong số 8 thực vật ngập mặn khảo sát, cây đước bộp (Rhizophora mucronata) có hoạt tính chống oxy hóa cao nhất [51].
Ngoài ra, D Banerjee và cộng sự (2008) đã nghiên cứu về hoạt tínhchống oxy hóa của một số cây thuộc rừng ngập mặn ở Sundarbans, kết quảnghiên cứu của họ cho thấy tất cả 10 loài thực vật nghiên cứu đều có hoạt tínhchống oxy hóa mạnh [27]
J.M Beula và cộng sự (2012) cũng nghiên cứu về chống oxy hóa củacác loài thực vật ngập mặn phía nam bờ biển phía đông Ấn Độ [28] Các tácgiả này đã đưa ra dẫn liệu về hoạt tính chống oxy hóa, với giá trị IC50 cao của
4 loài thực vật nghiên cứu
R Shanmugapriya cùng cộng sự (2012) cũng nghiên cứu về hoạt tính
chống oxy hóa của cây mắm biển (Avicennia marina) và cây mắm đen (Avicennia officinalis) Kết quả nghiên cứu của các tác giả này cho thấy cả hai
loài này đều có khả năng chống oxy hóa cao [47]
Ở Trung Quốc, S.D Wei và cộng sự (2010) đã nghiên cứu về hoạt tínhchống oxy hóa của chiết xuất acetone 70% từ trụ mầm của cây trang
(Kandelia candel) và kiểm tra hoạt tính chống oxy hóa các phần phân đoạn
ete dầu khí (PF), ethyl acetate, nước bằng phương pháp DPPH và FRAP Kếtquả nghiên cứu của các tác giả cho thấy rằng tất cả các phân đoạn đều cóhoạt động chống oxy hóa mạnh và có tương quan tuyến tính giữa nồng độ
Trang 19phenolic tổng số và khả năng giảm ion sắt hoặc hoạt động quyét gốc tự do củachiết xuất và các phân đoạn [53].
Hoạt tính chống oxy hóa của các cây thuộc chi Bần (Sonneratia) cũng
được một số nhà khoa học quan tâm nghiên cứu M.A Milon và cộng sự(2012) đã nghiên cứu về hoạt tính chống oxy hóa của vỏ cây bần trắng
(Sonneratia alba) và tác giả này đã chỉ ra rằng dịch chiết của vỏ cây với các
dung môi chloroform và methanol đều cho hoạt tính rất mạnh, dịch chiết vớidung môi carbon tetrachloride cũng cho hoạt tính khá mạnh [38]
1.5.3 Tổng quan về đối tượng nghiên cứu
Hình 4 Cây bần chua (S caseolaris) tại VQG Xuân Thủy
Cây bần chua (Sonneratia caseolaris) thuộc họ Bần (Sonneratiaceae).
Đây là loài cây được trồng nhiều ở ven các con sông, cửa biển, trên các bãibồi và là một quần thể không thể thiếu của rừng ngập mặn ven biển nước ta.Bần chua thuộc loài thân gỗ vừa, có nhiều cành Cây cao 10-15 m, có khi caotới 25 m Cành non màu đỏ, 4 cạnh, có đốt phình to Gỗ xốp, bở, vỏ thânchứa nhiều tanin Rễ gốc to, khỏe, mọc sâu trong đất bùn Từ rễ mọc ra nhiều
rễ thở thành từng khóm quanh gốc Lá đơn, mọc đối, dày, giòn, hơi mọngnước, hình bầu dục hoặc trái xoan ngược hay trái xoan thuôn, thon hẹp thành
Trang 20cuống ở góc, cụt hay tròn ở chóp, dài 5-10 cm, rộng 35-45 mm Cuống và mộtphần gân chính màu đỏ, gân giữa nổi rõ ở cả 2 mặt, cuống dài 0,5 - 1,5 cm.Cây bần chua có cụm hoa ở đầu cành, có 2-3 hoa, rộng 5 cm, có cuống hoangắn, đài hợp ở gốc, có 6 thùy dày và dai, mặt ngoài màu lục, mặt trong màutím hồng, cánh tràng 6, màu trắng đục, hình dải, thuôn về hai đầu Nhị hoa cóchỉ hình sợi, bao phấn hình thận, bầu hình cầu dẹt, vòi dài, đầu hơi tròn Quảmọng hơi nạc, khi còn non cứng thì giòn, khi chín thì quả mọng, thịt quảmềm, ruột chứa nhiều hạt Quả có đường kính 5-10 cm, cao 2-3 cm, gốc cóthùy đài xòe ra Hạt nhiều, dẹt [7].
Nhiều tác giả đã nghiên cứu đặc điểm hình thái của bần chua làm cơ sở
để phân loại Có thể liệt kê một số tác giả: Toble (1923), Grant (1938), P.B.Tomlison (1999) [52] Các tác giả đều thống nhất mô tả cây bần chua là loàicây gỗ lớn, có thể cao tới 15 m, phân cành rộng
M Gurke và cộng sự (1897), E.J Bailaud (1904), D.A Kribsvà cộng
sự (1950), A.L Howard (1951) [44] đã nghiên cứu về gỗ cũng như vỏ và cấutạo giải phẫu của một số loài cây ngập mặn trong đó có bần chua J.V.Chapman (1975) [31] đã mô tả kĩ đặc điểm giải phẫu bần chua trong cuốn
“Thực vật rừng ngập mặn”
N.A Siddiqui và cộng sự (1993) (H.C Đãng, 2000 dẫn) [2] nghiên cứuđưa ra các kĩ thuật thu hái, chọn, tách, bảo quản hạt giống và kĩ thuật ươm bầnchua
Trên thế giới có một số nghiên cứu về thành phần hóa học một số chấttrong cây bần chua, nhưng chưa nhiều và chưa thực sự rõ ràng Các tác giảBusse, W (1898), Buguinot, A (1918), Jumelle, H (1921), Anon (1935), KhanA.H và cộng sự, (1956) đã nghiên cứu về hàm lượng tanin trong các cây ngậpmặn trong đó có cây bần chua (theo Rollet, 1981) [42] Một số tác giả khác đãnghiên cứu hàm lượng một số chất hữu cơ Phần lớn các nghiên cứu này tậptrung vào những chất sử dụng để làm thuốc hoặc cho công nghiệp
Trang 21Fumio Kawamura (2011) đã phân tích cấu tạo hóa học của vỏ thân- gỗcủa cây bần chua, tổng thể 32 hợp chất từ vỏ cây và 28 hợp chất từ gỗ đãđược phát hiện Vỏ thân và gỗ chứa archin (emodin), archinin (chrysophanicacid) Vỏ thân chứa nhiều tanin (10-20%) có thể dùng thuộc da Trong vỏ thân
có chất emodin và acid chrysophanic N.A Siddiqui và cộng sự (1993) nghiêncứu đưa ra các kĩ thuật thu hái, chọn, tách, bảo quản hạt giống và kĩ thuật ươmbần chua, có thể làm các chất màu trong thực phẩm và thuốc thô (H.C Đãng,
2000 dẫn) [2] Gỗ bần xốp, tỉ lệ bột giấy thu hồi khoảng 52,7% (trong đó có8,5% lignin, 17,6% pentosan có màu nâu) Ngoài ra, trong gỗ bần có hai chấtarchin và archinin có thể khai thác làm chất màu thực phẩm [56]
Trước đây, các acid béo, các hydrocacbon, steroid, pectin và đường đãđược phân lập từ bần chua nhờ nghiên cứu của Hog và Gillan, (1984) Trongnhững năm gần đây Sadhu et al (2006) đã phân lập và xác định hai chấtflavonoid luteolin và luteotin 7-O-β-glucosidase từ lá cây bần chua và thửnghiệm hoạt động chống oxy hóa của nó bằng cách sử dụng DPPH triệt đểhiệu lực quét gốc tự do trên một sắc kí bản mỏng Cả hai hợp chất này tìmđược thấy có hoạt động chống oxy hóa Minqing et al (2009) đã tách được 24hợp chất steroid trong đó có 3 flavonoid và 4 dẫn xuất benzene carboxylic từthân và cành cây bần chua
Ở Việt Nam, các nghiên cứu trên đối tượng bần chua tập trung vào cấutạo giải phẫu, sinh thái học, phân bố, phân loại, sinh trưởng, ươm giống (Phạm Hoàng Hộ, 2000; Nguyễn Hoàng Trí, (1996), Phan Nguyên Hồng(1970), Nguyễn Khoa Lân (1980), Hoàng Thị Sản (1984), Ngô Đình Lộc,Nguyễn Thị Ngọc Châm (1999), Đào Văn Tấn (2002) [19]
Trong khi đó, các nghiên cứu về các thành phần hóa học trong cây cũngnhư hoạt tính sinh học của các hợp chất được chiết xuất từ cây bần chua chưanhiều Các tác giả Lê Thanh Phước và Từ Minh Tỏ, trường Đại học Cần Thơ,
đã phân lập và xác định cấu trúc hóa học các hợp chất của rễ loài cây nàyđược thu tại huyện Trà Ôn, tỉnh Vĩnh Long Từ dịch chiết petroleum, bằng
Trang 22phương pháp phổ nghiệm 1H-NMR, 13C-NMR, DEPT NMR đã phân lập vàxác định cấu trúc của hai hợp chất: lupeol (C30H50O) và betulinaldehide(C30H50O2) Hợp chất lupeol đã được phát hiện trên cây bần chua tại một sốvùng trên thế giới Hợp chất betulinaldehide lần đầu được phân lập trên câynày [16].
Đến nay, theo hiểu biết của chúng tôi, chưa có báo cáo nào về đánh giáhàm lượng polyphenol tổng số cũng như các hoạt tính chống oxy hóa, hoạttính kháng khuẩn, hoạt tính ức chế sinh trưởng thực vật của các hợp chất từcây bần chua ở Việt Nam
Trang 23Phần II ĐỐI TƯỢNG, ĐỊA ĐIỂM, THỜI GIAN VÀ PHƯƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng nghiên cứu
2.1.1 Thực vật
- Thực vật nghiên cứu: các phần thân, lá, quả, hạt của cây bần chua
(Sonneraia caseolaris (L.) Engler).
- Để nghiên cứu khả năng ức chế sự sinh trưởng của dịch chiết các cây
nghiên cứu, chúng tôi dùng hạt cải củ nảy mầm Hạt cải củ (Raphanus sativus
L.) là những hạt hình trứng dẹt dài 2,5 – 4 mm, rộng 2 – 3 mm mặt ngoài màunâu đỏ hoặc xám nâu, có vị hơi cay (Võ Văn Chi, 1997) [1] Cải củ có ưu điểmlà: (1) Có nhiều ở Việt Nam, dễ kiếm, (2) Rễ trụ nên dễ đo, dễ so sánh giữa cácmẫu thử khác nhau và (3) Khả năng phát triển của rễ tương đối nhanh
2.1.2 Vi khuẩn
Các chủng vi sinh vật kiểm định: Escherichia coli ATCC 25922, Bacillus subtilis ATCC 6633, Staphylococcus aureus ATCC 13709, Salmonella typhimurium được cung cấp bởi Viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên.
2.2 Thời gian và địa điểm nghiên cứu
- Đề tài được tiến hành từ tháng 04 năm 2013 đến tháng 04 năm 2014
- Đề tài được thực hiện tại phòng thí nghiệm Hóa sinh – Tế bào học và
Di truyền học, khoa Sinh học, trường Đại học Sư phạm Hà Nội
2.3 Hóa chất, thiết bị
2.3.1 Hóa chất
Các hóa chất sử dụng tạo môi trường MPA cho nuôi cấy vi khuẩn ghitrong bảng 1
Trang 24Bảng 1 Môi trường nuôi cấy vi khuẩn MPA
Cao thịtPeptoneNaClThạchpH
5,0 (g/l)5,0 (g/l)5,0 (g/l)20,0 (g/l)7,0
Dung môi sử dụng cho chiết rút các chất là methanol có nguồn gốc TrungQuốc, dung môi sử dụng để hòa tan cao chiết là nước cất và methanol 10%
Các hóa chất sử dụng để xác định hàm lượng polyphenol tổng số: thuốcthử Folin-Ciocalteu, Na2CO3 7%, acid gallic
Các hóa chất sử dụng trong nghiên cứu hoạt tính chống oxy hóa: diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH), acid ascorbic
Đây là các thiết bị của bộ môn Hóa sinh – Tế bào học và bộ môn Ditruyền học, Khoa Sinh học, Trường Đại học Sư phạm Hà Nội
2.4 Phương pháp nghiên cứu
2.4.1 Phương pháp thu mẫu
Mẫu bần chua được thu hái từ VQG Xuân Thủy đem về rửa sạch vàphân loại bộ phận
Mẫu được thu làm hai đợt:
+ Đợt 1 vào tháng 06/2013;
+ Đợt 2 vào tháng 01/2014
Trang 25Bảo quản mẫu sau khi thu hái: mẫu thu về, rửa sạch bằng nước máy,phơi khô ở nhiệt độ phòng, sau đó đem phân tích ngay Nếu chưa phân tíchngay thì có thể bảo quản trong tủ lạnh 4-8oC hoặc sấy khô ở nhiệt độ 60oC.
Mỗi thí nghiệm được tiến hành 3 lần và kết quả lấy giá trị trung bình
2.4.2 Phương pháp chiết rút mẫu
Phương pháp ngâm trong methanol: Mẫu tươi sau khi để ráo nước đượccắt nhỏ, nghiền thành bột, đem ngâm trong dung môi methanol theo tỉ lệ 10 gmẫu trong 50 ml dung môi, ngâm trong 48 giờ ở nhiệt độ phòng Sau đó lọcmẫu bằng giấy lọc Thu dịch chiết lần 1 Lấy phần cặn ngâm tiếp trong 25 mldung môi trong 48 giờ Thu dịch chiết lần 2 Trộn đều dịch chiết lần 1 với lần
2 Dịch chiết này thu được sẽ được loại bỏ hết dung môi Dịch keo đặc sau khiloại bỏ hết dung môi được hòa tan trong nước cất theo tỉ lệ 6 ml dung môi banđầu: 5 ml nước cất vô trùng, sau đó đem li tâm ở 4000 vòng/phút được dịch
keo chiết Dịch keo này được chúng tôi kí hiệu là dung dịch keo chiết MH.
Phương pháp Soxhlet: 20 g mẫu đã sấy khô được nghiền thành bột, góitrong giấy lọc, ngâm trong dung môi methanol trong 24 giờ, sau đó đem chiếtbằng máy Soxhlet, chiết rút 10 lần, dịch chiết thu được cho bay hơi hết dungmôi thành keo chiết Sau đó, keo chiết một phần được hòa tan theo tỉ lệ 10 gmẫu khô sau khi chiết cho 6 ml nước cất vô trùng để sử dụng, một phần hòatan với methanol 10% theo tỉ lệ 0,1 g cao chiết cho 4 ml methanol 10% Hai
loại dịch chiết này được chúng tôi kí hiệu theo thứ tự là dung dịch keo chiết
MSH, MSM.
2.4.3 Phương pháp xác định hàm lượng polyphenol tổng số
Hàm lượng polyphenol tổng số của dịch keo chiết thu được được xácđịnh bằng phương pháp Folin-Ciocalteu theo Singleton et Rossi, 1965 [49].Tóm tắt như sau:
Cho 100 µl mẫu ở các nồng độ khác nhau vào giếng bản nhựa 96 giếng,thêm 10 µl thuốc thử Folin-Ciocalteu, sau 5 phút bổ sung 100 µl Na2CO3 7%,
để phản ứng trong bóng tối trong vòng 90 phút Các mẫu được đo trên máy
Trang 26quang phổ tử ngoại khả biến Biotek, Mĩ, ở bước sóng 750 nm Chất chuẩn sửdụng là acid gallic.
2.4.4 Phương pháp thử hoạt tính kháng khuẩn
Chuẩn bị vi khuẩn: Lấy một khuẩn lạc riêng biệt phát triển tốt trên ốnggiữ giống, cấy vào 20 ml MPA lỏng Bình nuôi lỏng được đặt trong máy lắcvới tốc độ 200 vòng/phút ở nhiệt độ 37oC nuôi trong một ngày Lấy 1 ml dịchhuyền phù vi khuẩn chuyển sang 30 ml dung dịch MPA lỏng để nuôi phục hồitrong vòng 2-4 giờ đạt OD 600 khoảng 0,8
Sử dụng phương pháp khuếch tán trên môi trường thạch [39] Trong đĩaPetri có môi trường thạch, trang đều 0,1 ml vi khuẩn kiểm định, sau đó đục 4 lỗthạch với đường kính 1,4 cm, nhỏ vào các lỗ thạch: (1) 0,1 ml H2O cất vô trùnghoặc 0,1 ml methanol 10% làm đối chứng âm, (2) 0,1 ml chloramfenicol 0,04%làm đối chứng dương, (3) 0,1 ml dịch thử nghiệm Sau đó để đĩa Petri trong tủlạnh khoảng 6-8 giờ rồi chuyển sang tủ ấm 32oC trong 24 giờ Xác định hoạt tính
ức chế vi sinh vật kiểm định bằng sự tạo vòng vô khuẩn xung quanh lỗ thạch.Hoạt tính ức chế vi sinh vật (D, mm) được xác định theo công thức:
D =D 1 –D 2
Trong đó:
D: khả năng ức chế vi sinh vật (mm)D1: đường kính vòng vô khuẩn (mm)D2: đường kính lỗ thạch (mm)
2.4.5 Phương pháp thử hoạt tính ức chế sinh trưởng thực vật
Hạt cải củ (Raphanus sativus L.) cho nảy mầm 24 giờ ở điều kiện nhiệt
độ ổn định (30oC) để tạo cây mầm Những cây mầm có rễ đồng đều nhauđược chọn để tiến hành thử nghiệm Chia cây mầm thành các lô thí nghiệm,mỗi lô có 10 cây mầm, có chiều dài tương tự nhau, trung bình là 0,8 cm Đầu
rễ của cây mầm được nhúng vào dịch keo chiết trong 1 giờ Sau đó, rửa cácđầu rễ mầm được xử lí với các dịch keo chiết bằng nước cất và tiếp tục nuôi
Trang 27thức thí nghiệm nhắc lại ba lần Cây mầm đối chứng thay dịch chiết bằngnước cất hoặc dung dịch chứa methanol 10% đối với mẫu hòa tan keo chiếtbằng methanol 10% (MSM) Khả năng ức chế sinh trưởng của rễ được tínhtheo công thức:
I%= (L C – L S ) x 100/L C
Trong đó:
I%: Phần trăm ức chế
LC : Độ dài trung bình (cm) của các rễ ở mẫu đối chứng
LS : Độ dài trung bình (cm) của các rễ ở mẫu thí nghiệm
2.4.6 Phương pháp thử hoạt tính chống oxy hóa
Định lượng hoạt tính chống oxy hóa theo phương pháp quét gốc tự doDPPH [23] Hoạt tính chống oxy hóa được đánh giá thông qua giá trị hấp thụánh sáng của dung dịch thí nghiệm so với đối chứng khi đọc trên máy quangphổ tử ngoại khả biến Biotek, Mĩ, ở bước sóng 517 nm
Acid ascorbic được sử dụng để làm chất chuẩn, nước cất được sử dụnglàm mẫu đối chứng Mẫu trắng sử dụng methanol thay cho DPPH 78,8 µg/ml.Dung dịch DPPH 78,8 µg/ml trong methanol được ủ với mẫu, chất chuẩn hoặcđối chứng theo tỉ lệ 18:2 trong tối ở nhiệt độ phòng trong thời gian 30 phút Thínghiệm được nhắc lại ba lần Các mẫu chống oxy hóa được đo trên máy quangphổ có đầu đọc 96 giếng của hãng Biotek, Mĩ, ở bước sóng 517 nm
Khả năng quét gốc tự do của các mẫu được xác định dựa vào giá trị quétgốc tự do SC% (Scavenging capacity) Giá trị SC% được tính theo công thức:
Trong đó:
ODsp giá trị hấp thụ quang của mẫu thí nghiệm với 20 µl mẫu
thử + 180 µl DPPH trong methanol;
ODct: giá trị hấp thụ quang của mẫu đối chứng với 20 µl nước
cất vô trùng + 180 µl DPPH trong methanol;
ODBl: giá trị hấp thụ quang của mẫu trắng (Blank) với 20 µl
mẫu thử + 180 µl methanol
Trang 28Chất chuẩn được thiết lập bởi 20 µl acid ascorbic + 180 µl DPPH trongmethanol Nồng độ acid ascorbic được thiết lập là 0,1; 0,2; 0,3; 0,4; 0,5 mM.
Nếu giá trị SC% >50% thì mẫu được coi là có biểu hiện hoạt tính và sẽđược chọn ra để thử nghiệm bước 2 để tìm giá trị IC50
Giá trị IC50 được xác định thông qua hàm hồi quy (theo hàmlogarithmic) dựa trên tương quan giữa nồng độ dịch chiết thô với khả năngquét gốc tự do Các dịch keo chiết được pha loãng 500, 1000, 2000, 4000,
8000 và 16000 lần
2.4.7 Phương pháp xử lí số liệu
Số liệu được phân tích trên phần mềm Excel 2007 và phần mềm SPSS
Trang 29Phần III KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1 Khối lượng khô các bộ phận của cây bần chua
Mẫu tươi sau khi thu hái về được rửa sạch, hong khô ở nhiệt độ phòng,sau đó cân và đem sấy ở 80oC trong 72h và xác định khối lượng mẫu sau khisấy Kết quả thu được thể hiện ở bảng 2
Bảng 2 Tỉ lệ khối lượng khô các bộ phận của cây bần chua (%)
Bộ phận Tỉ lệ khối lượng khô (%)
về hàm lượng vật chất khô trong các bộ phận khác nhau này sẽ là cơ sở quy đổiđơn vị tính trong thí nghiệm đánh giá hàm lượng polyphenol tổng số
Vỏ thân chứa gỗ, có lớp bần, phía bên ngoài là lớp tế bào chết bảo vệthân cây, phía bên trong là lớp vỏ lục và phần hệ thống mạch phát triển (mạch
gỗ và libe) [8] vì vậy khi sấy khô vỏ thân là bộ phận có tỷ lệ vật chất khô lớnnhất Lá bần dày, biểu bì có lớp cutincun, mô giậu phát triển ở cả 2 mặt lá, cónhiều tế bào mô cứng phân nhánh trong tầng mô xốp, mô xốp chứa nước Hệthống mô xốp trong lá cây thuộc chi Bần phát triển tùy điều kiện môi trườngsống, trong đó độ mặn tác động nhiều nhất [19] Quả bần bao gồm thịt quả vàhạt dẹt, quả mọng nước, thịt quả chủ yếu là các mô mềm và tích lũy nhiềunước ở giai đoạn già và chín Đặc điểm cấu trúc của lá và quả bần như vậy là
cơ sở giải thích cho tỉ lệ khối lượng khô chúng thấp hơn so với phần vỏ thân
3.2 Hàm lượng polyphenol tổng số
Để đánh giá hiệu quả chiết polyphenol tổng số của các phương phápchiết mẫu khác nhau, chúng tôi xác định hàm lượng polyphenol tổng số của
Trang 30keo chiết bằng Soxhlet và keo chiết bằng ngâm trong methanol; mặt khác để
so sánh sự phân bố polyphenol trong các bộ phận khác nhau của bần chua,
chúng tôi tiến hành xác định hàm lượng polyphenol của các dịch keo chiết từ
mẫu vỏ thân và lá cây bần chua Chất chuẩn sử dụng trong thí nghiệm xácđịnh polyphenol tổng số là acid gallic Mối tương quan giữa nồng độ acidgallic với khả năng hấp thụ ánh sáng ở bước sóng 750 nm được xác định với
R2 > 99, thể hiện trong hình 5 Hàm lượng polyphenol tổng số của các dịchchiết được trình bày ở bảng 3
Hình 5 Đường chuẩn acid gallic
Bảng 3 Hàm lượng polyphenol tổng số của các dung dịch keo khác nhau chiết từ thân và lá của cây bần chua được hòa tan bằng các dung môi
tự, đối với mẫu lá chiết bằng Soxhlet, dung môi hòa tan keo chiết là methanol
