I KIỂM SOÁT CÁC ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY 1 Kiểm soát nhiệt độ 1 1 Nhiệt độ tối ưu Mỗi vi sinh vật đều có một nhiệt độ tối ưu để phát triển mà tại đó chúng sinh trưởng và phát triển tốt nhất, ổn định nhất Đố[.]
I KIỂM SỐT CÁC ĐIỀU KIỆN NI CẤY Kiểm soát nhiệt độ 1.1 Nhiệt độ tối ưu Mỗi vi sinh vật có nhiệt độ tối ưu để phát triển mà chúng sinh trưởng phát triển tốt nhất, ổn định Đối với nhóm ưa nhiệt độ thấp (psychrophiles) nhiệt độ tối ưu cho tăng trưởng 20 oC Đối với nhóm chịu nhiệt trung bình (mesophiles) nhiệt độ tối ưu thường từ 20-45 oC Trong đó, nhiệt độ tối ưu cho nhóm chịu nhiệt (thermophiles) 45-60 oC Ngồi khoảng nhiệt độ đó, vi sinh vật bị hạn chế phát triển Trong nuôi cấy vi sinh vật công nghiệp, tùy vào đặc điểm sinh lý chủng sinh vật nuôi cấy lên men mà cần đảm bảo nhiệt độ tối ưu chúng Trong giai đoạn q trình ni cấy, nhiệt độ thay đổi Nhiệt độ lên men (đối với quy trình khuấy trộn ) sinh do: ● Nguồn gốc sinh học: nhiệt lượng sinh hoạt động của, đóng vai trị chủ yếu trình lên men ● Nguồn gốc vật lý: Nhiệt lượng sinh tác động lý học khuấy trộng hay nhiệt lượng từ khơng khí sục vào,…tuy nhiên nhiệt lượng không đáng kể Bảng Nhiệt độ tối ưu số Vi sinh vật Nhóm Nhiệt độ tối ưu Sinh trưởng tốt 150C hay Vi sinh vật đại diện Bacillus psychrophilus, Chịu thấp Có thể sinh trưởng 0-70C Chlamydomonas nivalis Listeria monocytogenes, lạnh(Psychrotroph) sinh trưởng tốt 20-300C, cịn Pseudomonas fluorescens Ưa lạnh(Psychrophiles) sinh trưởng khoảng 350C Escherichia coli, Neisseria, Ưa ấm(Mesophile) Sinh trưởng tốt 25-450C Có thể sinh trưởng nhiệt độ 550C Ưa nhiệt(Thermophile) cao hơn, nhiệt độ thích hợp thường 55 650C Gonorrhoeae, Trichomona vaginalis Bacillus stearothermophilus, Thermus aquaticus, Cyanidium caldarium, Chaetomium Ưa nhiệt cao Thích hợp phát triển nhiệt độ thermophile Sulfolobus, Pyrodictium, (Hyperthermophile) 80 khoảng 1130C Pyrococcus Tùy giai đoạn cụ thể trình lên men tùy vào nhiệt độ môi trường mà hoạt động kiểm sốt nhiệt độ ni cấy có khác Trong giai đoạn đầu, nhiệt lên men nhỏ, nhiệt độ môi trường thấp, cần gia nhiệt Trong giai đoạn tăng trưởng mạnh, nhiệt lên men nhiều, cần giải nhiệt Vd: Theo công nghệ sản xuất bia truyền thống, nấm men chìm thường lên men nhiệt độ từ – 15oC lên men thực điều kiện nhiệt độ từ 18 – 22oC 1.2 Biện pháp kiểm soát nhiệt độ lên men sản xuất Trong giai đoạn đầu cần gia nhiệt (dùng nước nóng) Trong giai đoạn tăng trưởng mạnh, nhiệt lên men nhiều, cần giải nhiệt (người ta thường dùng nước nhiệt độ thấp (5~270C) để giải nhiệt) Khả giải nhiệt phụ thuộc vào lưu lượng, nhiệt độ nước giải nhiệt diện tích tiếp xúc hai loại dịch Thiết bị trao đổi nhiệt dạng ống (coil, package) đặt nồi lên men dạng áo (jacket) đặt bên nồi lên men Một hệ thống điều khiển nhiệt độ bao gồm: - Thiết bị trao đổi nhiệt (heat exchanger), làm vật liệu có hệ số truyền nhiệt cao - Hệ thống làm lạnh nước giải nhiệt (cooling system) hệ thống gia nhiệt ( thường dùng điện trở đốt nóng – heater nước nóng – steam) - Bơm cung cấp nước giải nhiệt Bộ cảm biến nhiệt tự động (thermo sensor), điều khiển hệ thống van nhằm cho phép van đóng hay mở để kiểm sốt nhiệt độ ni cấy theo giá trị cài đặt Kiểm soát pH Vi sinh vật nhạy cảm với thay đổi pH mơi trường pH gây biến tính khơng thuận nghịch protein ảnh hưởng trực tiếp lên khả vận chuyển qua màng Do lên men sản xuất cần kiểm soát để đảm bảo pH sinh lí tế bào q trình phát triển sinh tổng hợp chất Tác nhân thường dùng để điều chỉnh pH trình lên men acid (H2SO4, HCl…) base (NaOH, KOH, NH3…) Yêu cầu chung tác nhân rẻ tiển, dễ hấp thụ, khơng làm thay đổi đáng kể thể tích dịch lên men, không làm tăng đáng kể áp suất thẩm thấu môi trường Trong lên men sản xuất qui mô công nghiệp, người ta thường sử dụng hệ thống kiểm soát pH tự động để điều chỉnh pH trình lên men Hình Hệ thống kiểm sốt pH Kiểm sốt hàm lượng oxy hịa tan 3.1 Vai trị Oxy Vi sinh vật hiếu khí sử dụng oxy để hô hấp : Carbon nguồn lượng + Nguồn nito + O2 + chất cần thiết khác Sinh khối + Sản phẩm + CO2 + H2O + Nhiệt Sự thiếu oxy thời phá vỡ trình trao đổi chất tế bào Đa số VSV sử dụng oxy môi trường lỏng lượng oxy hòa tan MT thường ít, q trình lên men cần bổ sung, thúc đẩy q trình hịa tan kiểm sốt nồng độ oxy mơi trường ni cấy ( bồn lên men) 3.2 Biện pháp kiểm soát Oxy lên men sản xuất Tỉ lệ oxy hòa tan từ phase khí vào phase lỏng tính tốn dựa phương trình sau: dCL/dt= KLa(C*-CL) Trong : - CL: nồng độ oxy hịa tan dung mơi lên men (mol/dm3) - dCL/dt: thay đổi nồng độ oxy khoảng thời gian Tốc độ hòa tan oxy (mol/dm3/h) - KL: hệ số hòa tan (cm/h) - a: diện tích bề mặt tiếp xúc chất lỏng (khí) thể tích chất lỏng (cm2/cm3) - C*: nồng độ oxy bão hịa ( mol/ dm3) Vơ khó khăn để đo lường K L a trình lên men, đó, hai thuật ngữ thường kết hợp thuật ngữ K La (the volumetric masstransfer coefficient) Nó dùng thước đo số thơng khí bồn lên men Chỉ số KLa lớn hơn, khả thơng khí hệ thống cao Giá trị K La phụ thuộc vào thiết kế điều kiện hoạt động bồn lên men chịu ảnh hưởng biến số tỷ lệ thơng khí, tỷ lệ khuấy trộn thiết kế cánh bơm (Impeller), biến số ảnh hưởng đến K L cách giảm vật cản vận chuyển ảnh hưởng đến “a” cách thay đổi số lượng, kích thước thời gian tồn bong bóng khí Rất thuận tiện để sử dụng K La thước đo hiệu suất bồn lên men khơng giống tốc độ hịa tan oxy khơng bị ảnh hưởng nồng độ oxy hòa tan Tuy nhiên tốc hòa tan oxy tiêu chí quan trọng lên men theo cơng thức bị ảnh hưởng K La nồng độ oxy hòa tan Nồng độ oxy hòa tan phản ánh cân việc cung cấp oxy hòa tan bồn lên men nhu cầu oxy sinh vật Nếu K La bồn lên men cố định mà nhu cầu oxy hòa tan sinh vật khơng đáp ứng, nồng độ oxy hịa tan giảm mức giới hạn.( Crit) Nếu KLa cố định đáp ứng dễ dàng nhu cầu sinh vật nồng độ oxy hịa tan lớn mức giới hạn, cao 70-80% mức bão hịa Do đó, KLa phải đạt nồng độ oxy tối ưu cho hình thành sản phẩm trì dung dịch suốt trình lên men Việc xác định KLa thực cần thiết để thiết lập hiệu thơng khí bồn lên men định lượng tác động biến số điều hành việc cung cấp oxy Giai đoạn oxy hòa tan theo dõi cách sử dụng đầu dò oxy hòa tan, ghi lại hoạt động oxy hịa tan hay sức căng oxy hòa tan phương trình mơ tả lượng truyền oxy dựa nồng độ oxy hòa tan Độ tan oxy bị ảnh hưởng chất hịa tan mơi trường lên men KLa chịu ảnh hưởng nhiều nhân tố : - Thành phần mật độ môi trường nuôi cấy: nhu cầu oxy tối ưu loại vi sinh vật ( nấm men vi khuẩn ) - Trong lên men nhu cầu oxy hòa tan phụ thuộc chủ yếu vào nồng độ sinh khối hoạt động hô hấp vi sinh vật 4 Kiểm soát tốc độ bổ sung môi trường dinh dưỡng Đối với nuôi cấy vi sinh vật, trì tính ổn định hàm lượng chất dinh dưỡng môi trường lên men vấn đề vô quan trọng, đặc biệt số chất giới hạn Trong môi trường nuôi cấy ban đầu nồng độ chất giới hạn mức phù hợp, không cao để hạn chế ảnh hưởng áp suất thẩm thấu lên VSV Việc bổ sung môi trường dinh dưỡng trình lên men cịn giúp tăng lượng sinh khối tham gia vào vào trình sinh tổng hợp sản phẩm, giúp kéo dài thời gian nuôi cấy tăng nồng độ sản phẩm Ngoài ra, giới hạn hình thành sản phẩm phụ giúp cải thiện hiệu suất sản xuất Tùy theo đặc điểm loại lên men có phương pháp nạp bổ sung nguyên liệu kiểm soát khác Tuy nhiên phải đảm bảo số yêu cầu sau: - Chỉ nạp bổ sung đủ theo nhu cầu sử dụng, không nên nạp nhiều dẫn đến thiếu Oxy cung cấp - Cũng khơng nên nạp thiếu ảnh hưởng đến tốc độ tăng trưởng sản xuất chủng Nồng độ gây ức chế số thành phần môi trường: Các thành phần môi trường thường phải nạp bổ sung vào q trình ni cấy: - Nguồn C: glucose, fructose, sucrose … - Nguồn N: NH3, Urea … Các phương pháp nạp bổ sung (thực điều kiện vô trùng): - Bổ sung liên tục: Dịch môi trường bổ sung nạp vào với tốc độ thích hợp theo nhu cầu dinh dưỡng vi sinh vật Tốc độ bổ sung cố định, tăng dần theo bước tăng dần theo hàm số mũ Có thể dùng dấu hiệu gián tiếp dựa sở hàm lượng oxygen hịa tan mơi trường ni cấy để điều chỉnh tốc độ bổ sung dinh dưỡng đáp ứng nhu cầu sử dụng vi sinh vật trì tốt cân hàm lượng chất suốt trình lên men Phương pháp bổ sung liên tục khó thực hiện, địi hỏi hệ thống thiết bị đại, nhân viên kỹ thuật phải có trình độ tay nghề cao - Bổ sung gián đoạn: Phương pháp đơn giản giản so với phương pháp bổ sung liên tục Việc nạp bổ sung thực số lần định q trình ni cấy Lượng bổ sung lần sau thường cao lần trước cao nhu cầu sử dụng vsv, nồng độ chất thay đổi đột ngột sau lần nạp liệu, gây sốc cho tế bào II TỐI ƯU HĨA QUI TRÌNH LÊN MEN SẢN XUẤT Rút ngắn pha Lag Khi cấy vi sinh vật vào môi trường mới, số lượng thường không tăng lên ngay, giai đoạn tiềm phát Trong giai đoạn này, tế bào chưa phân cắt thể tích khối lượng tăng lên rõ rệt có tăng thành phần tế bào Nguyên nhân tế bào trạng thái già, thiếu hụt ATP, cofactor cần thiết ribosome Thành phần môi trường không giống môi trường cũ tế bào cần thời gian định để tổng hợp enzyme nhằm sử dụng chất dinh dưỡng Các tế bào bị thương tổn cần thời gian để hồi phục Bất kỳ nguyên nhân kết tế bào phải tự trang bị lại thành phần mình, tái tạo AND bắt đầu tăng khối lượng Giai đoạn tiềm phát dài hay ngắn liên quan đến thân loại vi sinh vật tính chất mơi trường Nếu tính chất hóa học mơi trường sai khác nhiều so với mơi trường cũ giai đoạn tiềm phát kéo dài Ngược lại, cấy từ gian đoạn logarit vào mơi trường có thành phần tương tự giai đoạn tiềm phát rút ngắn lại Nếu cấy vi sinh vật từ giai đoạn tiềm phát hay từ giai đoạn tử vong giai đoạn tiềm phát kéo dài 2 Tăng tốc độ tăng trưởng đặc trưng Trong phương pháp lên men khác nhau, ta tăng cường tốc độ tăng trưởng đặc trưng µ để đạt giá trị µ max Đối với phương pháp lên men mẻ, log phage giàu dinh dưỡng µ đạt µ max Tốc độ tăng trưởng phụ thuộc lớn vào nguồn dinh dưỡng môi trường nuôi cấy thành phần sản phẩm hoạt động vi sinh vật tạo mơi trường Vì thế, phải cung cấp đủ lượng dinh dưỡng vào môi trường nuôi cấy để vi sinh vật tăng trưởng tốt Đối với phương pháp lên men liên tục, tốc độ tăng trưởng đặc trưng phụ thuộc vào độ pha loãng Nếu tốc độ sử dụng chất vi sinh vật nhỏ tốc độ nạp liệu cho tăng trưởng tế bào số đặc điểm sau xảy ra: tốc độ tăng trưởng tế bào nhỏ tốc độ pha loãng, tế bào bị chiết khỏi nồi lên men với tốc độ cao tốc độ tăng trưởng chúng, điều gây nên giảm mật độ tế bào nồi lên men Nồng độ chất nồi lên men tăng dần nồi lên men cịn tế bào để sử dụng Khi nồng độ chất cao hơn, tốc độ tăng trưởng vi sinh vật tăng lên cao tốc độ pha lỗng sinh khối tăng dần lên, trường hợp trạng thái ổn định thiết lập Đối với phương pháp lên men mẻ bổ sung (fed-batch) tốc độ tăng trưởng đặc trưng phụ thuộc vào độ pha lỗng Để nguồn dinh dưỡng thất thốt, lên men sản xuất phải thiết kế thể tích lên men đủ lớn, đồng thời phải rút trích sản phẩm lên men để không ức chế phát triển vi sinh vật Bổ sung chất Trong số loại lên men, người ta thường không bổ sung thêm chất vào đa số lên men theo mẻ, nhiên có số loại lên men để nâng cao suất người ta bổ sung chất vào trình lên men nhằm tận dụng tối đa khả sử dụng hoạt động vi sinh vật sử dụng tối đa lượng chất để nâng cao suất : Bổ sung từ từ chất dinh dưỡng làm tăng thể tích dịch ni cấy, phương pháp sử dụng cơng nghiệp sản xuất men bánh mì Bổ sung môi trường mới vào bioreactor đồng thời rút thể tích dịch ni cấy (khơng chứa tế bào) tương ứng, phương pháp sử dụng nuôi cấy tế bào động vật Ngoài bổ sung chất chất dinh dưỡng nguồn chất ban đầu, người ta cịn bổ sung thêm chất tác động khác tùy loại lên men sản phẩm người ta dựa vào tính chất hóa lý để chọn chất tác động khác để tối ưu hóa q trình lên men Giúp tăng cường khả tăng trưởng Giúp tăng cường khả sản xuất, tăng hiệu suất Ví dụ bổ sung biotin q trình ni cấy chủng sinh tổng hợp glutamic acid Giúp tăng cường tiết sản phẩm q trình sinh tổng hợp mơi trường nuôi cấy Ví dụ: Bổ sung betaine làm yếu cấu trúc màng, tăng cường tính thấm màng, giảm áp suất thẩm thấu môi trường nuôi cấy III PHÂN TÍCH RỦI RO VÀ CÁC BIỆN PHÁP KHẮC PHỤC Các rủi ro trình lên men sản xuất Q trình lên men khác nhiều quy mô, thời gian phức tạp chúng có liên quan đến mục đích quy trình lên men khác Trong quy trình lên men gặp số rủi ro sau: Rủi ro dụng cụ, thiết bị lên men nguồn nguyên liệu - Thiết kế hệ thống thiết bị không hợp lý, cấu trúc thiết bị không phù hợp, tạo nên “túi” làm cho việc vệ sinh khó khăn tạo điều kiện cho việc hình thành lớp cặn-vảy bám vào thành thiết bị gây trở ngại cho việc vệ sinh-khử trùng - Sử dụng dụng cụ, thiết bị chưa tiệt trùng kỹ, chứa mơi trường giàu dinh dưỡng cho VSV có hại sinh trưởng - Thiết bị bị rò rỉ gây nên tiếp xúc phần vô trùng khơng vơ trùng q trình lên men rị rỉ nồi lên men, đường ống, lọc khí, thiết bị gia-giải nhiệt - Các thiết bị cảm biến hiển thị thông số nhiệt độ khử trùng, thời gian khử trùng, áp suất khử trùng … khơng xác: giá trị thực tế nhỏ giá trị hiển thị Ví dụ trường hợp cài đặt nhiệt độ khử trùng hiển thị 12 oC thực tế 110oC Do nhiệt độ khử trùng không đạt yêu cầu nên thời gian khử trùng định không diệt hết chủng tạp nhiễm trước đưa vào hệ thống lên men Rủi ro nguyên liệu - Nguyên liệu (bao gồm nguồn nước), đặc biệt ngun liệu thơ có nguồn gốc tự nhiên chứa vi sinh vật tạp nhiễm với mật độ cao, có chủng chịu nhiệt, tạo bào tử chủng có kích thước tế bào nhỏ - Nguyên liệu không đảm bảo chất lượng (chứa nhiều cặn bả, tạp chất… làm nơi “ẩn náu” tốt cho vi sinh vật tránh tác động nhiệt khử trùng) + Nguyên liệu bị biến đổi trình bảo quản - Thất bại việc khử trùng chất lỏng khí xâm nhập vào bồn lên men: Nguyên liệu trùng nhiệt độ, phương pháp chưa phù hợp, thoặc thời gian ngắn không đủ đảm bảo an toàn Rủi ro chủng vi sinh vật lên men - Việc nuôi cấy chủng vi sinh vật lên men môi trường túy VSV sản xuất gây tổn hại đến quy trình lên men VSV gây nhiễm cạnh tranh với VSV sản xuất điều kiện môi trường bên bồn lên men Biện pháp khắc phục ► Đối với dụng cụ - Kiểm tra dụng cụ phịng thí nghiệm, dụng cụ phải đảm bảo vô trùng - Giữ vệ sinh phịng thí nghiệm, đặc biệt bàn thao tác tủ hút - Các thao tác phải đảm bảo vô trùng ► Đối với mối hàn bồn lên men đường ống dẫn nhập nguyên liệu - Kiểm tra rò rỉ bồn phụ tùng mối hàn, ống xoắn, nắp, đường dẫn khí từ vùng vơ trùng cách điều hịa áp suất thiết bị áp suất khơng khí 20psig dùng bàn chải chứa dung dịch xà phòng rà sốt khắp khớp nối, chỗ rị rỉ xuất bọt bong bóng lớn ► Đối với nguyên liệu - Lựa chọn nơi cung cấp uy tín - Khử trùng chung thành phần mơi trường sau thêm vào thành phần (được khử trùng riêng) lại (đường thành phần chứa nitơ thường khử trùng riêng) - Bảo quản nguyên liệu điều kiện cần thiết với loại nguyên liệu, thường xuyên kiểm tra định kì trước sử dụng để xử lí kịp thời - Khử trùng nhiệt độ cao gây phản ứng không mong muốn thành phần môi trường giảm sản lượng, giảm dinh dưỡng môi trường ảnh hưởng đến phát triển vi sinh vật nên khử trùng chung thành phần mơi trường sau thêm vào thành phần (được khử trùng riêng) lại (đường thành phần chứa nitơ thường khử trùng riêng) ► Đảm bảo điều kiện vô trùng bồn lên men - Kiểm tra thiết bị khử trùng, bao gồm nhiệt độ, áp suất vận hành Đảm bảo khơng khí khơng cịn bồn khử trùng - Kiểm tra rò rỉ đường ống Các chu kỳ khử trùng liên tục khiến đường ống trở nên lỏng lẻo gây tạp nhiễm - Đối với nguyên liệu khử trùng cần sử dụng số biện pháp khác sử dụng màng lọc khử trùng riêng trước thêm vào ► Đối với chủng vi sinh vật - Hạn chế vi sinh vật tạp nhiễm - Kiểm tra vệ sinh bồn lên men, hạn chế tác nhân nhiễm từ phịng thí nghiệm - Kiểm tra làm đốm, lỗ, ăn mịn cặn (khuẩn ty khơ, cặn mơi trường,v…v…) phần bồn bầu, vòi sục, mối nối, thang, chốt, v v - Kiểm tra hệ thống phá bọt kiểm tra xem chất phá bọt có vô trùng hay không - Kiểm tra chủng ban đầu có bị nhiễm vi sinh vật khác hay khơng, kiểm tra dụng cụ chuyển chủng, điều kiện thực hiện, môi trường nguồn nguyên liệu