Luận án Tiến sĩ Nghiên cứu đa dạng và sinh tổng hợp cyclooligomer depsipeptide của nấm ký sinh côn trùng tại Khu bảo tồn thiên nhiên Copia và Vườn Quốc gia Xuân Sơn

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI - - NGUYỄN THỊ THÙY VÂN NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG VÀ SINH TỔNG HỢP CYCLOOLIGOMER DEPSIPEPTIDE CỦA NẤM KÝ SINH CÔN TRÙNG TẠI KHU BẢO TỒN THIÊN NHIÊN COPIA VÀ VƯỜN QUỐC GIA XUÂN SƠN LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC HÀ NỘI BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI - - NGUYỄN THỊ THÙY VÂN NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG VÀ SINH TỔNG HỢP CYCLOOLIGOMER DEPSIPEPTIDE CỦA NẤM KÝ SINH CÔN TRÙNG TẠI KHU BẢO TỒN THIÊN NHIÊN COPIA VÀ VƯỜN QUỐC GIA XUÂN SƠN Chuyên ngành: Vi sinh vật học Mã số: 9.42.01.07 LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS TS DƯƠNG MINH LAM GS TS NGÔ SỸ HIỀN HÀ NỘI i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu thân Các kết công bố luận án trung thực, xác Tơi xin chịu trách nhiệm hồn tồn số liệu, nội dung trình bày luận án Tác giả luận án Nguyễn Thị Thùy Vân ii LỜI CẢM ƠN Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới: - Thầy PGS.TS Dương Minh Lam, người thầy kính mến ln tận tình hướng dẫn, dạy bảo, động viên tạo điều kiện thuận lợi để tơi hồn thành tốt cơng việc luận án - Thầy GS TS Ngô Sỹ Hiền, người thầy theo sát bên tôi, bảo tận tình có góp ý vơ quý báu trình nghiên cứu - Quý thầy cô môn Công nghệ sinh học - Vi sinh, TS Trần Thị Thúy, PGS TS Đoàn Văn Thược, TS Phan Duệ Thanh, ThS Tống Thị Mơ, CN Phạm Thị Hồng Hoa góp ý, hỗ trợ tinh thần suốt q trình tơi thực nghiên cứu - Q thầy PTN Hóa Hữu cơ, Khoa Hóa học - Trường Đại học Sư phạm Hà Nội; Viện Hóa học hợp chất thiên nhiên - Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam giúp nhiều việc thực luận án - GS TS Trương Xuân Lam giúp đỡ định loại mẫu côn trùng thu thập khu vực nghiên cứu - Phòng Sau đại học, Ban Chủ nhiệm Khoa Sinh - Đại học Sư phạm Hà Nội nhiệt tình giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi trình thực luận án - Ban Giám đốc Học viện Cảnh sát nhân dân, Lãnh đạo Khoa Kỹ thuật hình ln động viên tạo điều kiện thuận lợi cho tơi q trình học tập nghiên cứu - Gia đình nhỏ, đồng nghiệp, bạn bè yêu thương, động viên, tạo điều kiện tốt cho tơi hồn thành khóa học Tác giả luận án iii Nguyễn Thị Thùy Vân MỤC LỤC Trang phụ bìa LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii MỤC LỤC iii DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT .vi DANH MỤC BẢNG vii DANH MỤC HÌNH viii MỞ ĐẦU CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU NGHIÊN CỨU 1.1 Nấm nấm ký sinh côn trùng 1.1.1 Giới thiệu nấm 1.1.2 Nấm ký sinh côn trùng 1.2 Nấm ký sinh côn trùng sinh tổng hợp cyclooligomer depsipeptide .9 1.2.1 Cyclooligomer depsipeptide 1.2.2 Đa dạng nấm ký sinh côn trùng sinh tổng hợp cyclooligomer depsipeptide 18 1.2.3 Con đường sinh tổng hợp cyclooligomer depsipeptide nấm 24 1.3 Nhu cầu dinh dưỡng điều kiện nuôi cấy nấm ký sinh côn trùng sinh tổng hợp cyclooligomer depsipeptide 26 1.3.1 Lựa chọn môi trường nuôi cấy 26 1.3.2 Độ pH 28 1.3.3 Nguồn cacbon .29 1.3.4 Nguồn nitơ 30 1.4 Tách chiết, tinh nghiên cứu cấu trúc cyclooligomer depsipeptide từ nấm ký sinh côn trùng 31 1.4.1 Tách chiết 32 iv 1.4.2 Tinh 33 1.4.3 Nghiên cứu cấu trúc 34 1.5 Tình hình nghiên cứu giới Việt Nam 35 CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 42 2.1 Nguyên vật liệu đối tượng nghiên cứu 42 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 42 2.1.2 Hóa chất thiết bị 42 2.1.3 Môi trường 43 2.2 Phương pháp nghiên cứu .43 2.2.1 Phương pháp vi sinh vật học .43 2.2.2 Các phương pháp sinh học phân tử 49 2.2.3 Phương pháp tách chiết tinh cyclooligomer depsipeptide 52 2.2.4 Các phương pháp phân tích 55 2.2.5 Phương pháp toán học .56 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 57 3.1 Đa dạng nấm ký sinh côn trùng phân lập từ mẫu thu Khu bảo tồn thiên nhiên Copia Vườn quốc gia Xuân Sơn 57 3.1.1 Kết phân lập nghiên cứu đặc điểm nấm ký sinh côn trùng Khu bảo tồn thiên nhiên Copia Vườn quốc gia Xuân Sơn 57 3.1.2 Một số nhận xét đa dạng chủng nấm ký sinh côn trùng Khu bảo tồn thiên nhiên Copia Vườn quốc gia Xuân Sơn 85 3.2 Khả sinh tổng hợp cyclooligomer depsipeptide chủng nấm ký sinh côn trùng phân lập 87 3.3 Định loại chủng nấm CPA14V đặc điểm hình thái sinh học phân tử 91 3.3.1 Đặc điểm hình thái chủng nấm CPA14V 91 3.3.2 Định loại chủng nấm CPA14V phương pháp sinh học phân tử 93 3.4 Nghiên cứu môi trường điều kiện nuôi cấy sinh tổng hợp cyclooligomer depsipeptide chủng nấm C cateniannulata CPA14V 99 v 3.4.1 Lựa chọn môi trường lên men sinh tổng hợp cyclooligomer depsipeptide 99 3.4.2 Ảnh hưởng độ pH môi trường đến sinh trưởng khả sinh tổng hợp cyclooligomer depsipeptide chủng C cateniannulata CPA14V .103 3.4.3 Ảnh hưởng nguồn cacbon đến sinh trưởng khả sinh tổng hợp cyclooligomer depsipeptide chủng nấm C cateniannulata CPA14V .104 3.4.4 Ảnh hưởng nguồn nitơ đến sinh trưởng khả sinh tổng hợp cyclooligomer depsipeptide chủng nấm C cateniannulata CPA14V .106 3.5 Nghiên cứu tách chiết, tinh xác định cấu trúc cyclooligomer depsipeptide từ C cateniannulata CPA14V .108 3.5.1 Tách chiết tinh cyclooligomer depsipeptide từ C cateniannulata CPA14V quy mơ phịng thí nghiệm .108 3.5.2 Xác định cấu trúc hóa học cyclooligomer depsipeptide 114 3.6 Nghiên cứu khảo sát số hoạt tính sinh học cao chiết tổng, phân đoạn chất beauvericin chủng nấm C cateniannulata CPA14V 122 3.6.1 Đánh giá hoạt tính gây độc tế bào in vitro 122 3.6.2 Đánh giá hoạt tính chống oxi hóa 124 3.6.3 Đánh giá hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định 125 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .128 DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN 130 TÀI LIỆU THAM KHẢO .131 PHỤ LỤC I vi DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT ADN: Acid deoxyribonucleotide ARN: Acid ribonucleotide CDW: (Cell dry weight): Sinh khối khô COD: Cyclooligomer depsipeptide CzD: Môi trường Czapek – Dox EDTA: Ethylendiamin Tetra Acetic Acid FDM: Môi trường xác định Fusarium HPLC: (High Performance Liquid Chromatography): Sắc kí lỏng hiệu cao áp IC50: (Inhibitory Concentration): Nồng độ ức chế 50% KBTTN: Khu bảo tồn thiên nhiên MIC: (Minimum Inhibitory Concentration): Nồng độ ức chế tối thiểu MM: Mơi trường khống tối thiểu NCBI: National Center for Biotechnology Information NMR: (Nuclear Magnetic Resonance): Quang phổ cộng hưởng từ hạt nhân NRPSs Nonribosomal peptide synthetases PBG: Môi trường dịch chiết khoai tây TLC: (Thin Layer Chromatography): Sắc kí mỏng TSB: Trypcase Soya Broth SBR: Mơi trường Sabouraud SDB: Sabouraud Dextrose Broth UV: (Untraviolet and Vissible Spectra): Tia tử ngoại VQG: Vườn quốc gia XXXV XXXVI XXXVII XXXVIII XXXIX XL XLI XLII XLIII XLIV XLV XLVI XLVII XLVIII XLIX