Nghiên cứu điều chế alginate khối lượng phân tử thấp dùng làm thực phẩm chức năng hỗ trợ phòng chống đông máu

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG NGUYỄN VĂN THÀNH NGHIÊN CỨU ĐIỀU CHẾ ALGINATE KHỐI LƯỢNG PHÂN TỬ THẤP DÙNG LÀM THỰC PHẨM CHỨC NĂNG HỖ TRỢ PHỊNG CHỐNG ĐƠNG MÁU LUẬN ÁN TIẾN SĨ KHÁNH HÒA - 2019 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG NGUYỄN VĂN THÀNH NGHIÊN CỨU ĐIỀU CHẾ ALGINATE KHỐI LƯỢNG PHÂN TỬ THẤP DÙNG LÀM THỰC PHẨM CHỨC NĂNG HỖ TRỢ PHỊNG CHỐNG ĐƠNG MÁU Chuyên ngành Mã số : : Công nghệ chế biến thủy sản 9540105 LUẬN ÁN TIẾN SĨ Người hướng dẫn khoa học: PGS TS VŨ NGỌC BỘI PGS TS TRẦN THỊ THANH VÂN KHÁNH HÒA - 2019 LỜI CAM ĐOAN Tơi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu Một số kết luận án tài trợ kinh phí từ Đề tài hợp tác quốc tế: “Polysaccharide sulfate từ tảo nâu Việt Nam: Cấu trúc hoạt tính sinh học”, Mã số: VAST.HTQT.NGA 06/13-14, thuộc chương trình hợp tác quốc tế Viện Nghiên cứu Ứng dụng Công nghệ Nha Trang với Liên bang Nga, Đề tài “Cấu trúc hoạt tính sinh học vài ionic Polysaccharide chiết tách từ tảo biển Nhật Bản Việt Nam”, Mã số: VAST.HTQT.NHATBAN.02/13-15, thuộc chương trình hợp tác quốc tế Viện Nghiên cứu Ứng dụng Công nghệ Nha Trang với Nhật Bản Đề tài: “Nghiên cứu điều chế dẫn xuất polyguluronat sunphat hóa trọng lượng phân tử thấp từ nguồn rong mơ Việt Nam để ứng dụng dược phẩm”, Mã số: VAST06.05/12-13 mà thành viên tham gia thực Chủ nhiệm đề tài đồng ý cho phép sử dụng báo cáo Luận án Các kết quả, số liệu nêu luận án trung thực, chưa cơng bố cơng trình Khánh Hòa, Ngày tháng năm 2019 NGHIÊN CỨU SINH NGUYỄN VĂN THÀNH i LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành Luận án này, Trước hết xin gửi tới Ban Giám hiệu Trường Đại học Nha Trang, Ban Chủ nhiệm Khoa Công nghệ Thực phẩm, Lãnh đạo khoa Sau Đại học kính trọng, niềm tự hào học tập nghiên cứu Trường năm qua Sự biết ơn sâu sắc xin giành cho thầy: PGS TS Vũ Ngọc Bội Trưởng khoa Công nghệ Thực phẩm - Trường Đại học Nha Trang PGS TS Trần Thị Thanh Vân - Ngun Trưởng phịng Hóa phân tích - Viện Nghiên cứu Ứng dụng Cơng nghệ Nha Trang tận tình hướng dẫn, giúp đỡ động viên tơi suốt q trình thực Luận án Xin chân thành bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến PGS TS Bùi Minh Lý - người thầy tận tình hướng dẫn, truyền cảm hứng, định hướng nghiên cứu cho giai đoạn đầu thực Luận án Vì lý sức khỏe nên Thầy tiếp tục hướng dẫn nghiên cứu Xin chân thành cám ơn: Viện Nghiên cứu Ứng dụng Công nghệ Nha Trang Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam Chủ nhiệm đề tài quốc tế, mã số: VAST.HTQT.NGA 06/13-14, VAST.HTQT.NHATBAN.02/13-15 VAST06.05/1213 hỗ trợ kinh phí để tơi hồn thành Luận án có chất lượng Xin cám ơn Lãnh đạo Trường Đại học Kiên Giang giúp đỡ tạo điều kiện cho tơi học hồn thành Luận án Xin chân thành cám ơn thầy cô phản biện cho lời khuyên quý báu để cơng trình nghiên cứu hồn thành có chất lượng Đặc biệt, xin ghi nhớ tình cảm, giúp đỡ của: cán thuộc Viện Nghiên cứu Ứng dụng Cơng nghệ Nha Trang, Gia đình bạn bè thân thiết giúp đỡ, chia sẻ q trình nghiên cứu Khánh Hịa, Ngày tháng năm 2019 NGHIÊN CỨU SINH NGUYỄN VĂN THÀNH ii MỤC LỤC DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT vi DANH MỤC CÁC BẢNG vii DANH MỤC CÁC HÌNH viii TÓM TẮT NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN xi MỞ ĐẦU CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 NGUỒN LỢI RONG NÂU TRÊN THẾ GIỚI VÀ VIỆT NAM .4 1.1.1 Giới thiệu chung rong nâu 1.1.2 Một số thành phần hóa học rong nâu 1.1.3 Tình hình sử dụng rong nâu giới 1.1.4 Rong nâu Việt Nam .7 1.2 TỔNG QUAN VỀ ALGINATE .9 1.2.1 Giới thiệu alginate 1.2.2 Cấu trúc tính chất hóa học alginate 10 1.2.3 Kỹ thuật tách chiết alginate từ rong nâu 13 1.3 ĐIỀU CHẾ ALGINATE KHỐI LƯỢNG PHÂN TỬ THẤP 20 1.3.1 Các nghiên cứu giới điều chế alginate khối lượng phân tử thấp 20 1.3.2 Các nghiên cứu nước điều chế alginate khối lượng phân tử thấp 25 1.4 ỨNG DỤNG CỦA ALGINATE VÀ ALGINATE KHỐI LƯỢNG PHÂN TỬ THẤP 28 1.5 Q TRÌNH ĐƠNG MÁU VÀ HOẠT TÍNH CHỐNG ĐƠNG MÁU CỦA ALGINATE 32 1.5.1 Lý thuyết q trình đơng máu .32 1.5.2 Các nghiên cứu hoạt tính chống đơng máu alginate .35 CHƯƠNG NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 39 2.1 NGUYÊN VẬT LIỆU 39 2.1.1 Rong mơ nguyên liệu 39 2.1.2 Nguyên vật liệu dùng cho xác định độc chất chuột .41 2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 41 2.2.1 Phương pháp thu mẫu xử lý mẫu 41 2.2.2 Các phương pháp phân tích fucoidan sodium alginate 41 2.2.3 Các phương pháp phân tích thành phần hóa học rong nâu .44 iii 2.2.4 Phương pháp đánh giá chất lượng alginate: 44 2.2.5 Phương pháp định lượng vi sinh vật 44 2.2.6 Phương pháp xác định hoạt tính chống đơng máu độc tính SGS 44 2.2.7 Phương pháp bố trí thực nghiệm 47 2.3 HÓA CHẤT VÀ CÁC THIẾT BỊ CHỦ YẾU ĐÃ SỬ DỤNG .58 2.4 PHƯƠNG PHÁP THU THẬP VÀ XỬ LÝ SỐ LIỆU 59 CHƯƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 60 3.1 NGHIÊN CỨU SÀNG LỌC LOÀI RONG NÂU DÙNG CHO SẢN XUẤT FUCOIDAN VÀ SODIUM ALGINATE 60 3.1.1 Đánh giá hàm lượng fucoidan sodium alginate số loài rong nâu 60 3.1.2 Xác định thành phần hóa học rong nâu T ornata .66 3.2 NGHIÊN CỨU TỐI ƯU HĨA CƠNG ĐOẠN NẤU CHIẾT SODIUM ALGINATE TỪ RONG NÂU T ORNATA .70 3.3 NGHIÊN CỨU THU NHẬN SODIUM ALGINATE TỪ RONG NÂU VÀ ĐÁNH GIÁ CHẤT LƯỢNG SODIUM ALGINATE .83 3.3.1 Nghiên cứu xác định nồng độ ethanol kết tủa thu nhận sodium alginate 83 3.3.2 Đề xuất quy trình sản xuất sodium alginate từ rong nâu T ornata .84 3.3.3 Sản xuất thử đánh giá chất lượng sản phẩm sodium alginate 87 3.3.4 Xác định khối lượng phân tử trung bình sodium alginate 89 3.3.5 Xác định đặc tính cấu trúc sodium alginate thu nhận từ rong T ornata 92 3.4 NGHIÊN CỨU ĐIỀU CHẾ SODIUM ALGINATE KHỐI LƯỢNG PHÂN TỬ THẤP VÀ XÁC ĐỊNH CÁC ĐẶC TÍNH CỦA SODIUM ALGINATE KHỐI LƯỢNG PHÂN TỬ THẤP 104 3.4.1 Xác định hàm lượng sodium alginate khối lượng phân tử thấp 104 3.4.2 Xác định đặc tính cấu trúc alginate khối lượng phân tử thấp 107 3.4.3 Khối lượng phân tử trung bình alginate khối lượng phân tử thấp 112 3.5 NGHIÊN CỨU ĐIỀU CHẾ SODIUM GULURONATE SULFATE (SGS) TỪ SODIUM ALGINATE TÁCH CHIẾT TỪ RONG T.ORNATA VÀ ĐÁNH GIÁ CÁC ĐẶC TÍNH CỦA SGS 115 3.5.1 Nghiên cứu điều chế SGS từ sodium alginate tách chiết từ rong nâu T ornata 115 3.5.2 Đề xuất quy trình sản xuất SGS từ sodium alginate rong nâu T ornata đánh giá đặc tính SGS .126 3.6 ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH CHỐNG ĐƠNG MÁU IN VITRO VÀ ĐÁNH GIÁ ĐỘC TÍNH CỦA SGS 131 iv 3.6.1 Đánh giá hoạt tính chống đông máu in vitro SGS 131 3.6.2 Đánh giá độc tính SGS chuột thí nghiệm 137 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Ý KIẾN 147 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CƠNG BỐ CĨ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN 149 TÀI LIỆU THAM KHẢO 150 PHỤ LỤC v DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT APTT : Activated partial thromboplastin time (Thời gian đông máu nội sinh) cP : Centipoise (đơn vị đo độ nhớt) DS : Degree of substitution (Độ thay thế) FT-IR : Fourrier Transformation InfraRed spectroscopy (Quang phổ hồng ngoại) G : Guluronate (guluronic acid) GPC : Gel Permeation Chromatography (Sắc ký thẩm thấu gel) IR : InfraRed spectroscopy (Phổ hồng ngoại) M : Mannuronate (mannuronic acid) NMR : Nuclear Magnetic Resonance spectroscopy (Phổ cộng hưởng từ hạt nhân) PT : Prothrombin time (Thời gian đông máu ngoại sinh) SG : Sodium guluronate SGS : Sodium guluronate sulfate SM : Sodium mannuronate S mcclurei : Sargassum mcclurei SMG : Sodium mannuronate - sodium guluronate S polycystum : Sargassum polycystum TCVN : Tiêu chuẩn Việt Nam T ornata : Turbinaria ornata TT : Thrombin time (Thời gian đông máu chung) v : Volume (Thể tích) w : Weight (Khối lượng) vi DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 2.1 Thiết kế nghiên cứu độc tính SGS 46 Bảng 2.2 Các tiêu chí đánh giá kết nghiên cứu độc tính SGS .46 Bảng 3.1 Thành phần hóa học rong nâu T ornata .67 Bảng 3.2 Điều kiện thí nghiệm chọn 70 Bảng 3.3 Kết ma trận thực nghiệm trực giao cấp I 71 Bảng 3.4 Kết thí nghiệm tối ưu hóa theo hàm lượng sodium alginate 75 Bảng 3.5 Kết thí nghiệm tối ưu hóa theo độ nhớt sodium alginate .80 Bảng 3.6 Hệ số phương trình hàm đa mục tiêu .81 Bảng 3.7 Kết thí nghiệm tối ưu hàm đa mục tiêu 82 Bảng 3.8 Trạng thái chất lượng sodium alginate 87 Bảng 3.9 Kết phân tích số tiêu lý hóa sodium alginate 88 Bảng 3.10 Kết phân tích số tiêu vi sinh sodium alginate 88 Bảng 3.11 Kết phổ IR sodium alginate từ rong nâu T ornata 93 Bảng 3.12 Kết phân tích phổ 13C-NMR sodium alginate từ rong T ornata 96 Bảng 3.13 Kết phân tích phổ 1H-NMR sodium alginate từ rong T ornata 98 Bảng 3.14 Tương tác proton từ phổ 1H-1H COSY sodium alginate từ rong Turbinaria ornata 100 Bảng 3.15 Khối lượng trung bình chuột nhóm I (đánh giá độc tính cấp) 138 Bảng 3.16 Khối lượng trung bình chuột nhóm II (giai đoạn hồi phục) .139 Bảng 3.17 Tổng hợp kết xét nghiệm nước tiểu chuột nhóm I .141 Bảng 3.18 Kết xét nghiệm nước tiểu chuột nhóm II 142 Bảng 3.19 Kết xét nghiệm huyết học sinh hóa máu .143 Bảng 3.20 Kết quan sát xác định khối lượng tươi gan, lách, thận chuột thí nghiệm 144 vii DANH MỤC CÁC HÌNH Trang Hình 1.1 Liên kết (14) glycosidic uronic 11 Hình 1.2 Cấu trúc gốc uronic phân tử alginate 11 Hình 1.3 Độ dài trung bình uronic block alginate 11 Hình 1.4 Sự xếp block polysaccharide phân tử alginate 12 Hình 1.5 Các giai đoạn trình đơng máu 33 Hình 1.6 Cơ chế tạo thành phức hợp prothrombinase theo đường nội sinh ngoại sinh .34 Hình 2.1 Hình ảnh rong mơ Sargassum mcclurei Setchell .39 Hình 2.2 Hình ảnh rong mơ Sargassum polycystum C Agardh .39 Hình 2.3 Hình ảnh rong cùi bắp Turbinaria ornata (Turner) J Agardh 39 Hình 2.4 Vị trí thu mẫu rong mơ 39 Hình 2.5 Sơ đồ cách thức tiếp cận nội dung nghiên cứu luận án 47 Hình 2.6 Sơ đồ sàng lọc loài rong nâu 49 Hình 2.7 Sơ đồ tối ưu hóa cơng đoạn nấu chiết sodium alginate 50 Hình 2.8 Sơ đồ khảo sát ảnh hưởng nồng độ ethanol kết tủa sodium alginate .51 Hình 2.10 Sơ đồ điều chế sodium alginate khối lượng phân tử thấp 52 Hình 2.10 Phản ứng điều chế tác nhân sulfate hóa .53 Hình 2.11 Sơ đồ khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ phản ứng điều chế tác nhân sulfate hóa đến độ thay SGS 54 Hình 2.12 Sơ đồ khảo sát ảnh hưởng thời gian phản ứng điều chế tác nhân sulfate hóa đến độ thay SGS 54 Hình 2.13 Sơ đồ khảo sát ảnh hưởng tỷ lệ NaHSO3/NaNO2 phản ứng điều chế tác nhân sulfate hóa đến độ thay SGS 55 Hình 2.14 Phản ứng tổng hợp sodium guluronate sulfate 55 Hình 2.15 Sơ đồ khảo sát ảnh hưởng thời gian phản ứng tổng hợp đến độ thay SGS 56 viii Hình 2.13 Phổ ESI-MS disaccharide m/z 369 37 Hình 2.14 Phổ 1H -NMR sodium alginate thu từ rong nâu T ornata 38 Hình 2.15 Phổ 13C -NMR sodium alginate thu từ rong nâu T ornata Hình 2.16 Phổ COSY sodium alginate từ rong nâu T ornata 39 Hình 2.17 Phổ HSQC sodium alginate từ rong nâu T ornata 40 Hình 2.18 Phổ HMBC sodium alginate từ rong nâu T ornata 41 Hình 2.19 Phổ ROESY sodium alginate từ rong nâu T ornata 42 2.6 PHỔ CỘNG HƯỞNG TỪ HẠT NHÂN CỦA SODIUM GULURONATE (SG) Hình 2.20 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR SG 43 Hình 2.21 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13C-NMR SG 44 2.7 PHỔ CỘNG HƯỞNG TỪ HẠT NHÂN CỦA SODIUM MANNURONATE (SM) Hình 2.22 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR SM 45 Hình 2.23 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR SG 46 2.8 PHỔ HỒNG NGOẠI (IR) CỦA SODIUM GULURONATE VÀ SODIUM GULURONATE SULFATE Hình 2.24 Phổ IR sodium guluronate Hình 2.24 Phổ IR sodium guluronate sulfate 47 PHỤ LỤC MỘT SỐ HÌNH ẢNH THỰC NGHIỆM 3.1 THU MẪU RONG NÂU Thu mẫu rong Bãi Nam, biển Rong nâu Turbinaria ornata Nha Trang Lặn thu mẫu rong Turbinaria Thu mẫu rong Hòn Tre ornata Thu mẫu rong đoàn Giáo Thu mẫu rong đoàn Giáo sư Nhật Bản sư Nga 48 3.2 TÁCH CHIẾT SODIUM ALGINATE Xử lý rong Thu dịch chiết sodium alginate Kết tủa alginic acid Alginic acid Chuyển alginic acid sodium alginate Thẩm tách Sodium alginate sau tủa ethanol Sản phẩm sodium alginate 49 3.3 ĐIỀU CHẾ ALGINATE KHỐI LƯỢNG PHÂN TỬ THẤP Hỗn hợp SM SG pH =7 Hỗn hợp SM SG pH = 2,85 Guluronic acid sau ly tâm Sodium mannuronate pH = Sodium guluronate pH = Kết tủa sodium mannuronate 50 Kết tủa sodium guluronate Sodium guluronate Sodium mannuronate Kết tủa sodium guluronate sulfate 51