Thiết lập quy trình tạo keo fibrin từ huyết tương người

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC TP HỒ CHÍ MINH ĐẶNG TRẦN QUÂN THIẾT LẬP QUY TRÌNH TẠO KEO FIBRIN TỪ HUYẾT TƯƠNG NGƯỜI LUẬN VĂN THẠC SĨ Y HỌC Thành phố Hồ Chí Minh - 2016 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC TP HỒ CHÍ MINH ĐẶNG TRẦN QUÂN THIẾT LẬP QUY TRÌNH TẠO KEO FIBRIN TỪ HUYẾT TƯƠNG NGƯỜI Chuyên ngành : Y học hình thái (Mơ phơi) Mã số : 60 72 01 02 LUẬN VĂN THẠC SĨ Y HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS.BS TRẦN CƠNG TOẠI Thành phố Hồ Chí Minh - 2016 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng tơi, kết số liệu luận văn trung thực, không chép chưa công bố cơng trình nghiên cứu khác Ký tên ĐẶNG TRẦN QUÂN MỤC LỤC Trang Lời cam đoan Mục lục Danh mục chữ viết tắt Danh mục bảng Danh mục hình Danh mục sơ đồ Mở đầu Chương Tổng quan tài liệu 1.1 Cơ chế hình thành cục máu đơng fibrin 1.1.1 Quá trình cầm máu 1.1.2 Cơ chế hình thành cục máu đông fibrin 1.2 Các thành phần tham gia cấu tạo keo fibrin 10 1.2.1 Fibrinogen 10 1.2.2 Thrombin 12 1.2.3 Yếu tố XIII (FSF – Fibrin Stabilizing Factor) 15 1.2.4 Calcium Chloride 15 1.2.5 Muối NaCl 15 1.2.6 Quá trình phân hủy fibrin 16 1.3 Tính chất vật lý keo 18 1.3.1 Cấu trúc sợi keo fibrin 18 1.3.2 Đặc tính học keo fibrin 19 1.3.3 Đặc tính gắn kết keo fibrin 20 1.4 Các hóa chất chống đơng tác động lên keo fibrin 20 1.5 Các phương pháp tạo keo fibrin 21 1.5.1 Đặc điểm fibrinogen thrombin huyết tương người 21 1.5.2 Các phương pháp thu nhận fibrinogen 22 1.5.3 Các phương pháp thu nhận thrombin 23 1.6 Một số cách sử dụng keo fibrin 23 1.7 Tiềm ứng dụng keo fibrin 24 1.8 Tiêu chí keo dán sinh học 24 1.9 Các tiêu an toàn keo dán sinh học 25 1.10 Tình hình nghiên cứu giới 27 1.10.1 Trong lĩnh vực y học điều trị 27 1.10.2 Trong lĩnh vực y học nghiên cứu 32 1.11 Tình hình nghiên cứu Việt Nam 33 Chương Đối tượng phương pháp nghiên cứu 34 2.1 Đối tượng nghiên cứu 34 2.2 Tiêu chuẩn chọn mẫu 34 2.3 Y đức 35 2.4 Phương pháp nghiên cứu 35 2.4.1 Thiết kế nghiên cứu 35 2.4.2 Thiết lập quy trình thu nhận fibrinogen thrombin 35 2.4.3 Đánh giá số đặc điểm keo fibrin 39 Chương Kết bàn luận 42 3.1 Quy trình thu nhận fibrinogen thrombin 42 3.1.1 Định lượng nồng độ fibrinogen 42 3.1.2 Phân tích điện di 44 3.1.3 Khảo sát hiệu tạo keo phương pháp 46 3.1.4 Đặc điểm cấu trúc keo fibrin 48 3.1.5 Lựa chọn quy trình tạo keo fibrin tối ưu 51 3.2 Đánh giá số đặc điểm keo fibrin 52 3.2.1 Khảo sát độ an toàn sinh học 53 3.2.2 Đánh giá khả gây độc tế bào 54 3.2.3 Đánh giá thời gian phân hủy keo (in vitro) 55 Chương 58 Kết luận 58 Kiến nghị 60 Tài liệu tham khảo 61 Phụ lục Phiếu phân tích đánh giá độ vô khuẩn DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ADP: Adenosin triphosphat ALT: Aspartate Amino Transferase BN: Bệnh nhân CS: Cộng DMEM/F12: Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F­12 DMSO: Dimethyl sulfoxide DPBS: Dulbecco's Phosphate­Buffered Saline F: Fibrinogen GMP: Good Manufacturing Practices HBsAg: Hepatitis B surface Antigen HCV: Hepatitis C virus H&E: Haematoxyline and Eosine HIV: Human Immuno­deficiency Virus ISO: International Organization for Standardization NFB: Neutral formalin buffer SDS­PAGE: Sodium Dodecyl Sulfate PolyAcrylamide SEM: Scanning electron microscopy PEG: Polyethylene glycol PP: Phương pháp T: Thrombin VDRL: Venereal Diseases Research Laboratory V: Thể tích DANH MỤC BẢNG Trang Bảng 1.1 So sánh điểm thuận lợi hạn chế hai loại keo thương mại tự thân 31 Bảng 3.1 So sánh nồng độ fibrinogen phương pháp 43 Bảng 3.2 So sánh thời gian tạo keo (giây) phương pháp với tỉ lệ F : T (v/v) khác 46 Bảng 3.3 So sánh thời gian tạo keo (giây) phương pháp theo tỉ lệ F:T (v/v) 1:1 47 Bảng 3.4 So sánh nồng độ fibrinogen thu được, thời gian tạo keo cấu trúc khối keo phương pháp 52 Bảng 3.5 Kết đánh giá độ vô khuẩn khối keo theo tiêu chí Dược điển Việt Nam IV 53 Bảng 3.6 Khảo sát khối lượng keo theo thời gian ngâm dung dịch PBS huyết tương người 56 DANH MỤC HÌNH Trang Hình 1.1 Sơ đồ mơ tả polymer hóa tạo mạng fibrin dẫn đến hình thành cục máu đơng Hình 1.2 Sơ đồ mơ tả hình thành keo fibrin tạo phối trộn thành phần keo Hình 1.3 Mô tả cấu trúc phân tử fibrinogen 11 Hình 1.4 Hoạt động enzyme thrombin fibrinogen 12 Hình 1.5 Cấu tạo phân tử thrombin 14 Hình 1.6 Vị trí hoạt động plasmin fibrin 17 Hình 2.1 Buồng đếm tế bào 40 Hình 2.2 Đĩa ni tế bào 24 giếng 41 Hình 3.1 Biểu đồ đánh giá nồng độ fibrinogen thu nhận qua phương pháp 42 Hình 3.2 Phân tích điện di SDS­ PAGE PP thu nhận fibrinogen 44 Hình 3.3 Phân tích điện di SDS­ PAGE PP thu nhận thrombin 45 Hình 3.4 Cấu trúc mơ học keo fibrin nhuộm H&E (10X 40X) 49 Hình 3.5 Khối keo fibrin quan sát KHV điện tử quét (SEM) 50 Hình 3.6 Kết đánh giá khả gây độc in vitro keo fibrin nguyên bào sợi 54 Hình 3.7 Đường cong thời gian phân hủy keo fibrin xử lý với dung dịch PBS huyết tương người 56 DANH MỤC SƠ ĐỒ Trang Sơ đồ 1.1 Sơ đồ q trình đơng máu Sơ đồ 1.2 Cơ chế hoạt động keo Tisseel (Baxter) 10 Sơ đồ 1.3 Sơ đồ tóm tắt chế chống đông máu 21 Sơ đồ 1.4 Sơ đồ quy trình sàng lọc máu người hiến tiêu đánh giá máu trước sản xuất keo 26 Sơ đồ 2.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát thực đề tài 34 52 Bảng 3.4 So sánh nồng độ fibrinogen thu được, thời gian tạo keo cấu trúc khối keo phương pháp Phương pháp tốt + ++ +++ ++++ PP2 PP1 PP3 PP4 Thời gian tạo keo theo PP2 PP3 PP4 PP1 PP3 PP4 PP1 Nồng độ fibrinogen thu (mg/dl) tỉ lệ F:T 1:1 Cấu trúc mô học PP2 khối keo Chú thích: +: Trung bình, + +: Khá, + + +: Tốt, + + + +: Rất tốt Nhận xét: Trong PP, PP1 có thời gian tạo keo nhanh cấu trúc mô học khối keo tốt Kết nồng độ fibrinogen thu PP sử dụng hóa chất cao so với PP1 ta cần lưu ý lượng fibrinogen thu tủa từ 2ml huyết tương, nên hiệu thu tủa fibrinogen ethanol, ammonium sulfat PEG không nồng độ fibrinogen có sẵn huyết tương Do đó, nhóm nghiên cứu lựa chọn PP1 quy trình tạo keo fibrin tối ưu với tiêu chí thời gian tạo keo nhanh cấu trúc mô học khối keo tốt Ngồi ra, PP1 sử dụng hóa chất PP nên quy trình tạo keo fibrin gần giống với q trình đơng máu sinh lý nhất, sử dụng người bệnh đạt hiệu tốt PP lại 3.2 Đánh giá số đặc điểm keo fibrin Sau lựa chọn quy trình tối ưu, tiếp tục tiến hành khảo sát số đặc điểm keo fibrin tạo theo quy trình chọn PP1 Fibrinogen tủa phương pháp tủa lạnh Tỉ lệ thể tích kết hợp fibrinogen thrombin (ml) : tỉ lệ 1:1 53 3.2.1 Khảo sát độ an toàn sinh học Sau tạo khối keo, keo đóng gói điều kiện vô trùng gửi đến Trung tâm kiểm nghiệm thuốc, mỹ phẩm thực phẩm TP.HCM để đánh giá độ vơ khuẩn Có tất mẫu keo tạo thành từ mẫu thí nghiệm độc lập, thu nhận để đánh giá độ vô khuẩn Kết cho Bảng 3.5 Bảng 3.5 Kết đánh giá độ vô khuẩn khối keo theo tiêu chí Dược điển Việt Nam IV (xem bảng kết phần phụ lục) STT Mẫu Chỉ tiêu Yêu cầu Kết Tài liệu áp dụng Khối keo (Mẫu 1) Đo độ vô khuẩn Phải vô khuẩn Đạt Dược điển Việt Nam IV Khối keo (Mẫu 2) Đo độ vô khuẩn Phải vô khuẩn Đạt Dược điển Việt Nam IV Khối keo (Mẫu 3) Đo độ vô khuẩn Phải vô khuẩn Đạt Dược điển Việt Nam IV Theo tiêu chuẩn nhà sản xuất keo thương mại tiêu chí vơ khuẩn sản phẩm keo dán quan trọng phẫu thuật lâm sàng Các loại keo thương mại (Baxter) [74] Evicel [16] … có kết đánh giá độ vơ khuẩn để đảm bảo tiêu chí an tồn mặt vô khuẩn sản phẩm ghép Kết đo độ vô khuẩn cho mẫu keo fibrin cho thấy, tính chất ban đầu keo (khối keo khơng màu, suốt) Được đo độ vô khuẩn theo tiêu chí Dược điển Việt Nam IV, kết cần đánh giá keo phải vô khuẩn Kết đo cho mẫu keo đạt độ vô khuẩn theo yêu cầu Tồn quy trình thao tác thu nhận, phân lập thành phần keo (fibrinogen thrombin) thao tác điều kiện vơ trùng Do đó, kết đo cho thấy keo đạt độ vô khuẩn theo phụ lục 13.6, Dược điển Việt Nam IV (2009) Ngoài ra, thu nhận máu ngoại vi thực môi trường thao tác vô trùng, đảm bảo tiêu an tồn độ vơ khuẩn, kết đánh giá độ vô khuẩn cho thấy keo tạo môi trường sạch, vô trùng, đảm bảo vô khuẩn Đây tiêu chí quan trọng để triển khai ứng dụng mẫu lâm sàng 54 Tóm lại, keo fibrin nhóm nghiên cứu tạo hồn tồn điều kiện vô trùng, đảm bảo vô khuẩn, thỏa mãn tiêu chí an tồn độ vơ khuẩn cho người bệnh 3.2.2 Đánh giá khả gây độc tế bào Mẫu keo fibrin đánh giá có hay khơng có khả gây độc tính tế bào cách dự vào tiêu chí: ISO 10993­5:2009 (Tests for Cytotoxicity ­ In Vitro Methods) Đây phương pháp đánh giá độc tính cấp tính vật liệu tế bào điều kiện nghiên cứu in vitro Theo tiêu chí này, tế bào tiếp xúc với vật liệu khoảng 48 để xem tác động vật liệu lên tế bào, từ quan sát hình thái số lượng tế bào để đánh giá xem vật liệu có gây độc hay khơng Trong thiết kế này, nguyên bào sợi người nuôi cấy chuyển qua nuôi keo fibrin đĩa giếng Sau đó, quan sát tế bào phát triển keo xảy Kết theo dõi, đánh giá bám dính phát triển nguyên bào sợi kính hiển vi đảo ngược khoảng thời gian 48 cho Hình 3.6 A B C Hình 3.6 Kết đánh giá khả gây độc in vitro keo fibrin ngun bào sợi (A) Mẫu chứng, khơng có nuôi tế bào (B) Keo fibrin sử dụng để nuôi nguyên bào sợi khoảng 24 đầu, tế bào bắt đầu cố định bám dính, chưa có nhiều tế bào phát triển (chủ yếu tế bào tròn, bầu dục) 55 (20X) (C) Sau khoảng thời gian 24-48 nuôi cấy, tế bào bắt đầu phân chia mạnh, có hình thái đặc trưng nguyên bào sợi (20X) Theo đó, sau khoảng thời gian theo dõi đánh giá 48 giờ, keo fibrin không cho thấy gây độc nguyên bào sợi điều kiện nghiên cứu in vitro Nguyên bào sợi cho thấy bám dính, tăng trưởng phát triển bề mặt bên khối keo Theo thông báo nhà sản xuất hai loại keo tiếng keo Tisseel Evicel loại keo khơng gây ung thư, không gây đột biến cho tế bào Tuy nhiên, loại bệnh lây nhiễm có nguồn gốc từ virus HIV, HAV, PRV, CPV, PVDV … đánh giá cẩn thận yếu tố nguy lây truyền cho người bệnh có số báo cáo cho thấy có nguy lây truyền bệnh cho người nhận [48; 49] Còn keo fibrin có nguồn gốc tự thân, nguồn ngun liệu để sản xuất keo hồn tồn từ người bệnh nên đảm bảo an tồn cho người bệnh nguy lây truyền bệnh Như vậy, kết luận keo không gây độc tế bào điều kiện nghiên cứu in vitro, nhiên, cần phải đánh giá thời gian dài cần thực nghiên cứu điều kiện in vivo để có kết xác cụ thể khả gây độc tế bào keo fibrin 3.2.3 Đánh giá thời gian phân hủy keo (in vitro) Keo đánh giá thời gian phân hủy cách ngâm dung dịch PBS huyết tương người nhiệt độ 370C vòng tuần (quy trình thí nghiệm dựa tiêu chuẩn ISO 15814:1999, Implants for surgery Copolymers and blends based on polylactide In vitro degradation testing) Theo đó, keo sau tạo cho vào tube có chứa dung dịch PBS huyết tương người (lần lượt ml cho tube) Khối keo tạo thành từ 0,5 ml dung dịch fibrinogen 0,5 ml dung dịch thrombin Có khối lượng ban đầu 0,5562 g Tiếp theo, ngày keo từ lơ thí nghiệm cân lại khối lượng 56 cân phân tích để đánh giá khối lượng keo Từ đó, đánh giá khả keo có bị phân hủy hay khơng điều kiện thí nghiệm in vitro Bảng 3.6 Khảo sát khối lượng keo theo thời gian ngâm dung dịch PBS huyết tương người Lơ Thí Ngày Ngày Ngày Ngày Ngày Ngày Ngày Nghiệm Đo theo khối lượng (g) PBS 0.5397 0.5016 0.4858 0.476 0.4173 0.4130 0.3832 Huyết tương 0.5410 0.5392 0.5226 0.5207 0.5192 0.5025 0.4921 Dựa vào bảng số liệu, ta có đồ thị biểu diễn đường cong thời gian phân hủy keo fibrin ngâm dung dịch PBS huyết tương người sau: Khối lượng keo Ngày Hình 3.7 Đường cong thời gian phân hủy keo fibrin xử lý với dung dịch PBS huyết tương người Trọng lượng keo ban đầu trước tiến hành đánh giá phân hủy keo theo thời gian 0.5562 g Theo đó, keo tiến hành ngâm dung dịch muối PBS ngâm huyết tương người Sau ngày theo dõi, kết cho thấy khối lượng keo ngâm dung dịch PBS lại khoảng 71%, khối 57 keo ngâm huyết tương khối lượng cịn lại khoảng 88,5% Như vậy, kết cho thấy, keo ngâm huyết tương khối lượng keo bị phân hủy diễn chậm so sánh với khối keo ngâm PBS (88,5% so với 71%) tuần theo dõi Điều giải thích dung dịch muối PBS keo bị phân hủy nhanh dung dịch có yếu tố muối khơng phù hợp cho ổn dịnh keo nên trình phân hủy keo diễn nhanh so với ngâm huyết tương Keo ngâm huyết tương người môi trường gần lý tưởng với điều kiện sinh lý nên keo ổn định so với trường hợp PBS keo bị phân hủy tốc độ chậm Tóm lại, keo dù ngâm dung dịch nào, PBS hay huyết tương người bị phân hủy tốc độ phân hủy khác tùy vào môi trường dung dịch xử lý Tuy nhiên, vòng tuần đánh giá kết phân hủy keo khối lượng keo lại cao (77% PBS 87,5% huyết tương người) Một số nghiên cứu tác giả khác keo thường phân hủy khoảng tuần [72], theo số liệu từ nhà sản xuất keo Tisseel, Baxter keo thể hấp thu khoảng từ 10 – 14 ngày [74] 58 CHƯƠNG KẾT LUẬN Sau hoàn tất nghiên cứu, nhóm nghiên cứu thiết lập quy trình tạo keo fibrin từ huyết tương người phịng thí nghiệm với tính chất: Quy trình thu nhận Fibrinogen Thrombin: ­ Fibrinogen thu nhận tốt phương pháp tủa lạnh ­ Thrombin thu nhận theo quy trình tác giả Saxena S CS Công thức phù hợp để tạo keo fibrin từ fibrinogen thrombin tỉ lệ theo thể tích 1:1 Đánh giá số tiêu chí khối keo fibrin theo mục tiêu đề như: ­ Thời gian tạo keo trung bình từ 20 – 120 giây ­ Thời gian phân hủy keo: tuần, trọng lượng khối keo đánh giá giảm 71% ( ngâm dung dịch PBS), 88,5% (ngâm huyết tương) ­ Cấu trúc keo đánh giá theo mô học SEM ­ Độ an toàn sinh học, khả gây độc tế bào đánh giá thỏa mãn tiêu chí để trở thành loại keo ghép cho người bệnh 59 Quy trình thu nhận fibrinogen Máu thu nhận để yên 40C nhằm để phân tách thành phần máu Sau khoảng thời gian 3­4 đem quay ly tâm 3000vòng/phút 15 phút Thu nhận phần huyết tương Phần huyết tương thu được, đem đông lạnh ­200C sau để qua đêm 40C Sau rã đông 2­40C Ly tâm phần huyết tương rã đơng 3000 vịng/phút, 15 phút Loại bỏ dịch nổi, chừa lại 0.5 ml huyền phù cặn lắng với nước cất Phần dịch dịch fibrinogen bảo quản tube (1ml/1 vial) điều kiện ­200C sử dụng vòng tháng Tồn q trình tiến hành điều kiện vơ trùng Quy trình thu nhận thrombin Máu thu nhận để yên 40C nhằm để phân tách thành phần máu Sau khoảng thời gian 3­4 đem quay ly tâm 3000vòng/phút 15 phút Thu nhận khoảng 1ml huyết tương cho vào tube bảo quản qua đêm ­200C Lấy ml huyết tương đông lạnh đem rã đông ­ 40C pha loãng với nước cất tạo thành 10 ml dung dịch Thêm dung dịch acid acetic 1% (tạo pH 5.3) Lắc sau để yên để tạo kết tủa vòng 30 phút Ly tâm 3000vòng/phút phút Thu tủa lắng, thêm dung dịch DPBS vào điều chỉnh pH 7.0 (sử dụng dung dịch Na2CO3 0,01M) Đặt dung dịch mơi trường có nhiệt độ 370C 15 phút sau bổ sung CaCl2 0,1M Xuất khối đơng đục vịng 1­2 phút Để thu nhận dung dịch thrombin suốt, dùng đũa thủy tinh khuấy tròn để cuộn phần tủa đục vào đầu đũa, phần lại thrombin Cho vào tuýp eppendorf Dung dịch thrombin bảo quản ­200C sử dụng vòng tháng Tồn q trình tiến hành điều kiện vô trùng 60 KIẾN NGHỊ Sau hồn tất mục tiêu nghiên cứu, nhóm nghiên cứu nhận thấy cịn nhiều cơng việc phải tiếp tục nghiên cứu để tạo sản phẩm quy trình tạo keo hồn thiện như: Định lượng nồng độ thrombin để chuẩn hóa quy trình tạo keo Đánh giá khả dán dính keo fibrin để triển khai ứng dụng lâm sàng Triển khai ứng dụng mơ hình động vật để đánh giá hiệu quả, tác động keo để hướng đến mục tiêu cuối tạo sản phẩm keo ghép tự thân lâm sàng 61 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tham khảo Tiếng Việt [1] [2] [3] [4] Dược điển Việt Nam IV - Phụ lục 13.6 (2009) Nguyễn Hoàng Thụy Khanh (2012), "Đánh giá hiệu keo fibrin phẫu thuật điều trị mộng nguyên phát", Y học Thành Phố Hồ Chí Minh 16 (1), pp 129 ­ 135 Phạm Đình Lựu (2008), Sinh lý học y khoa, Vol 1, NXB Y học, pp 88 ­ 94 Huỳnh Duy Thảo (2015), "Bước đầu đánh giá hiệu tạo keo dán fibrin tự thân điều trị phẫu thuật mộng thịt nhãn khoa", Y học TP Hồ Chí Minh 19 (6), pp 94 ­ 99 Tài liệu tham khảo Tiếng Anh [5] [6] [7] [8] [9] [10] [11] [12] [13] [14] Heikki J Aho et al (1983), "Ultrastructural characteristics of cells in human wound collected by Cellstic device", Journal of Surgical Research 35 (6), pp 498­506 Steven M Alston et al (2007), "New method to prepare autologous fibrin glue on demand", Translational Research 149 (4), pp 187­195 Thomas H Barker et al (2001), "Modification of fibrinogen with poly (ethylene glycol) and its effects on fibrin clot characteristics", Journal of biomedical materials research 56 (4), pp 529­535 Birger Blombäck et al (1982), "Fibrin gel structure and clotting time", Thrombosis research 25 (1), pp 51­70 JP Boissel et al (1984), "Covalent structures of beta and gamma autolytic derivatives of human alpha­thrombin", Journal of Biological Chemistry 259 (9), pp 5691­5697 Jui‐Yoa CHANG (1985), "Thrombin specificity", European Journal of Biochemistry 151 (2), pp 217­224 Jean­Philippe Collet et al (2005), "The elasticity of an individual fibrin fiber in a clot", Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 102 (26), pp 9133­9137 Eugene P Cronkite et al (1944), "Use of Thrombin and Fibrinogen in Skin Grafting: Preliminary Report", Journal of the American Medical Association 124 (14), pp 976­978 Erik HJ Danen et al (2001), "Fibronectin, integrins, and growth control", Journal of cellular physiology 189 (1), pp 1­13 M De Spirito et al (2000), On the dynamics of semiflexible fibrin gels, Macromolecular Symposia, Wiley­Blackwell, 111 River Street Hoboken NJ 07030­5774 USA, pp 263­274 62 [15] L DePalma et al (1993), "The preparation of fibrinogen concentrate for use as fibrin glue by four different methods", Transfusion 33 (9), pp 717­720 [16] Sohita Dhillon (2011), "Fibrin Sealant (Evicel®[Quixil®/Crosseal™])", Drugs 71 (14), pp 1893­1915 [17] Enrico Di Stasio et al (1998), "Cl− regulates the structure of the fibrin clot", Biophysical journal 75 (4), pp 1973­1979 [18] Maren Dietrich et al (2012), "Fibrin­based tissue engineering: comparison of different methods of autologous fibrinogen isolation", Tissue Engineering Part C: Methods 19 (3), pp 216­226 [19] Russell F Doolittle et al (1997), "Evolution of vertebrate fibrin formation, and the process of its dissolution", Plasminogen-Related Growth Factors [20] John D Ferry et al (1947), "Preparation and properties of serum and plasma proteins viii the conversion of human fibrinogen to fibrin under various conditions1, 2", Journal of the American Chemical Society 69 (2), pp 388­400 [21] Abe Fingerhut et al (2009), "Use of sealants in pancreatic surgery: critical appraisal of the literature", Digestive surgery 26 (1), pp 7­14 [22] R Ian Freshney (2010), "Culture of animal cells 6th", Wiley­ Blackwell, pp 320 ­ 321 [23] R Ian Freshney (2010), Culture of animal cells 6th, Wiley­Blackwell, pp 336 ­ 337 [24] Walter Furst et al (2007), "Comparison of structure, strength and cytocompatibility of a fibrin matrix supplemented either with tranexamic acid or aprotinin", Journal of Biomedical Materials Research Part B: Applied Biomaterials 82 (1), pp 109­114 [25] JW Gibble et al (1990), "Fibrin glue: the perfect operative sealant?", Transfusion 30 (8), pp 741­747 [26] Z Gnjidic et al (1994), "Fibrin sealants in the management of cerebrospinal fistulae", Biomed Prog 7, pp 39­42 [27] Héctor D González et al (2009), "Topical hemostatic devices in surgery: between science and marketing", Cirugia espanola 85, pp 23­ 28 [28] Alexis Bozorg Grayeli et al (2005), "Long­term functional outcome in facial nerve graft by fibrin glue in the temporal bone and cerebellopontine angle", European Archives of Oto-Rhino-Laryngology and Head & Neck 262 (5), pp 404­407 [29] John E Hall et al (2016), Guyton and Hall textbook of medical physiology, 13, Elsevier, pp 483­494 63 [30] Glenn Isaacson et al (1996), "Autologous plasma fibrin glue: rapid preparation and selective use", American journal of otolaryngology 17 (2), pp 92­94 [31] 15814 ISO (1999), Implants for surgery - Copolymers and blends based on polylactide - In vitro degradation testing [32] Mark R Jackson et al (1996), "Fibrin sealant: current and potential clinical applications", Blood coagulation & fibrinolysis (8), pp 737­ 746 [33] A Khare et al (1998), "105 Mechanical characterization of fibrin gels", Blood Coagulation & Fibrinolysis (7), pp 720 [34] Takahiro Kinoshita et al (2003), "Intrapleural administration of a large amount of diluted fibrin glue for intractable pneumothorax", The Japanese Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery 51 (2), pp 41­47 [35] Uday Kumar et al (2001), "Fibrin glue applications in urology", Current urology reports (1), pp 79­82 [36] Kyu Chang Lee et al (1991), "Neurosurgical application of fibrin adhesive", Yonsei Med J 32 (1), pp 53­57 [37] WJLM Liu et al (2006), "Fibrin fibers have extraordinary extensibility and elasticity", Science 313 (5787), pp 634­634 [38] Peter X Ma et al (2005), Scaffolding in tissue engineering, CRC press Taylor & Francis Group, New York [39] PM Mannucci et al (1992), "Low risk of viral infection after administration of vapor‐heated factor VIII concentrate", Transfusion 32 (2), pp 134­138 [40] H Matras et al (1972), "Suture­free interfascicular nerve transplantation in animal experiments", Wiener medizinische Wochenschrift (1946) 122 (37), pp 517­523 [41] Helene Matras (1985), "Fibrin seal: the state of the art", Journal of Oral and Maxillofacial Surgery 43 (8), pp 605­611 [42] Thomas L Matthew et al (1990), "Four years' experience with fibrin sealant in thoracic and cardiovascular surgery", The Annals of thoracic surgery 50 (1), pp 40­43 [43] Mohammadreza Mehdizadeh et al (2013), "Design strategies and applications of tissue bioadhesives", Macromolecular bioscience 13 (3), pp 271­288 [44] Kashmiri Lal Mittal et al (2009), Handbook of sealant technology, CRC Press, New York, pp 513 ­ 527 [45] Rainer Mittermayr et al (2006), "Skin graft fixation by slow clotting fibrin sealant applied as a thin layer", Burns 32 (3), pp 305­311 64 [46] Rachael Mooney et al (2010), "Specific fibrinogen and thrombin concentrations promote neuronal rather than glial growth when primary neural cells are seeded within plasma­derived fibrin gels", Tissue Engineering Part A 16 (5), pp 1607­1619 [47] Michael W Mosesson et al (2001), "The structure and biological features of fibrinogen and fibrin", Annals of the New York Academy of Sciences 936 (1), pp 11­30 [48] Michael F Müller et al (1984), "Electron microscopy of fine fibrin clots and fine and coarse fibrin films: observations of fibers in cross­ section and in deformed states", Journal of molecular biology 174 (2), pp 369­384 [49] Kevin M O'Grady et al (2000), "An evaluation of fibrin tissue adhesive concentration and application thickness on skin graft survival", The Laryngoscope 110 (11), pp 1931­1935 [50] Marsha D Bale Oenick (2004), "Studies on fibrin polymerization and fibrin structure—a retrospective", Biophysical chemistry 112 (2), pp 187­192 [51] Moon Suh Park et al (1993), "Biochemical aspects of autologous fibrin glue derived from ammonium sulfate precipitation", The Laryngoscope 103 (2), pp 193­196 [52] M Radosevich et al (1997), "Fibrin sealant: scientific rationale, production methods, properties, and current clinical use", Vox sanguinis 72 (3), pp 133­143 [53] H Redl et al (1986), "Fibrin sealant and its modes of application", Fibrin sealant in operative medicine, Springer, pp 13­26 [54] H Redl et al (1982), "Methods of fibrin seal application", The Thoracic and cardiovascular surgeon 30 (4), pp 223­227 [55] Ha Redl et al (1982), "Background and methods of fibrin sealing", Biomaterials John Wiley and Sons Ltd (1982), pp 669­676 [56] Alexander P Reiner (1999), "Fibrin glue increasingly popular for topical surgical hemostasis", Laboratory Medicine 30 (3), pp 189­193 [57] Robert F Reiss et al (1996), "Autologous fibrin glue: production and clinical use", Transfusion medicine reviews 10 (2), pp 85­92 [58] Esther A Ryan et al (1999), "Structural origins of fibrin clot rheology", Biophysical journal 77 (5), pp 2813­2826 [59] Shikha Sarkar et al (2003), "Fibrin glue for persistent pneumothorax in neonates", Journal of perinatology 23 (1), pp 82­84 [60] Samir Saxena et al (2003), "Preparation of two component Fibrin Glue and its clinical evaluation in skin grafts and flaps", Indian Journal Plastic Surgery 36 (1), pp 14 ­ 17 65 [61] Myron Schwartz et al (2004), "Comparison of a new fibrin sealant with standard topical hemostatic agents", Archives of Surgery 139 (11), pp 1148­1154 [62] T Seelich (1982), "Tissucol (Immuno, Vienna): biochemistry and methods of application", J Head Neck Pathol 3, pp 65­69 [63] Inna Shehter­Harkavyk et al (2004), "On the relationship between the adhesive properties and the structural features of fibrin sealants", Journal of adhesion science and technology 18 (12), pp 1415­1425 [64] Linus L Shen et al (1974), "Fibrin gel structure: influence of calcium and covalent cross­linking on the elasticity", Biochemical and biophysical research communications 56 (3), pp 793­798 [65] David H Sierra (1993), "Fibrin sealant adhesive systems: a review of their chemistry, material properties and clinical applications", Journal of Biomaterials Applications (4), pp 309­352 [66] Frederick H Silver et al (1995), "Preparation and use of fibrin glue in surgery", Biomaterials 16 (12), pp 891­903 [67] Frederick H Silver et al (1995), "Preparation of fibrin glue: a study of chemical and physical methods", Journal of Applied Biomaterials (3), pp 175­183 [68] Can Solakoğlu et al (2010), "Fibrin sealant in the treatment of acute ruptures of the Achilles tendon: long­term results", Eklem Hastalik Cerrahisi 21 (3), pp 124­129 [69] WD Spotnitz (1995), "Fibrin sealant in the United States: clinical use at the University of Virginia", Thrombosis and haemostasis 74 (1), pp 482­485 [70] William D Spotnitz et al (2005), "Fibrin sealant tissue adhesive­­ review and update", Journal of Long Term Effects of Medical Implants 15 (3), pp 245­270 [71] Olivier Sterkers et al (1989), "Anastomosis of the facial nerve using fibrin glue, apropos of 60 cases", Revue de laryngologie-otologierhinologie 111 (5), pp 433­435 [72] Brian M Strem et al (2005), "Multipotential differentiation of adipose tissue­derived stem cells", The Keio journal of medicine 54 (3), pp 132­141 [73] Kintomo Takakura et al (1994), "Efficacy and safety of the use of BI 91.021 (Beriplast) in cranial nerve surgery", Shinryo Shinyaku 31, pp 1808­1817 [74] Tisseel® (fibrin sealant), full prescribing information (2012), Baxter Healthcare Corporation 66 [75] Mauro Valbonesi (2006), "Fibrin glues of human origin", Best Practice & Research Clinical Haematology 19 (1), pp 191­203 [76] Vera Van Velthoven et al (1991), "Fibrin tissue adhesive sealant for the prevention of CSF leakage following transsphenoidal microsurgery", Acta neurochirurgica 109 (1­2), pp 26­29 [77] Ming­Che Wang et al (1995), "Preparation of fibrin glue: the effects of calcium chloride and sodium chloride", Materials Science and Engineering: C (2), pp 131­135 [78] John W Weisel et al (1992), "Computer modeling of fibrin polymerization kinetics correlated with electron microscope and turbidity observations: clot structure and assembly are kinetically controlled", Biophysical Journal 63 (1), pp 111 [79] AP Wilson (2000), "Cytotoxicity and viability assays in animal cell culture: a practical appoach", Oxford university press 3rd edition, pp 175 ­ 219 [80] Alisa S Wolberg et al (2003), "Elevated prothrombin results in clots with an altered fiber structure: a possible mechanism of the increased thrombotic risk", Blood 101 (8), pp 3008­3013 [81] K Zatloukal et al (1988), "A new technical of liver biopsy with plugging of the needle track using a double channel biopsy device An experimental study", Zeitschrift fur Gastroenterologie 26 (11), pp 699­703