Bước đầu áp dụng kỹ thuật giải trình tự gen theo phương pháp sanger để xác định đột biến exon 2 của gen kras và mối liên quan với một số đặc điểm cận lâm sàng trên bệnh nhân ung thư đại

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC CẦN THƠ TRƯƠNG THỊ BÍCH TRANG BƯỚC ĐẦU ỨNG DỤNG KỸ THUẬT GIẢI TRÌNH TỰ GEN THEO PHƯƠNG PHÁP SANGER ĐỂ XÁC ĐỊNH ĐỘT BIẾN EXON CỦA GEN KRAS VÀ MỐI LIÊN QUAN VỚI MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM CẬN LÂM SÀNG TRÊN BỆNH NHÂN UNG THƯ ĐẠI-TRỰC TRÀNG TẠI BỆNH VIỆN TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC CẦN THƠ NĂM 2021-2022 LUẬN VĂN THẠC SĨ CẦN THƠ - 2022 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC CẦN THƠ TRƯƠNG THỊ BÍCH TRANG BƯỚC ĐẦU ỨNG DỤNG KỸ THUẬT GIẢI TRÌNH TỰ GEN THEO PHƯƠNG PHÁP SANGER ĐỂ XÁC ĐỊNH ĐỘT BIẾN EXON CỦA GEN KRAS VÀ MỐI LIÊN QUAN VỚI MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM CẬN LÂM SÀNG TRÊN BỆNH NHÂN UNG THƯ ĐẠI-TRỰC TRÀNG TẠI BỆNH VIỆN TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC CẦN THƠ NĂM 2021-2022 Chuyên ngành: Kỹ Thuật Xét Nghiệm Y học Mã số: 8720601 LUẬN VĂN THẠC SĨ KỸ THUẬT XÉT NGHIỆM Y HỌC Người hướng dẫn khoa học: TS PHẠM THỊ NGỌC NGA CẦN THƠ - 2022 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng tơi, kết nghiên cứu trình bày luận văn trung thực, khách quan chưa công bố nơi Tác giả luận văn Trương Thị Bích Trang LỜI CẢM ƠN Trong q trình thực đề tài nghiên cứu, nhận nhiều quan tâm, giúp đỡ từ Thầy, Cô giáo, Bạn bè đồng nghiệp Gia đình Trước tiên xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Ban Giám Hiệu; Khoa Điều Dưỡng-Kỹ Thuật Y Học; Khoa Giải Phẫu Bệnh; Phòng Sinh Học Phân Tử Thầy, Cô giáo Trường Đại học Y Dược Cần Thơ truyền đạt kiến thức chuyên môn tạo điều kiện thuận tiện cho tơi suốt q trình học tập nghiên cứu Trường Tôi xin chân thành cảm ơn Ban Gíam Đốc bạn Đồng nghiệp Trung Tâm Y Sinh Học Phân Tử Trường Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh Tơi xin gửi lời cảm ơn đến người hướng dẫn khoa học cho đề tài nghiên cứu tôi: TS Phạm Thị Ngọc Nga Cuối lời cảm ơn đặc biệt đến gia đình, nơi chỗ dựa tinh thần nguồn động viên cho vượt trở ngại để hoàn thành luận văn Tác giả luận văn Trương Thị Bích Trang MỤC LỤC Trang Lời cam đoan Lời cảm ơn Danh mục chữ viết tắt Danh mục bảng Danh mục biểu đồ Danh mục sơ đồ, hình MỞ ĐẦU Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan bệnh ung thư đại-trực tràng 1.2 Một số đặc điểm cận lâm sàng bệnh ung thư đại-trực tràng 1.3 Tổng quan exon gen KRAS ung thư đại-trực tràng 1.4 Mối liên quan đột biến exon gen KRAS với số đặc điểm cận lâm sàng bệnh nhân ung thư đại-trực tràng 15 1.5 Tình hình nghiên cứu đột biến exon gen KRAS bệnh ung thư đại- trực tràng 17 Chương ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19 2.1 Đối tượng nghiên cứu 19 2.2 Phương pháp nghiên cứu 20 2.3 Đạo đức nghiên cứu 36 Chương KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 37 3.1 Đặc điểm chung đối tượng nghiên cứu 37 3.2 Một số đặc điểm cận lâm sàng bệnh nhân UTĐTT 39 3.3 Tỷ lệ kiểu đột biến exon gen KRAS 42 3.4 Mối liên quan đột biến exon gen KRAS với số đặc điểm cận lâm sàng bệnh nhân ung thư đại-trực tràng 47 Chương BÀN LUẬN 52 MỤC LỤC 4.1 Đặc điểm chung đối tượng nghiên cứu 52 4.2 Một số đặc điểm cận lâm sàng bệnh nhân ung thư đại- trực tràng 53 4.3 Tỷ lệ kiểu đột biến exon gen KRAS bệnh nhân UTĐTT 57 4.4 Mối liên quan đột biến exon gen KRAS với số đặc điểm cận lâm sàng bệnh nhân ung thư đại-trực tràng 64 KẾT LUẬN 68 KIẾN NGHỊ 69 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT Viết tắt CDC ĐBSCL EGFR FAP FDA GDP GEFs GTP Ý nghĩa Centers for Disease Control and Prevention (Trung tâm kiểm sốt phịng ngừa dịch bệnh ) Đồng sông Cửu Long Epidermal Growth Factor Receptor (Thụ thể yếu tố tăng trưởng biểu bì) Familial Adenomatous Polyposis (Bệnh đa polyp đại trực- tràng mang tính gia đình) Food and Drug Administration (Cục Quản lý thực phẩm dược phẩm Hoa Kỳ) Guanosine DiPhosphate Guanine nucleotide Exchange Factors (Yếu tố trao đổi nucleotide Guanine) Guanosine TriPhosphate KRAS Kirsten Rat Sarcoma MAPK Mitogen – activated protein kinase PCR UTĐTT Polymerase Chain Reaction (Phản ứng chuỗi trùng hợp) Ung thư đại-trực tràng DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 1.1 Các kiểu đột biến gen KRAS phổ biến codon 12 13 vị trí nucleotid bị thay đổi 10 Bảng 2.1 Tiêu chuẩn chẩn đoán thiếu máu WHO (2011) 21 Bảng 2.2 Mức độ thiếu máu phân loại theo WHO (2011) 22 Bảng 2.3 Trình tự đoạn đoạn mồi khuếch đại exon gen KRAS 29 Bảng 2.4 Chu trình nhiệt phản ứng PCR 29 Bảng 2.5 Chu kỳ luân nhiệt theo kỹ thuật COLD-PCR 32 Bảng 3.1 Đặc điểm tuổi đối tượng nghiên cứu 37 Bảng 3.2 Đặc điểm nhóm tuổi đối tượng nghiên cứu 37 Bảng 3.3 Vị trí u bệnh nhân nội soi 39 Bảng 3.4 Dạng tổn thương u nội soi 39 Bảng 3.5 Xét nghiệm định lượng nồng độ CEA 40 Bảng 3.6 Xét nghiệm định lượng nồng độ Hb trước phẫu thuật 40 Bảng 3.7 Xét nghiệm định lượng nồng độ Hb sau phẫu thuật 41 Bảng 3.8 Các loại mô bệnh học 41 Bảng 3.9 Mức độ biệt hố mơ dựa vào xét nghiệm mơ bệnh học 42 Bảng 3.10 Các kiểu đột biến exon gen KRAS 44 Bảng 3.11 Phân bố kiểu đột biến exon gen KRAS theo vị trí biến đổi 44 Bảng 3.12 Mối liên quan đột biến exon gen KRAS với nhóm tuổi 47 Bảng 3.13 Mối liên quan đột biến exon gen KRAS với giới tính 47 Bảng 3.14 Mối liên quan đột biến exon gen KRAS với nơi cư trú 48 Bảng 3.15 Mối liên quan đột biến exon gen KRAS với vị trí u 48 Bảng 3.16 Mối liên quan đột biến exon gen KRAS với dạng tổn thương u nội soi 49 Bảng 3.17 Mối liên quan đột biến exon gen KRAS với nồng độ CEA 49 Bảng 3.18 Mối liên quan đột biến exon gen KRAS với nồng độ Hb trước phẫu thuật 50 Bảng 3.19 Mối liên quan đột biến exon gen KRAS với nồng độ Hb sau phẫu thuật 50 Bảng 3.20 Mối liên quan đột biến exon gen KRAS với loại mô bệnh học 51 Bảng 3.21.Mối liên quan đột biến exon gen KRAS với mức độ 51 Bảng 4.1 Tỷ lệ đột biến exon gen KRAS số nghiên cứu 62 DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ Trang Biểu đồ 3.1 Đặc điểm giới tính đối tượng nghiên cứu 38 Biểu đồ 3.2 Đặc điểm nơi cư trú đối tượng nghiên cứu 38 Biểu đồ 3.3 Tỷ lệ bệnh nhân có đột biến exon gen KRAS 43 32 Compton C.C., L.P Fielding, L.J Burgart, et al (2000), Prognostic factors in colorectal cancer College of American Pathologists Consensus Statement 1999, Arch Pathol Lab Med, 7, 124, 979-94 33 Dighe S., et al (2010), Diagnostic precision of CT in local staging of colon cancers: a meta-analysis, Clin Radiol, 9, 65, 708-19 34 Douillard J.Y., K.S Oliner, S Siena, et al (2013), PanitumumabFOLFOX4 treatment and RAS mutations in colorectal cancer, N Engl J Med, 11, 369, 1023-34 35 E M Chun, S W Kimm, S Y Lim (2015), Prevalence of colorectal adenomatous polyps in patients with chronic obstructive pulmonary disease, Int J Chron Obstruct Pulmon Dis, 10, 955-960 36 E Sanz-Garcia, J Grasselli, G Argiles et al (2016), Current and advancing treatments for metastatic colorectal cancer, Expert Opin Biol Ther, 16 (1), pp 93-110 37 F Ha, H Khalil (2015), Crohn's disease: a clinical update, Therap Adv Gastroenterol, (6), pp 352-359 38 Fleming M., S Ravula, S.F Tatishchev, et al (2012), Colorectal carcinoma: Pathologic aspects, J Gastrointest Oncol, 3, 3, 153-73 39 Forones N.M M Tanaka (1999), CEA and CA 19-9 as prognostic indexes in colorectal cancer, Hepatogastroenterology, 26, 46, 905-8 40 Generate high-quality Sanger sequencing data with our proven workflow., accessed 7/12/2016.G.Lippi,C.Mattiuzzi, G.Cervellin(2016), Meat consumption and cancer risk: a critical review of published meta- analyses, Crit Rev Oncol Hematol, 97, 1-14 41 Globocan (2020), Estimate Cancer Incidence, Mortlality and Prevalence Wordwide in 2020, Colorectal Cancer 42 H Hurwitz, L Fehrenbacher, W Novotny et al (2004), Bevacizumab plus irinotecan, fluorouracil, and leucovorin for metastatic colorectal cancer, N Engl J Med, 350 (23), pp 2335-2342 43 Halligan S., K Wooldrage, E Dadswell, et al (2013), Computed tomographic colonography versus barium enema for diagnosis of colorectal cancer or large polyps in symptomatic patients (SIGGAR): multicentre randomised trial, Lancet, 9873, 381, 1185-93 44 Hiroyuki Kato T.S., Hiroko Otsuka, Rieko Yamada and Kiyo Watanabe (2012), Endoscopic Diagnosis and Treatment for Colorectal Cancer, Colorectal Cancer - From Prevention to Patient Care, Dr Rajunor Ettarh (Ed.); 45 Huh J.W., Y Jeong, et al (2012), Prognostic value of preoperative radiological staging assessed by computed tomography in patients with nonmetastatic colon cancer, Ann Oncol, 5, 23, 1198-206 46 J Cannon (2015), Colorectal Neoplasia and Inflammatory Bowel Disease, Surg Clin North Am, 95 (6), pp 1261-1269, vii 47 Jancik S., J Drabek, D Radzioch, et al (2010)., Clinical relevance of KRAS in human cancers, J Biomed Biotechnol, 2010, pp 1509-60 48 Johnson C.D., M.H Chen, A.Y Toledano, et al (2008), Accuracy of CT colonography for detection of large adenomas and cancers, N Engl J Med, 12, 359, pp 1207-17 49 L A Brosens, G Offerhaus (2015), Hereditary Colorectal Cancer: Genetics and Screening, Surg Clin North Am, 95 (5), pp 1067-1080 50 Lahoz A A Hall (2008), DLC1: a significant GAP in the cancer genome, Genes Dev, 13, 22, pp 1724-30 51 Lievre A., H Blons P Laurent-Puig (2010), Oncogenic mutations as predictive factors in colorectal cancer, Oncogene, 21, 29, 3033-43 52 Lindmark G., R Bergstrom, L Pahlman, et al (1995), The association of preoperative serum tumour markers with Dukes' stage and survival in colorectal cancer, Br J Cancer, 5, 71, pp 1090-4 53 M Adorno, et al (2013), Usp16 contributes to somatic stem-cell defects in Down's syndrome, Nature, 501 (7467), pp 380-384 54 M Echave, I Oyaguez, M J Lamas et al (2015)., Aflibercept in Combination with Folfiri in Patients with Metastatic Colorectal Cancer: Cost-Effectiveness Based on Velour Best Efficacy Subgroup Post-Hoc Analysis, Value Health, 18 (7), A454 55 M H Chew, W S Tan, et al (2015), Genomics of Hereditary Colorectal Cancer: Lessons Learnt from 25 Years of the Singapore Polyposis Registry, Ann Acad Med Singapore, 44 (8), pp 290-296 56 Markowitz S.D (2009), Molecular origins of cancer: Molecular basis of colorectal cancer, N Engl J Med, 25, 361,pp 2449-60 57 National Cancer Institute Surveillance, Epidemiology and End Results Program, Cancer Stat Facts: Colorectal Cancer, available fro https://seer.cancer.gov/statfacts/html/colorect.html (Dec 2018) 58 O I Selmin, et al (2016), Inactivation of Adenomatous Polyposis Coli Reduces Bile Acid/Farnesoid X Receptor Expression through Fxr gene CpG Methylation in Mouse Colon Tumors and Human Colon Cancer Cells, J Nutr, 146 (2), pp 236-242 59 Pickhardt P.J., C Hassan, S Halligan, et al (2011), Colorectal cancer: CT colonography and colonoscopy for detection systematic review and meta-analysis, Radiology, 2, 259, pp 393-405 60 Popescu N.C., S.C Amsbaugh, J.A Dipaolo, et al (1985), Chromosomal localization of three human ras genes by in situ molecular hybridization, Somat Cell Mol Genet, 2, 11, pp 149-55 61 R A Villacis, P M Miranda, I Gomy et al (2016), Contribution of rare germline copy number variations and common susceptibility loci in Lynch syndrome patients negative for mutations in the mismatch repair genes, Int J Cancer, 138 (8), pp 1928-1935 62 Sarikaya I., M Bloomston, et al (2007), FDG-PET scan in patients with clinically and/or radiologically suspicious colorectal cancer recurrence but normal CEA, World J Surg Oncol, 5, 64 63 Sequencing Chemistries, , accessed 7/12/2016 64 Sudarshan V., N Hussain, R Gahine, et al (2013), Colorectal cancer in young adults in a tertiary care hospital in Chhattisgarh, Raipur, Indian J Cancer, 4, 50, pp 337-40 65 T Akman, I Oztop, Y Baskin et al (2016), The association of clinicopathological features and survival in colorectal cancer patients with kras mutation status, J Cancer Res Ther, 12 (1), pp 96-102 66 V K Morris, F A Lucas, M J Overman et al (2014)., Clinicopathologic characteristics and gene expression analyses of non-KRAS 12/13, RAS-mutated metastatic colorectal cancer Ann Oncol, 25 (10), 20082014 67 Van Cutsem E., C.H Kohne, E Hitre, et al (2009), Cetuximab and chemotherapy as initial treatment for metastatic colorectal cancer, N Engl J Med, 14, 360, pp.1408-17 68 Van Cutsem E., C.H Kohne, I Lang, et al (2011), Cetuximab plus irinotecan, fluorouracil, and leucovorin as first-line treatment for metastatic colorectal cancer: updated analysis of overall survival according to tumor KRAS and BRAF mutation status, J Clin Oncol, 15, 29, pp 201-19 69 Van Krieken JH et al (2008), "KRAS mutation testing for predicting response to anti-EGFR therapy for colorectal carcinoma: proposal for an European quality assurance program", Virchows Arch, 453(5): pp 417-431 70 Wangefjord S, Sundstrom M, Zendehrokh N, et al (2013), Sex differences in the prognostic significance of KRAS codons 12 and 13, nd BRAF mutations in colorectal cancer: a cohort study, Biol Sex Differ 1(4), pp 17 71 Who (World Health Organization) (2010), Classification of Tumours Pathology and Genetics of Tumours of the Digestive System (4th edition) Bosman FT, Carneiro F, Hruban RH and Theise ND IARC Press, Lyon 72 Workshop P.I.T.P (2003), The Paris endoscopic classification of superficial neoplastic lesions: esophagus, stomach, and colon November 30 to December 1, 2002, Gastrointestinal Endoscopy, 6, 58, pp 3-43 73 W Li, T Qiu, W Zhi et al (2015), Colorectal carcinomas with KRAS codon 12 mutation are associated with more advanced tumor stages, BMC Cancer, 15, pps 340 PHỤC LỤC PHIẾU THU THẬP SỐ LIỆU Họ tên: .Năm sinh: Giới tính: Số điện thoại: Địa chỉ: Ngày vào viện: Số nhập viện: Mã số Giải phẫu bệnh: Cận lâm sàng 1.1 Hình ảnh nội soi * Vị trí khối u nội soi □ Đại tràng □ Trực tràng * Dạng tổn thương khối u nội soi Type 0: Tổn thương dạng ung thư dạng nhú lồi, phẳng; Type 1: Tổn thương ung thư dạng sùi; Type 2: Tổn thương ung thư dạng loét; Type 3: Tổn thương ung thư dạng dạng loét sùi kết hợp; Type 4: Tổn thương ung thư dạng thâm nhiễm; Type 5: Tổn thương ung thư dạng phân loại 1.2 Xét nghiệm định lượng nồng độ CEA CEA < 5ng/ml CEA ≥ 5ng/ml 1.3 Xét nghiệm định lượng nồng độ hemoglobin Bình thường: Hb > 12g/dL/ Nữ, > 13g/dL/ Nam Thiếu máu: Hb < 12g/dL/ Nữ, < 13g/dL/ Nam + mức độ nhẹ 10g/dL < Hb C(G12R) Bình thường GG A 10 Gly GCT GGT GGC GTA 11 Ala 12 Gly 13 Gly 14 Val GCT GGT GGC GTA 11 Ala 12 Gly 14 Val CGT 12 Arg Đột biến Mẫu K-CT C.35G>T (p.G12V) Bình thường GGA 10 Gly Đột biến 13 Gly GTT 12 Val Mẫu K-CT 21