Ví dụ phương pháp sanger

Ví dụ phương pháp Sanger Giải trình tự DNA theo Sanger thực hiện các bước giống kỹ thuật PCR, trong đó thành phần của phản ứng bao gồm những chất cần thiết để nhân bản DNA + Một enzyme DNA polymerase xúc tác phản ứng kéo dài mạch + Một primer là một đoạn DNA sợi đơn ngắn kết hợp với DNA, là trình tự khởi đầu cho polymerase + trình tự DNA + 4 loại deoxy nucleotide DNA (dATP, dTTP, dCPP, dGPP) + 4 loại dideoxy nucleotide (ddATP, ddTTP, ddCTP, ddGTP) được đánh dấu đồng vị phóng xạ Qui trình 1 Chuẩn.

Ví dụ phương pháp Sanger Giải trình tự DNA theo Sanger thực bước giống kỹ thuật PCR, thành phần phản ứng bao gồm chất cần thiết để nhân DNA: + Một enzyme DNA polymerase xúc tác phản ứng kéo dài mạch + Một primer: đoạn DNA sợi đơn ngắn kết hợp với DNA, trình tự khởi đầu cho polymerase + trình tự DNA + loại deoxy nucleotide DNA (dATP, dTTP, dCPP, dGPP) + loại dideoxy nucleotide (ddATP, ddTTP, ddCTP, ddGTP) đánh dấu đồng vị phóng xạ Qui trình: Chuẩn bị DNA đích (PCR) + đoạn DNA đích nằm DNA gen + đoạn DNA đích gắn vào vector plasmid vector thể thực khuẩn + đoạn DNA đích khuếch đại nhờ PCR Tinh DNA đích Chạy phản ứng giải trình tự Tinh sản phẩm phản ứng giải trình tự Điện di để đọc kết Phản ứng giải trình tự 1978 (sanger cổ điển): + Thời dùng chất đánh dấu, dùng chất phóng xạ đồng vị phóng xạ gắn vào ddNTP + Phản ứng chạy ống (mỗi ống gần giống thành phần gồm DNA đích sợi đơn tức biến tính tách sợi đơn giải trình tự mạch sau so trình tự lại xem có khớp hay khơng, khơng khớp khơng giống trình tự người bình thường nghĩa đột biến, có primer chạy sợi đơn nên cần primer, có dNTP, ddNTP, enzyme DNA polymerase ) Lưu ý: ống dNTP cho đủ loại, ddNTP ống cho loại loại đánh dấu phóng xạ, có ống khác nhau, cho chạy phản ứng ống + Cuối cho điện di gel, thời chưa có máy xịn, người ta dùng đồng vị phóng xạ chụp hình phim x-quang, điện di ống hàng lấy thước dị ghép thành trình tự đọc trình tự Phim x-quang để lấy thước đo + thời dùng chất đánh dấu, dùng chất phóng xạ đồng vị phóng xạ gắn vào ddNTP + phản ứng chạy ống (mỗi ống gần giống thành phần gồm DNA đích sợi đơn tức biến tính tách sợi đơn giải trình tự mạch sau so trình tự lại xem có khớp hay khơng, khơng khớp khơng giống trình tự người bình thường nghĩa đột biến có primer chạy sợi đơn nên cần primer, có dNTP, ddNTP, enzyme DNA polymerase ) Lưu ý: ống dNTP cho đủ loại, ddNTP ống cho loại loại đánh dấu phóng xạ, có ống khác nhau, cho chạy phản ứng ống Hình A có sợi đơn DNA cần giải trình tự màu đen, prime bắt vơ, phần màu đỏ chiều mũi tên qua bên phải chiều tổng hợp, nghĩa enzyme polymerase bắt vào phần primer kéo dài chuỗi Như mà kéo dài chuỗi phần B thả vào loại nucleotide triphosphat, loại binh thường loại ddNTP Loại ddNTP có đánh dấu nghĩa bị oxy đánh dấu phóng xạ ddNTP Hình C ví dụ ban đầu ống giải trình tự ta có phân tử DNA đích (chứ thật có nhiều trước nhân lên nhiều lần PCR, có nhiều), phân tử đầu tiên, ống ví dụ có chứa ddA, đoạn tổng hợp đoạn, nghĩa trình tự C,G,A,T khơng quan trọng, có loại nucleotide bình thường nên tổng hợp ống chứa ddA (vì ddA bổ sung T) nên quan tâm vị trí có phân tử DNA mẫu chỗ ngẫu nhiên bắt trúng ddA (khơng có oxy) ngừng chuỗi sản phẩm vị trí khác nhau, chiều dài khác nằm ống Cuối cho điện di gel, thời chưa có máy xịn, người ta dùng đồng vị phóng xạ chụp hình phim x-quang, điện di ống hàng lấy thước dị ghép thành trình tự đọc trình tự Phản ứng giải trình tự Sanger cải tiến + Nguyên tắc giống Sanger cổ điển, thay đánh dấu đồng vị phóng xạ, người ta gắn chất có khả phát huỳnh quang chiếu laser, huỳnh quang có nhiều màu, ddNTP màu + Nên tất để ống, sau phải điện di để phân tách sản phẩm từ dài đến ngắn, điện di ống vi mạch nhỏ gọi điện di mao quãng + Sau cho lần lược mao quãng điện di qua cửa sổ bắn laser vào đó, chuyển tín hiệu foton thành tín hiệu điện, máy nhận máy qui ước thành tín hiệu điện biểu hình màu gì, ta có đỉnh màu, máy đọc qui ước phần mềm, máy đọc trình tự, gọi biểu đồ sắc kí Một số hình ảnh khác biểu đồ sắc kí khác + Đây đoạn mẫu ngắn, người lành CTG bệnh nhân CGG, vị trsi T biến thành G, thay đỉnh có tín hiệu màu lại màu đen + biến đổi nu nguyên biến đổi, bị biến đổi lẽ CTG mã hóa axit amin Lơxin (L) biến thành CGG mã hóa axit amin Arginine (R)  Chỉ cần nguyên gen, nguyên protein nu bị biến đổi dẫn đến biển đổi axit amin gây bệnh ... dấu phóng xạ ddNTP Hình C ví dụ ban đầu ống giải trình tự ta có phân tử DNA đích (chứ thật có nhiều trước nhân lên nhiều lần PCR, có nhiều), phân tử đầu tiên, ống ví dụ có chứa ddA, đoạn tổng... ống hàng lấy thước dị ghép thành trình tự đọc trình tự Phản ứng giải trình tự Sanger cải tiến + Nguyên tắc giống Sanger cổ điển, thay đánh dấu đồng vị phóng xạ, người ta gắn chất có khả phát