GIẢI TRÌNH TỰ GEN BẰNG PHƯƠNG PHÁP SANGER

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT TRƯỜNG ĐỊA HỌC LÂM NGHIỆP – PHÂN HIỆU ĐỒNG NAI THUYẾT TRÌNH HỌC PHẦN SINH HỌC PHÂN TỬ Tên đề tài KỸ THUẬT GIẢI TRÌNH TỰ GEN BẰNG PHƯƠNG PHÁP SANGER Giảng viên hướng dẫn Cô Trịnh Thị Nhung Sinh viên thực hiện Nguyễn Quang Trường Đặng Lê Thanh Tuyền Nguyễn Ngọc Như Ý Hồ Thụy Kim Ngân Hà Thị Liên Lớp K66B – Thú Y MỤC LỤC 1 Sơ lược về các phương pháp giải trình tự gen 1 1 1 Giải trình tự gen bằng phương pháp Hóa học 1 1 2 Giải trình tự gen bằng phương ph.

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT TRƯỜNG ĐỊA HỌC LÂM NGHIỆP – PHÂN HIỆU ĐỒNG NAI THUYẾT TRÌNH HỌC PHẦN SINH HỌC PHÂN TỬ Tên đề tài: KỸ THUẬT GIẢI TRÌNH TỰ GEN BẰNG PHƯƠNG PHÁP SANGER Giảng viên hướng dẫn : Cô Trịnh Thị Nhung Sinh viên thực : Nguyễn Quang Trường Đặng Lê Thanh Tuyền Nguyễn Ngọc Như Ý Hồ Thụy Kim Ngân Hà Thị Liên Lớp : K66B – Thú Y MỤC LỤC Sơ lược phương pháp giải trình tự gen 1.1 Giải trình tự gen phương pháp Hóa học .1 1.2 Giải trình tự gen phương pháp Enzyme .1 1.3 Giải trình tự gen phương pháp sử dụng máy tự động 1.4 Sự đời phương pháp giải trình tự gen hệ 1.5 Ý nghĩa mục đích giải trình tự gen Nguyên tắc giải trình tự phương pháp Sanger 3 Ví dụ cụ thể giải trình tự gen phương pháp Sanger .5 Thành tựu mà phương pháp Sanger mang đến 4.1 Chẩn đốn nhóm bệnh rối loạn chuyển hoá 4.2 Xét nghiệm không xâm lấn 4.3 Phương pháp giải trình tự gen hệ mang tính tồn diện 4.4 Tiết kiệm chi phí 4.5 Phương pháp giải trình tự gen hệ cho kết nhanh chóng 4.6 Hiệu cao Ứng dụng giải trình gen phương pháp Sanger 5.1 Ưu nhược điểm giải trình tự Sanger .9 Sơ lược phương pháp giải trình tự gen Từ năm 1977 số phương pháp giải trình tự gen phát minh: • Giải trình tự gen enzyme ( phương pháp Dideoxy) Frederick Sanger Năm 1977, Frederick Sanger phát triển phương pháp để giải trình tự DNA dựa phương pháp PCR kết dứt chuỗi Với phương pháp này, Sanger trao giải thưởng Nobel hóa học năm 1980 ngày phương pháp gọi phương pháp giải trình tự DNA • Sanger, trở thành phương pháp tiêu chuẩn lĩnh vực di truyền Giải trình tự gen phương pháp hóa học: Alan Maxam Walter Gilbert Cả phát triển phương pháp giải trình tự DNA (DNA Sequencing) có người dịch phương pháp Dideoxy dựa phương pháp Andrei Mirzabekov 1.1 Giải trình tự gen phương pháp Hóa học Đây phương pháp sử dụng chủ yếu để giải trình tự đoạn gen Phương pháp hóa học thực nguyên tắc chọn đoạn gen, sau thực phương pháp chất xúc tác hóa học để biến đổi base nucleotide Các Nucleotide sau biến đổi tách riêng khỏi mạch DNA Cuối người ta áp dụng phương pháp điện di mẫu DNA theo phương pháp hóa học để đưa trình tự gen xác Đây phương pháp giải trình tự DNA phức tạp địi hỏi cần áp dụng nhiều hóa chất bước thực theo quy trình nghiêm ngặt kết xác 1.2 Giải trình tự gen phương pháp Enzyme Phương pháp giải trình tự gen thực cách đơn giản so với phương pháp hóa học Chỉ cần chèn đoạn gen cần xác định vào vị trí xác định rõ sau nhân vector thành nhiều tách để chúng trở thành vector tự Sau sử dụng ống phản ứng gen với nucleotide thực điện di để xác định trình tự DNA Từ kết phản ứng trình điện di đọc trình tự gen cách xác Đây phương pháp sử dụng để giải trình tự DNA nhiều 1.3 Giải trình tự gen phương pháp sử dụng máy tự động Đây coi phương pháp giải trình tự gen phổ biến Phương pháp sử dụng ống phản ứng đưa mạch DNA sản sinh đánh dấu huỳnh quang vào máy tự động để tiến hành điện di Khi chùm tia laze qua cách điện phát sáng máy tự động đo tiến hành so dịng từ phân tích trình tự gen Phương pháp giúp xác định trình tự gen cách nhanh chóng có kết xác 1.4 Sự đời phương pháp giải trình tự gen hệ Kể từ hoàn thành “Dự án gen người”, cải tiến cơng nghệ tự động hóa tăng tốc độ giảm chi phí đến mức gen riêng lẻ giải trình tự cách thường xun số phịng thí nghiệm giải trình tự 100.000 tỷ bazơ năm toàn gen khoảng vài nghìn la Các phương pháp giải trình tự gen hệ phát triển hỗ trợ Viện nghiên cứu hệ gen người quốc gia (NHGRI) với thành tựu Cơng nghệ Giải trình tự DNA tiên tiến mục tiêu NHGRI thúc đẩy cơng nghệ giải trình tự gen hệ với chi phí 1.000 la Một phương pháp giải trình tự gen hệ giúp quan sát phân tử DNA polymerase chúng chép DNA Phương pháp giải trình tự gen sử dụng máy quay phim kính hiển vi, đồng thời kết hợp màu nhuộm sáng khác cho chữ A, T, C G Phương pháp cung cấp nhiều thơng tin có giá trị so với cách giải trình tự gen truyền thống khác Ngồi ra, cơng nghệ giải trình tự gen hệ khác phát triển, yêu cầu phải sử dụng lỗ nano để giải trình tự gen Giải trình tự DNA dựa lỗ nano thực cách luồn sợi DNA đơn lẻ qua lỗ cực nhỏ màng Các sở DNA đọc lần chúng chui qua lỗ nano Các bazơ xác định cách đo lường khác biệt ảnh hưởng chúng ion dòng điện chạy qua lỗ Sử dụng lỗ nano để giải trình tự gen giúp mang lại nhiều lợi tiềm so với phương pháp Nó khơng có chi phí thấp mà cịn thực nhanh Mặt khác, phương pháp giải trình tự DNA nghiên cứu lặp lặp lại với phân tử 1.5 Ý nghĩa mục đích giải trình tự gen Giải trình tự gen kỹ thuật phịng thí nghiệm, sử dụng để xác định trình tự loại bazơ (A, C, T G) phân tử DNA Trình tự mang đến thông tin mà tế bào cần để lắp ráp phân tử protein RNA Do đó, giải trình tự DNA có ý nghĩa quan trọng nhà khoa học điều tra chức gen Nguyên tắc giải trình tự phương pháp Sanger Phương pháp thực dựa kỹ thuật phổ biến “chain termination – kết thúc chuỗi” việc sử dụng deoxynucleotide bị chỉnh sửa làm nhóm hydroxyl đầu 3’ phân tử đường Nhóm 3’ – OH đóng vai trò cho phép gắn thêm nucleotide vào chuỗi Khi ddNTP thêm vào chuỗi, khơng có nhóm 3’ – OH nên nucleotide khơng thêm vào, phản ứng tổng hợp dừng lại Enzyme polymerase xúc tác phản ứng gắn dNTP vào mạch đơn DNA để kéo dài mạch vị trí 3’ – OH dừng lại gắn ddNTP vào chuỗi Trong phản ứng chứa dNTP ddNTP nên sau phản ứng tổng hợp, hình thành đoạn DNA có độ dài khác ddNTP gắn ngẫu nhiên làm dừng phản ứng Dựa vào sai khác độ dài đoạn DNA hiển thị gel sau điện di để xác định trình tự gen Phản ứng tiến hành ống nghiệm riêng biệt, ống nghiệm, đoạn mồi (đoạn DNA RNA ngắn có giá trị khởi đầu cho q trình nhân đơi DNA) đánh dấu thị huỳnh quang đóng vai trị tối hậu nhằm xác định trình tự đoạn cắt cụ thể Kỹ thuật giải trình tự Sanger tự động sử dụng thiết bị dị tìm để phát tín hiệu huỳnh quang truyền tải kết Nguyên liệu cần cho phản ứng là: enzyme polymenase, primer, trình tự DNA, loại dNTP loại ddNTP đánh dấu màu huỳnh quang khác (ddATP màu xanh cây, ddGTP màu vàng, ddCTP màu xanh lam ddTTP màu đỏ) tỷ lệ thấp - Bước 1: PCR kết thúc chuỗi (chain – termination PCR)  Đầu tiên việc kéo dài tiến hành nhờ DNA polymerase thêm dNTP vào chuỗi DNA xúc tác cho hình thành liên kết phosphodiester nhóm 3’ – OH tự nucleotide cuối 5’ – phosphate  Nhưng phản ứng PCR kết thúc chuỗi, người ta dùng tỷ lệ thấp ddNTP thiếu nhóm 3’ – OH cần thiết cho hình thành liên kết phosphodiester Do đó, DNA polymerase kết hợp ddNTP cách ngẫu nhiên, trình kéo dài kết thúc  Kết thúc phản ứng PCR kết thúc chuỗi hàng chiệu oligonucleotide chuỗi DNA quan tâm, có độ dài ngẫu nhiên - Bước 2: Tách kích thước điện di gel  Các sản phẩm phản ứng PCR phân tách kích thước thơng qua điện di gel  Trong q trình điện di, DNA tích điện âm, kéo phía điện cực dương đoạn DNA có điện tích đơn vị khối lượng, tốc độ di chuyển xác định theo kích thước Một đoạn DNA ngắn di chuyển nhanh  Kết DNA xếp theo thứ tự kích thước - Bước 3: Phân tích – xác định trình tự DNA  Viếc phải làm cuối đọc gel để xác định chuỗi DNA đầu vào Do DNA polymerase tổng hợp DNA theo hướng 5’ đến 3’, ddNTP cuối đoạn DNA tương ứng với nucleotide cụ thể Ví dụ: đoạn ngắn phải kết thúc nucleotide từ đầu 5’, đoạn ngắn thứ hai phải chấm dứt nucleotide thứ hai từ đầu 5’,… Do đó, cách đọc dải gel từ nhỏ đến lớn nhất, xác định trình tự đoạn DNA 5’ đến 3’ Ví dụ cụ thể giải trình tự gen phương pháp Sanger Đây đoạn mẫu ngắn, người lành ba CTG bệnh nhân CGG, vị trí T biến thành G, thay đỉnh có tín hiệu màu đỏ lại màu đen Khi biến đổi nu nguyên ba biến đổi, ba bị biến đổi lẽ ba CTG mã hóa axit amin Lơxin (L) biến thành CGG mã hóa axit amin Arginine (R)  Chỉ cần nguyên gen, nguyên protein nu bị biến đổi dẫn đến biển đổi axit amin gây bệnh Thành tựu mà phương pháp Sanger mang đến 4.1 Chẩn đốn nhóm bệnh rối loạn chuyển hố Rối loạn chuyển hóa bẩm sinh nhóm bệnh di truyền đơn gen dẫn đến thiếu hụt enzym, gây rối loạn đường chuyển hóa Các bệnh rối loạn chuyển hóa bẩm sinh chia thành ba nhóm: nhóm bệnh rối loạn chuyển hóa carbohydrate, nhóm bệnh rối loạn chuyển hóa axit amin nhóm bệnh rối loạn chuyển hóa axit béo Các bệnh rối loạn chuyển hóa bẩm sinh thường chẩn đốn muộn, với biến chứng nặng nề suy giảm chức tâm thần kinh, chậm phát triển trí tuệ, chí tử vong Ở nước ta, số bệnh rối loạn chuyển hóa bẩm sinh biết đến bệnh Phenylketo niệu, bệnh nước tiểu dạng syrup, bệnh tyrosinemia I, II III, bệnh Pompe, Việc ứng dụng công nghệ giải trình tự gen hệ giúp việc chẩn đoán sớm điều trị kịp thời tránh biến chứng thần kinh tử vong trẻ sinh mắc bệnh rối loạn chuyển hoá bẩm sinh Phương pháp giải trình tự gen hệ (next generation sequencing – NGS) đời giúp y học ứng dụng chẩn đoán, điều trị cải thiện tình trạng sức khỏe với chi phí rẻ, hiệu cao Phương pháp có nhiều ưu điểm 4.2 Xét nghiệm không xâm lấn Hiện nay, công nghệ giải trình tự gen ứng dụng phổ biến lĩnh vực khám, chẩn đoán, tầm soát điều trị bệnh Nếu trước đây, để khám chẩn đoán xác bệnh lý cụ thể đó, bác sĩ cần thực xét nghiệm xâm lấn Ví dụ chọc nước ối bào thai để chẩn đoán trước sinh, xét nghiệm máu,… nhằm có kết xác thực Giải trình tự gen hệ phương pháp không xâm lấn Nhưng xét nghiệm lại khiến người bệnh phải chịu rủi ro cao, gây đau đớn, chí nguy hiểm tới tính mạng Với đời phương pháp giải trình tự gen hệ mới, tiếp nối thành cơng từ cơng nghệ trình tự gen cũ, thai phụ làm chẩn đốn trước sinh nhanh chóng, xác Họ khơng cần phải chịu rủi ro, nguy hiểm xét nghiệm xâm lấn Các bệnh di truyền phát sớm hơn, tìm nguyên nhân nhanh có phác đồ điều trị phù hợp, hiệu 4.3 Phương pháp giải trình tự gen hệ mang tính tồn diện Phương pháp giải trình tự gen hệ đời giúp giải mã gen phức tạp sinh vật sống, đặc biệt người Từ tìm giải pháp nhằm chẩn đoán, điều trị cải thiện sức khỏe người tốt Giải trình tự gen hệ giải pháp toàn diện Giải trình tự gen hệ ứng dụng vào xét nghiệm di truyền, xác định đột biến gen người Đồng thời, giải trình tự gen công nghệ NGS giúp phát DNA tế bào ung thư dễ dàng Việc chẩn đoán điều trị bệnh khơng cịn nhiều khó khăn kể từ phương pháp giải trình tự gen cơng nghệ NGS đời 4.4 Tiết kiệm chi phí Phương pháp giải trình tự gen hiệu sử dụng phổ biến Sanger cộng phát minh năm 1970 Và gen người giải mã phương pháp Sanger vào năm 2004 Phương pháp giải trình tự gen hệ tiết kiệm chi phí tốt Viện Nghiên cứu Hệ gen người quốc gia (NHGRI – Mỹ) khởi động chương trình nhằm giảm chi phí giải mã gen xuống 1000USD Thời gian thực dự án khoảng 10 năm Điều thúc đẩy đời phương pháp giải trình tự gen hệ công nghệ NGS với cải tiến vượt trội NGS giúp thực hàng triệu phản ứng giải trình tự lúc, kết xác định trực tiếp không cần thơng qua điện di, khơng cần nhân dịng đoạn DNA Và hiệu đạt khơng thể phủ nhận 4.5 Phương pháp giải trình tự gen hệ cho kết nhanh chóng Giải trình tự gen giúp đọc – hiểu đoạn gen mã hóa, khơng mã hố thành protein chức liên quan Sự tò mò hệ gen người thúc đẩy người tiến hành nghiên cứu Khởi đầu với phát cấu trúc DNA, tới bước tiến dài đạt hiểu biết phức tạp, đa dạng hệ gen Một loạt hóa chất thiết bị đổi hỗ trợ cho khởi đầu dự án Hệ gen người Nhưng trở ngại lưu lượng xử lý giải trình tự khiến nhà khoa học gặp phải khó khăn Để rồi, mắt tảng giải trình tự gen hiệu cao đời năm 2000, giúp giảm 50.000 lần giá thành so với phương pháp trước Phương pháp đặt tên phương pháp giải trình tự gen hệ NGS Với cơng nghệ đại, phương pháp giải trình gen hệ giải mã đồng loạt hàng triệu trình tự DNA lúc Điều giúp nâng cao hiệu suất giải mã gen động vật sống nói chung người nói riêng Sau 10 năm đời, kỹ thuật giải trình tự gen không ngừng phát triển tăng lưu lượng xử lý, từ số 100 lên tới 1000 lần, khiến việc xét nghiệm gen khơng cịn phức tạp trước 4.6 Hiệu cao Trên thực tế, phương pháp giải trình tự gen hệ thực vai trị đời Cơng nghệ giải trình tự gen ứng dụng nhiều vào ngành y học, nghiên cứu, giúp đem tới thành tựu đáng kể Phương pháp giải trình tự gen hệ đem lại hiệu ứng dụng cao Trong xét nghiệm di truyền, NGS giúp nhà khoa học có tranh tổng thể, chi tiết Qua đó, họ phát gen bất thường liên quan tới khởi phát bệnh Thậm chí dạng đột biến gen gặp thực tế Phương pháp giải trình tự gen cơng nghệ NGScũng giúp đem tới nhiều thành công xác định nhiều đột biến dạng ung thư Từ ung thư tuyến tụy, bàng quang, ung thư phổi, ung thư vú,… Thậm chí tầm sốt ung thư nhờ giải trình tự mẫu sinh thiết lỏng Hiện nay, phương pháp giải trình tự gen hệ giúp chẩn đốn xác bệnh ung thư để có hướng điều trị kịp thời, giúp nâng cao sức khỏe cộng đồng Đây giải pháp tốt chuyên gia khuyên người thực Ứng dụng giải trình gen phương pháp Sanger Giải trình tự Sanger thực giải với đoạn DNA tương đối dài khoảng 900 -1200 cặp base lần giải Kỹ thuật nắm giữ vai trò quan trọng việc chuẩn đoán bệnh di truyền, sàng lọc tiền hôn nhân, nghiên cứu tác nhân nhiễm mới,… 5.1 Ưu nhược điểm giải trình tự Sanger: Giải trình tự Sanger thực với đoạn DNA tương đối dài (khoảng 900 cặp base) Tuy nhiên, giải trình tự DNA theo phương pháp Sanger tốn khơng hiệu cho dự án có quy mơ lớn hơn, trình tự tồn hệ gen hay metagenome  ... Sơ lược phương pháp giải trình tự gen 1.1 Giải trình tự gen phương pháp Hóa học .1 1.2 Giải trình tự gen phương pháp Enzyme .1 1.3 Giải trình tự gen phương pháp sử dụng máy tự động... đời phương pháp giải trình tự gen hệ 1.5 Ý nghĩa mục đích giải trình tự gen Nguyên tắc giải trình tự phương pháp Sanger 3 Ví dụ cụ thể giải trình tự gen phương pháp Sanger .5 Thành tựu... giải trình tự gen Từ năm 1977 số phương pháp giải trình tự gen phát minh: • Giải trình tự gen enzyme ( phương pháp Dideoxy) Frederick Sanger Năm 1977, Frederick Sanger phát triển phương pháp để giải