Nghiên cứu bào chế viên nang cứng chứa bào tử nấm linh chi (ganoderma lucidum spore)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH NGUYỄN VĂN VŨ NGHIÊN CỨU BÀO CHẾ VIÊN NANG CỨNG CHỨA BÀO TỬ NẤM LINH CHI (GANODERMA LUCIDUM SPORE) LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH - NĂM 2022 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH NGUYỄN VĂN VŨ NGHIÊN CỨU BÀO CHẾ VIÊN NANG CỨNG CHỨA BÀO TỬ NẤM LINH CHI (GANODERMA LUCIDUM SPORE) NGÀNH: CÔNG NGHỆ DƯỢC PHẨM VÀ BÀO CHẾ THUỐC MÃ SỐ: 8720202 LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS TRẦN VĂN THÀNH TS NGUYỄN HỮU LẠC THỦY THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH - NĂM 2022 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan luận văn cơng trình nghiên cứu riêng hướng dẫn khoa học PGS.TS Trần Văn Thành TS Nguyễn Hữu Lạc Thủy Các số liệu kết luận văn trung thực chưa cơng bố cơng trình nghiên cứu khoa học Tác giả luận văn NGUYỄN VĂN VŨ TÓM TẮT Luận văn tốt nghiệp thạc sĩ Dược học khóa 2019 – 2021 NGHIÊN CỨU BÀO CHẾ VIÊN NANG CỨNG CHỨA BÀO TỬ NẤM LINH CHI (GANODERMA LUCIDUM SPORE) Nguyễn Văn Vũ Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Trần Văn Thành TS Nguyễn Hữu Lạc Thủy Đặt vấn đề Nấm Linh chi có tên khoa học Ganoderma lucidum (Leyss Ex Fr.) Karst., thuộc họ nấm Lim Ganodermataceae Bộ phận dùng thể hóa gỗ phơi, sấy khô bào tử Linh chi Các nghiên cứu gần chứng minh bào tử có hàm lượng hoạt chất vượt trội so với thể quả; Tác dụng BTLC minh chứng Tuy nhiên nay, thị trường Việt Nam, sản phẩm từ Linh chi chủ yếu sản phẩm bột BTLC dạng thô, dùng cách chế biến truyền thống sắc hay hãm, chưa có sản phẩm bào tử phá vách, chưa có quy trình xử lý nguyên liệu mặt vi sinh (nấm, mốc) thu hoạch bảo quản; chưa có tiêu chuẩn chất lượng kết nghiên cứu độ ổn định nguyên liệu sản phẩm BTLC Vì thế, việc nghiên cứu dạng bào chế từ nguồn nguyên liệu quý giá với với hồ sơ nghiên cứu liệu khoa học đầy đủ thật cần thiết Đối tượng phương pháp nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu Bào tử nấm Linh chi (BTNLC) Ganoderma lucidum (Leyss Ex Fr.) Karst., họ Nấm lim Ganodermataceae thu hoạch từ thể nấm Linh chi, xử lý để phá vách bào tử bảo quản chống ẩm lọ thủy tinh kín Thu hoạch trại nấm Linh chi Vina, quận 12 thành phố Hồ Chí Minh Chuẩn gốc acid ganoderic A (acid GA) (số lơ Gan01/0-8/14, hàm lượng 98,92% tính tính ngun trạng, mua từ Viện kiểm nghiệm thuốc thành phố Hồ Chí Minh) Phương pháp nghiên cứu Thu thập xử lý mẫu từ khảo sát độ ổn định nguyên liệu tương thích với tá dược Xây dựng cơng thức quy trình bào chế viên nang cứng chứa BTLC Xây dựng tiêu chuẩn sở viên nang BTLC với tiêu chí cảm quan, độ rã, độ đồng khối lượng, giới hạn vi sinh vật, định tính định lượng Từ kết kiểm nghiệm, đề xuất tiêu chuẩn sở viên nang cứng BTLC Kết Nghiên cứu thăm dò số công thức để bào chế dạng viên nang cứng Tiến hành nâng cỡ lô sản xuất quy mô 5000 viên, cho thấy công thức khả thi cho sản xuất thực tế Quy trình định lượng acid GA viên nang cứng BTLC phương pháp HPLC lựa chọn ethanol 96% làm dung môi chiết chất điểm acid GA với tỷ lệ bột thuốc: ethanol 96% g : 25 ml để chuẩn bị mẫu thử; phát bước sóng 254 nm; điều kiện sắc ký 0-10 phút chạy isocratic acetonitril – acid phosphoric 0,1% (47:53) Kết thẩm định quy trình định lượng acid GA viên nang đạt yêu cầu tính tương thích hệ thống, độ đặc hiệu, tính tuyến tính với phương trình hồi quy tuyến tính acid GA là: ŷ = 5378x (R2 = 0,9980) Giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng 0,4 1,2 µg/ml Độ xác trung gian 1,74% độ đạt yêu cầu với độ phục hồi khoảng 80-110% Vì vậy, quy trình định lượng đáng tin cậy Việc xây dựng tiêu chuẩn viên nang cứng BTLC thực dựa kết kiểm nghiệm lô viên nang với tiêu chí: Cảm quan, độ đồng khối lượng, độ rã, định tính, định lượng, giới hạn vi sinh vật Kết luận Xây dựng quy trình bào chế cho viên nang cứng BTLC Xây dựng tiêu chuẩn sở viên nang cứng BTLC với tiêu chí cảm quan, độ đồng khối lượng, độ rã, định tính, định lượng, giới hạn vi sinh vật Từ khóa Bào tử linh chi, acid ganoderic A, tiêu chuẩn sở ABSTRACT Graduation thesis of Pharmacy Master’s degree – Academic year 2019-2021 STUDY ON PREPARATION OF HARD CAPSULES CONTAINING SPORODERM-BROKEN SPORES OF GANODERMA LUCIDUM Nguyen Van Vu Instructor: Assoc.Prof Tran Van Thanh Ph.D Nguyen Huu Lac Thuy Introduction Recent research demonstrates that sporoderm-broken spores (BTLC) have a superior activity; The effects of BTLC have been proven However, at present, in the Vietnamese market, products from Lingzhi are mainly products in raw form, using systems such as decoction This study was conducted to establish the quality standards of hard capsules containing BTLC for testing quality and stability assessment Materials and methods Materials: Ganoderma lucidum, treated to break the sporoderm of spores and preserved against moisture in sealed glass jars Harvested at the Linh Chi Vina mushroom farm, District 12, Ho Chi Minh City Acid ganoderic A (GA) (batch: Gan01/0-8/14, content: 98,92%), purchased from National Institute of Drug Quality Control Methods: Collect and handle samples, investigate the stability of raw materials and compatibility with excipients Formulation and preparation process of hard capsules containing BTLC Contribute quality standards for the hard capsules’s criteria such as description, uniformity of weight, disintegration test, microbiological limit, quantitation and qualitation From the test results, recommend the quality level of each criteria Results Exploratory study on some formulations to prepare hard capsules The batch size was carried out on a scale of 5000 capsules, showing a viable formulation for actual production Different contitions for acid GA extraction and HPLC determination from extract of hard capsules was screened and the best condition was selected The HPLC method was validated according to the ICH guidelines on system suitability, specificity, linearity, precision and accuracy The method of sample preparation was optimized using ethanol 96% as a solvent for acid GA ultrasonic extraction in 60 minutes and the ratio of the hard capsules extract and ethanol 96% was at 2:25 (g/ml) The best HPLC condition for determination of acid GA employed a Shim-pack GIST column (250×4.6 mm; μm), a detection wavelength of 254 nm, a column temperature of 30 oC, a flow rate of ml/min, and an injection volume of 10 μl Mobile phase was mixture of acetonitrile and H3PO4 0.1% at a ratio of 47:53 (v/v) There was good correlation between peak areas and acid GA concentrations (r2 = 0.9980) The RSD values of inter-day precision were found to be at 1.74% The recovery percentages were of 80 – 110% From the test results of batches, recommend the suitable criteria Conclusion Developing a manufacturing process for hard capsules containing sporodermbroken spores Built and validated the quantitative evaluation method for acid GA in the hard capsules by HPLC Contribute base standards for the extract’s criteria such as description, uniformity of weight, disintegration test, microbiological limit, quantitation and qualitation Key words: Sporoderm-broken spores, base standards, acid ganoderic A MỤC LỤC MỤC LỤC i DANH MỤC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT .ii DANH MỤC BẢNG iii DANH MỤC HÌNH v ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 NẤM LINH CHI 1.2 BÀO TỬ NẤM LINH CHI 1.3 TỔNG QUAN VỀ DẠNG BÀO CHẾ VIÊN NANG CỨNG 10 1.4 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRONG NƯỚC 12 CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14 2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 14 2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 30 3.1 ĐÁNH GIÁ NGUYÊN LIỆU BTLC ĐÃ PHÁ VÁCH .30 3.2 ĐÁNH GIÁ ĐIỀU KIỆN BẢO QUẢN VÀ LƯU TÍNH NGUYÊN LIỆU BTLC PHÁ VÁCH 31 3.3 XÂY DỰNG CƠNG THỨC VÀ QUY TRÌNH BÀO CHẾ VIÊN NANG CỨNG CHỨA BTLC ĐÃ PHÁ VÁCH 33 3.4 XÂY DỰNG TCCS VIÊN NANG CỨNG BTLC 40 3.5 BÀN LUẬN .59 CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 61 4.1 KẾT LUẬN 61 4.2 ĐỀ NGHỊ 61 TÀI LIỆU THAM KHẢO 62 PHỤ LỤC 66 i DANH MỤC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Từ nguyên Ý nghĩa tiếng Việt BTLC Bào tử nấm Linh chi DĐVN Dược điển Việt Nam EtOH Ethanol HPLC High performance liquid chromatography MeOH Methanol SKLM Sắc ký lớp mỏng TCCS Tiêu chuẩn sở TLTK Tài liệu tham khảo TT Thuốc thử PDA Photodiode Array Dãy diod quang Acid GA Acid Ganoderic A Acid Ganoderic A SEM Scanning electron microscope Kính hiển vi điện tử quét Sắc ký lỏng hiệu cao i DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Hàm lượng hoạt chất thể quả, BTLC BTLC phá vách Bảng 1.2 Dung tích cỡ nang 11 Bảng 1.3 Một số sản phẩm nấm Linh chi thị trường 13 Bảng 2.1 Các điều kiện bảo quản bào tử phá vách 16 Bảng 2.2 Các mức đánh giá khả chảy bột 17 Bảng 2.3 Thành phần công thức khảo sát lựa chọn tá dược độn 19 Bảng 2.4 Thành phần công thức khảo sát lựa chọn tá dược dính 19 Bảng 2.5 Thành phần công thức khảo sát lựa chọn tá dược trơn chảy 20 Bảng 2.6 Khảo sát điều kiện sắc ký để định lượng acdi GA viên nang 21 Bảng 2.7 Nồng độ acid GA đối chiếu khảo sát tính tuyến tính 23 Bảng 2.8 Nồng độ acid GA đối chiếu pha loãng 24 Bảng 2.9 Độ lặp lại độ hồi phục chấp nhận nồng độ khác 24 Bảng 3.10 Hàm lượng acid GA BTLC so với ban đầu (%) sau tháng điều kiện bảo quản khác (n=3) 31 Bảng 3.11 Tương tác BTLC với tá dược dựa hàm lượng acid GA sau tuần bảo quản (n = 3) 31 Bảng 3.12 Lưu tính BTLC (n = 3) 32 Bảng 3.13 Lưu tính BTLC (n = 3) 32 Bảng 3.14 Thành phần công thức khảo sát tỷ lệ tá dược độn (1 viên) 33 Bảng 3.15 Kết khảo sát lựa chọn tỷ lệ tá dược độn (n = 3) 34 Bảng 3.16 Thành phần cơng thức khảo sát tỷ lệ tá dược dính 35 Bảng 3.17 Kết khảo sát lựa chọn tỷ lệ tá dược dính (n = 3) 35 Bảng 3.18 Thành phần công thức khảo sát tỷ lệ tá dược trơn chảy 36 Bảng 3.19 Kết khảo sát lựa chọn tỷ lệ tá dược trơn chảy (n = 3) 36 Bảng 3.20 Thành phần công thức cho viên nang 36 Bảng 3.21 Thành phần công thức cho cỡ lô 5000 viên 37 Bảng 3.22 Kết đánh giá cốm bán thành phẩm lô 01082021 37 Bảng 3.23 Kết độ đồng khối lượng lô 01082021 38 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL.7 Phụ lục Sắc ký đồ định lượng acid GA viên nang BTLC với quy mô lô Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn 3/16/2022 7:42:39 AM Page / Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh Analysis Report Sample Name Sample ID Data Filename Method Filename Batch Filename Vial # Injection Volume Date Acquired Date Processed : lo lan : : lo lan 1.lcd : vien nang bao tu linh chi.lcm : vien nang bao tu linh chi.lcb : 3-10 : 10 uL : 3/14/2022 7:23:47 AM : 3/15/2022 11:30:26 PM Sample Type : Unknown Acquired by Processed by : System Administrator : System Administrator mAU 20.0 PDA Multi 254nm,4nm 15.0 7.419 10.0 5.0 0.0 0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 PDA Ch1 254nm Peak# Ret Time 7.419 Total Area 34597 34597 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn D:\LuudulieuHPLC\Anh Vu\lo lan 1.lcd 3/16/2022 7:43:27 AM Page / Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh Analysis Report Sample Name Sample ID Data Filename Method Filename Batch Filename Vial # Injection Volume Date Acquired Date Processed : lo lan : : lo lan 2.lcd : vien nang bao tu linh chi.lcm : vien nang bao tu linh chi.lcb : 3-11 : 10 uL : 3/14/2022 7:58:55 AM : 3/15/2022 11:31:52 PM Sample Type : Unknown Acquired by Processed by : System Administrator : System Administrator mAU 20.0 PDA Multi 254nm,4nm 15.0 7.439 10.0 5.0 0.0 0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 PDA Ch1 254nm Peak# Ret Time 7.439 Total Area 34589 34589 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn D:\LuudulieuHPLC\Anh Vu\lo lan 2.lcd 3/16/2022 7:44:35 AM Page / Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh Analysis Report Sample Name Sample ID Data Filename Method Filename Batch Filename Vial # Injection Volume Date Acquired Date Processed : lo lan : : lo lan 3.lcd : vien nang bao tu linh chi.lcm : vien nang bao tu linh chi.lcb : 3-12 : 10 uL : 3/14/2022 8:34:03 AM : 3/15/2022 11:33:54 PM Sample Type : Unknown Acquired by Processed by : System Administrator : System Administrator mAU 20.0 PDA Multi 254nm,4nm 15.0 7.447 10.0 5.0 0.0 0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 PDA Ch1 254nm Peak# Ret Time 7.447 Total Area 34781 34781 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn D:\LuudulieuHPLC\Anh Vu\lo lan 3.lcd 3/16/2022 7:45:36 AM Page / Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh Analysis Report Sample Name Sample ID Data Filename Method Filename Batch Filename Vial # Injection Volume Date Acquired Date Processed : lo lan : : lo lan 1.lcd : vien nang bao tu linh chi.lcm : vien nang bao tu linh chi.lcb : 3-13 : 10 uL : 3/14/2022 9:09:11 AM : 3/15/2022 11:35:57 PM Sample Type : Unknown Acquired by Processed by : System Administrator : System Administrator mAU 20.0 PDA Multi 254nm,4nm 15.0 7.443 10.0 5.0 0.0 0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 PDA Ch1 254nm Peak# Ret Time 7.443 Total Area 35102 35102 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn D:\LuudulieuHPLC\Anh Vu\lo lan 1.lcd 3/16/2022 7:47:40 AM Page / Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh Analysis Report Sample Name Sample ID Data Filename Method Filename Batch Filename Vial # Injection Volume Date Acquired Date Processed : lo lan : : lo lan 2.lcd : vien nang bao tu linh chi.lcm : vien nang bao tu linh chi.lcb : 3-14 : 10 uL : 3/14/2022 9:44:19 AM : 3/15/2022 11:37:58 PM Sample Type : Unknown Acquired by Processed by : System Administrator : System Administrator mAU 20.0 PDA Multi 254nm,4nm 15.0 7.452 10.0 5.0 0.0 0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 PDA Ch1 254nm Peak# Ret Time 7.452 Total Area 35986 35986 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn D:\LuudulieuHPLC\Anh Vu\lo lan 2.lcd 3/16/2022 7:50:42 AM Page / Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh Analysis Report Sample Name Sample ID Data Filename Method Filename Batch Filename Vial # Injection Volume Date Acquired Date Processed : lo lan : : lo lan 3.lcd : vien nang bao tu linh chi.lcm : vien nang bao tu linh chi.lcb : 3-15 : 10 uL : 3/14/2022 10:19:27 AM : 3/15/2022 11:37:58 PM Sample Type : Unknown Acquired by Processed by : System Administrator : System Administrator mAU 20.0 PDA Multi 254nm,4nm 15.0 7.457 10.0 5.0 0.0 0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 PDA Ch1 254nm Peak# Ret Time 7.457 Total Area 35077 35077 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn D:\LuudulieuHPLC\Anh Vu\lo lan 3.lcd 3/16/2022 7:52:48 AM Page / Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh Analysis Report Sample Name Sample ID Data Filename Method Filename Batch Filename Vial # Injection Volume Date Acquired Date Processed : lo lan : : lo lan 1.lcd : vien nang bao tu linh chi.lcm : vien nang bao tu linh chi.lcb : 3-16 : 10 uL : 3/14/2022 10:54:35 AM : 3/15/2022 11:39:02 PM Sample Type : Unknown Acquired by Processed by : System Administrator : System Administrator mAU 20.0 PDA Multi 254nm,4nm 15.0 7.461 10.0 5.0 0.0 0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 PDA Ch1 254nm Peak# Ret Time 7.461 Total Area 31049 31049 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn D:\LuudulieuHPLC\Anh Vu\lo lan 1.lcd 3/16/2022 7:55:52 AM Page / Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh Analysis Report Sample Name Sample ID Data Filename Method Filename Batch Filename Vial # Injection Volume Date Acquired Date Processed : lo lan : : lo lan 2.lcd : vien nang bao tu linh chi.lcm : vien nang bao tu linh chi.lcb : 3-17 : 10 uL : 3/14/2022 11:29:43 AM : 3/15/2022 11:41:05 PM Sample Type : Unknown Acquired by Processed by : System Administrator : System Administrator mAU 20.0 PDA Multi 254nm,4nm 15.0 7.466 10.0 5.0 0.0 0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 PDA Ch1 254nm Peak# Ret Time 7.466 Total Area 31226 31226 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn D:\LuudulieuHPLC\Anh Vu\lo lan 2.lcd 3/16/2022 7:58:55 AM Page / Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh Analysis Report Sample Name Sample ID Data Filename Method Filename Batch Filename Vial # Injection Volume Date Acquired Date Processed : lo lan : : lo lan 3.lcd : vien nang bao tu linh chi.lcm : vien nang bao tu linh chi.lcb : 3-18 : 10 uL : 3/14/2022 12:04:51 PM : 3/15/2022 11:45:07 PM Sample Type : Unknown Acquired by Processed by : System Administrator : System Administrator mAU 20.0 PDA Multi 254nm,4nm 15.0 7.479 10.0 5.0 0.0 0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 PDA Ch1 254nm Peak# Ret Time 7.479 Total Area 29983 29983 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn D:\LuudulieuHPLC\Anh Vu\lo lan 3.lcd Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL.8 Phụ lục Tiêu chuẩn sở viên nang cứng BTLC Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh quy trình số: Ấn số: Bản số: ĐẠI HỌC Y DƯỢC TP.HCM TIÊU CHUẨN CƠ SỞ VIÊN NANG CỨNG BTLC Số trang: 1/5 Hiệu lực: ………… YÊU CẦU CHẤT LƯỢNG Cảm quan: Viên nang cứng số 0, màu vàng đen Bên chứa bột màu nâu, mùi thơm dược liệu đặc trưng Độ đồng khối lượng: Không 7,5% (kl/kl) Độ rã: Không 30 phút Định tính: Phương pháp SKLM Trên sắc ký đồ SKLM mẫu thử phải có vết có màu giá trị Rf với vết sắc ký đồ dược liệu đối chiếu bào tử nấm Linh chi Phương pháp HPLC-PAD Trên sắc ký đồ mẫu thử phải có đỉnh thời gian lưu với đỉnh mẫu chất đối chiếu acid Ganoderic A Định lượng: Hàm lượng acid Ganoderic A không thấp 0,006% Giới hạn vi sinh vật: - Tổng số vi sinh vật hiếu khí (CFU/g): khơng q 104 - Tổng số nấm (CFU/g): Không 102 - Tổng số vi khuẩn gram âm dung nạp mật (CFU/g): Không q 102 - Khơng có Salmonella 10 g - Khơng có Escherichia coli g Tn thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh quy trình số: Ấn số: Bản số: ĐẠI HỌC Y DƯỢC TP.HCM TIÊU CHUẨN CƠ SỞ VIÊN NANG CỨNG BTLC Số trang: 2/5 Hiệu lực: ………… QUY TRÌNH PHÂN TÍCH Cảm quan: Kiểm tra cảm quan (thể chất, màu sắc, mùi.), viên nang phải đạt yêu cầu nêu Độ đồng khối lượng: Tiến hành theo DĐVN V, phụ lục 11.3, phương pháp Độ rã: Tiến hành theo DĐVN V, phụ lục 11.6 Giới hạn vi sinh vật: Tiến hành theo DĐVN V, phụ lục 13.6 Định tính Phương pháp SKLM Bản mỏng: Silica gel F254 Dung môi khai triển: Toluen – ethyl acetat – acid formic (6:3:1) Dung dịch thử: Tháo rời hai nửa vỏ nang 15 viên nang, nghiền thành bột mịn, cân xác khoảng g bột thuốc cho vào bình nón nút mài, thêm 25 ml ethanol 96%, siêu âm 60 phút, lọc dịch chiết cho vào chén sứ, cô đến cắn Thêm ml methanol vào chén sứ để hòa tan cắn Mẫu dược liệu bào tử nấm Linh chi: Cân 200 mg bột dược liệu bào tử nấm Linh chi vào bình nón nút mài, thêm 25 ml ethanol 96%, siêu âm 60 phút, lọc dịch chiết cho vào chén sứ, cô đến cắn Thêm ml methanol vào chén sứ để hòa tan cắn Tiến hành: Chấm riêng biệt lên mỏng 10 µl dung dịch Tiến hành triển khai sắc ký đến dung môi khoảng 10 cm Lấy mỏng ra, để khơ nhiệt độ phịng Quan sát ánh sáng tử ngoại bước sóng 254 365 nm Sau phun dung dịch acid sulfuric 10% ethanol (TT), sấy khô 105 oC rõ vết Yêu cầu: Trên sắc ký đồ, dung dịch thử phải có vết màu sắc giá trị Rf với vết dược liệu bào tử nấm Linh chi Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh quy trình số: Ấn số: Bản số: ĐẠI HỌC Y DƯỢC TP.HCM TIÊU CHUẨN CƠ SỞ VIÊN NANG CỨNG BTLC Số trang: 3/5 Hiệu lực: ………… Phương phỏp HPLC Ct: C18 (250 mm ì4,6 mm, àm) Bước sóng phát hiện: 254 nm Tốc độ dịng: ml/phút Thể tích tiêm: 10 µl Pha động: Acetonitril (47%) – dung dịch acid H3PO4 0,1% nước (53%) Dung dịch chất đối chiếu: Cân xác khoảng mg acid Ganoderic A vào bình định mức 25 ml, thêm 23 ml methanol, siêu âm 15 phút, để nguội, bổ sung methanol đến vạch, lắc đều, lọc qua màng lọc 0,22 μm Dung dịch thử: Tháo rời hai nửa vỏ nang 15 viên nang, nghiền thành bột mịn, cân xác khoảng g bột thuốc cho vào bình định mức 25 ml Thêm 23 ml ethanol 96%, siêu âm 60 phút, để nguội đến nhiệt độ phòng, bổ sung ethanol đến vạch, lắc đều, lọc qua màng lọc 0,22 µm Yêu cầu: Trên sắc ký đồ, dung dịch thử phải có đỉnh cừng thời gian lưu với đỉnh chất đối chiếu acid Ganoderic A Định lượng Tiến hành phương pháp HPLC Điều kiện sắc ký: Ct: C18 (250 mm ì4,6 mm, àm) Bc sóng phát hiện: 254 nm Tốc độ dịng: ml/phút Thể tích tiêm: 10 µl Pha động: Acetonitril (47%) – dung dịch acid H3PO4 0,1% nước (53%) Dung dịch chuẩn: Cân xác khoảng mg acid Ganoderic A vào bình định mức 25 ml, thêm 23 ml methanol, siêu âm 15 phút, để nguội, bổ sung methanol đến vạch, lắc đều, lọc qua màng lọc 0,22 μm Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh quy trình số: Ấn số: Bản số: ĐẠI HỌC Y DƯỢC TP.HCM TIÊU CHUẨN CƠ SỞ VIÊN NANG CỨNG BTLC Số trang: 4/5 Hiệu lực: ………… Dung dịch thử: Tháo rời hai nửa vỏ nang 15 viên nang, nghiền thành bột mịn, cân xác khoảng g bột thuốc cho vào bình định mức 25 ml Thêm 23 ml ethanol 96%, siêu âm 60 phút, để nguội đến nhiệt độ phòng, bổ sung ethanol đến vạch, lắc đều, lọc qua màng lọc 0,22 µm Cách tiến hành: Tiêm riêng biệt dung dịch chuẩn, dung dịch thử Dựa vào diện tích pic thu dung dịch thử, dung dịch chuẩn nồng độ acid Ganoderic A dung dịch chuẩn, tính hàm lượng (%) acid Ganoderic A viên nang cứng theo công thức: Hàm lượng acid Ganoderic A (%) viên nang tính theo cơng thức: 𝑋 (%) = 𝑆𝑡 × 𝐶 × 25 × a × 100 𝑆𝑐 × 𝑚𝑡 × 1000 St, Sc : Diện tích pic acid Ganoderic A mẫu thử mẫu chất đối chiếu C : Nồng độ dung dịch acid Ganoderic A đối chiếu (µg/ml) mt : Khối lượng cân mẫu thử (đã trừ độ ẩm) (mg) a : Hàm lượng acid Ganoderic A đối chiếu Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn