Nghiên cứu điều chế thuốc nhỏ tai chứa tinh dầu hương nhu trắng

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH TRƯƠNG NGỌC HÂN NGHIÊN CỨU ĐIỀU CHẾ THUỐC NHỎ TAI CHỨA TINH DẦU HƯƠNG NHU TRẮNG LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH, NĂM 2022 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH TRƯƠNG NGỌC HÂN NGHIÊN CỨU ĐIỀU CHẾ THUỐC NHỎ TAI CHỨA TINH DẦU HƯƠNG NHU TRẮNG NGÀNH: CÔNG NGHỆ DƯỢC PHẨM VÀ BÀO CHẾ THUỐC MÃ SỐ: 8720202 LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS TRẦN VĂN THÀNH TS NGUYỄN VŨ GIANG BẮC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH, 2022 MỤC LỤC DANH MỤC BẢNG i DANH MỤC HÌNH ẢNH iii DANH MỤC KÍ HIỆU VÀ TỪ VIẾT TẮT iv ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan bệnh nấm tai 1.2 Tổng quan tinh dầu Hương Nhu Trắng 1.3 Tổng quan thuốc nhỏ tai 11 CHƯƠNG PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 13 2.1 Đối tượng nghiên cứu 13 2.2 Nguyên vật liệu nghiên cứu 13 2.3 Phương pháp nghiên cứu 14 CHƯƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 26 3.1 Khảo sát thành phần thuốc nhỏ tai chứa tinh dầu HNT 26 3.2 Công thức bào chế thuốc nhỏ tai chứa tinh dầu HNT 39 Công thức chọn 39 3.3 Đánh giá khả kháng nấm chế phẩm 40 3.4 Xây dựng quy trình định lượng thẩm định thuốc nhỏ tai chứa tinh dầu HNT 42 CHƯƠNG BÀN LUẬN 51 4.1 Xây dựng công thức quy trình bào chế : 51 4.2 Đánh giá khả kháng nấm chế phẩm 53 4.3 Xây dựng quy trình định lượng Eugenol chế phẩm phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao 54 CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 55 5.1 Kết luận : 55 5.2 Đề nghị 55 TÀI LIỆU THAM KHẢO LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu tơi Các số liệu, kết nêu luận văn trung thực chưa cơng bố cơng trình khác Luận văn Thạc sĩ dược học – Năm học 2020-2022 NGHIÊN CỨU ĐIỀU CHẾ THUỐC NHỎ TAI CHỨA TINH DẦU HƯƠNG NHU TRẮNG Trương Ngọc Hân Người hướng dẫn: PGS TS Trần Văn Thành TS Nguyễn Vũ Giang Bắc TÓM TẮT Mở đầu : Đề tài nhằm xây dựng cơng thức quy trình bào chế thuốc nhỏ tai chứa Tinh dầu Hương nhu trắng (HNT), đánh giá khả kháng nấm chế phẩm Đối tượng phương pháp nghiên cứu : Khảo sát khả hoà tan tinh dầu vào nước loại/nồng độ chất diện hoạt khảo sát dựa độ dung dịch, xác định nồng độ tinh dầu HNT có khả kháng nấm dựa thử nghiệm vi sinh, khảo sát chất tạo độ nhớt chất điều chỉnh pH phù hợp với dung dịch tinh dầu HNT Đánh giá hoạt tính kháng nấm chế phẩm phương pháp khuếch tán đĩa thạch Xây dựng thẩm định quy trình định lượng Eugenol thuốc nhỏ tai dung dịch tinh dầu HNT phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) Kết : Công thức thuốc nhỏ tai chứa tinh dầu HNT với tỷ lệ thành phần: tinh dầu HNT 6%, Tween 20 23,8%, PVP K30 1%, HCl 0,01 N vừa đủ pH 3-4 nước cất đạt độ trong, có khả kháng nấm chủng : A flavus, A niger A terreus Quy trình định lượng Eugenol chế phẩm thẩm định đạt tính đặc hiệu, tính tuyến tính, độ độ xác Thành phẩm có màu vàng nhạt, suốt, có mùi đặc trưng tinh dầu HNT, pH 3-4; có hàm lượng 4,53 % Eugenol chế phẩm Kết luận : Đề tài xây dựng cơng thức quy trình điều chế thuốc nhỏ tai chứa tinh dầu HNT 6% có khả kháng loại vi nấm A.flavus, A.niger A terreus Từ khoá : thuốc nhỏ tai, tinh dầu Hương nhu trắng, eugenol Master thesis: 2020 - 2022 FORMULATION OF EAR DROPS CONTAINING OCIMUM GRATISSIMUM ESSENTIAL OILS Truong Ngoc Han Supervisor : Assoc Prof Tran Van Thanh Dr Nguyen Vu Giang Bac Objective : The study was carried out to develop the formula and manufacturing process of ear drops containing Ocimum gratissimum essential oil that having the antifungal ability Methods : Evaluating the effect of surfactants to dissolve Ocimum gratissimum essential oils in water based on transparency of formulation; determining the concentration of Ocimum gratissimum essential oils with antifungal properties based on microbiological test, choosing the appropriate viscosity-increasing agents and pH modifier Then, the manufacturing process of ear drops formulation was developped Evaluating antifungal activity of the product by disk diffusion method Developing and validating the assays method of Eugenol in the product by HighPerformance Liquid Chromatography (HPLC) Results : The final formula of ear drops including: Ocimum gratissimum essential oils of 6%, Tween 20 of 23,8%, PVP K30 of 1%, HCl 0,01 N (pH 3-4) and q.s.p distilled water The antifungal ability of the products is shown on strains of fungi : A flavus, A.niger and A.terreus The assays method of Eugenol in this product was validated for specificity, linearity, accuracy and precision The finished product is yellowish, transparent with the characteristic odor of Ocimum gratissimum essentail oils, has pH value of 3-4, contains 4,53 % of Eugenol Conclusion :The study was developed the formula and manufacturing process of ear drops containing 6% of O.gratissimum which has antifungal activity on strains of fungi : A.flavus, A.niger and A.terreus Keywords : ear drops, Ocimum gratissimum essential oils, eugenol i DANH MỤC BẢNG Bảng 1 Thuốc điều trị nhiễm nấm tai Bảng Danh mục nguyên liệu sử dụng nghiên cứu 13 Bảng 2 Thiết bị sử dụng đề tài 14 Bảng Đánh giá mức độ kháng vi sinh vật chất thử có nguồn gốc thực vật dựa đường kính kháng nấm 18 Bảng Tỷ lệ chất tạo độ nhớt khảo sát công thức 19 Bảng Pha dãy dung dịch chuẩn Eugenol 24 Bảng Khả hòa tan tinh dầu vào nước Tween 80 27 Bảng Khả hòa tan tinh dầu vào nước Tween 20 28 Bảng 3 Khả hòa tan tinh dầu vào nước Kolliphor RH 40 29 Bảng Khả hòa tan tinh dầu vào nước Kolliphor HS 15 30 Bảng Kết khảo sát độ bền vật lý dung dịch tinh dầu, chất diện hoạt nước 31 Bảng Công thức khảo sát khả tải tinh dầu HNT 32 Bảng Đường kính kháng nấm công thức khảo sát 33 Bảng Các công thức chọn để khảo sát độ tan chất tạo độ nhớt 36 Bảng Cơng thức đánh giá phân bố kích thước giọt 37 Bảng 10 Kết đo phân bố kích thước giọt cơng thức 37 Bảng 11 Hàm lượng Eugenol mẫu có khơng có PVP K30 thời điểm tuần sau tuần 38 Bảng 12 Đường kính vịng kháng nấm thuốc nhỏ tai chứa tinh dầu HNT 40 Bảng 13 Kết định lượng Eugenol trng thuốc nhỏ tai chứa tinh dầu HNT (n =3) 42 ii Bảng 14 Bảng kết diện tíc pic từ 06 lần tiêm dung dịch chuẩn 43 Bảng 15 Thời gian lưu diện tích pic sắc ký đồ mẫu chuẩn mẫu thử 45 Bảng 16 Sự tương quan nồng độ Eugenol diện tích pic 45 Bảng 17 Kết xử lý thống kê 46 Bảng 3.18 Kết khảo sát độ quy trình định lượng Eugenol chế phẩm 47 Bảng 19 Kết tính tương thích hệ thuống quy trình định lượng Eugenol chế phẩm 48 Bảng 20 Kết khảo sát độ xác trung gian quy trình định lượng Eugenol chế phẩm 49 Bảng 21 Kết khảo sát độ lặp lại quy trình định lượng chế phẩm 50 iii DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 1 Loa tai lỗ tai ngồi người trưởng thành Hình Cấu trúc tai Hình Cấu trúc tai hệ thống tiền đình Hình Mức độ đánh giá cảm quan 16 Hình 2 Lưu đồ bào chế thuốc nhỏ tai chứa tinh dầu HNT 21 Hình Sắc ký đồ của: mẫu khơng có PVP thời điểm tuần(A) sau tuần (B) mẫu có PVP thời điểm tuần (C) sau tuần (D) 38 Hình Lưu đồ điều chế thuốc nhỏ tai chứa Tinh dầu HNT 6% 40 Hình 3 Khả kháng nấm chế phẩm chủng nấm 41 Hình Sắc ký đồ dung dịch tương thích hệ thống 43 Hình Sắc ký đồ: (A) mẫu placebo, (B) mẫu chuẩn, (C) Sắc ký đồ mẫu thử, (D) kiểm tra độ tinh khiết pic Eugenol mẫu thử 44 Hình Đồ thị biểu diễn mối tương quang tuyến tính nồng độ Eugenol diện tích pic 46 iv DANH MỤC KÍ HIỆU VÀ TỪ VIẾT TẮT Từ viết tắt Tiếng Anh Tiếng Việt A.flavus Aspergillus flavus A.fumigatus Aspergillus fumigatus A.nidulans Aspergillus nidulans A.niger Aspergillus niger A.terreus Aspergillus terrerus DIZ Diameter of inhibition zone Đường kính vùng ức chế HPLC High Performance Liqid Sắc ký lỏng hiệu cao Chromatography HPMC Hydroxypropyl methylcellulose MFC Minimum Fungicidal Nồng độ diệt nấm tối thiểu Concentration MIC Minimum Inhibitory Concentration Na CMC Natri Carboxymethylcellulose O.gratissimum Ocimum gratissimum PdI Poly dispersity index Rf RI Nồng độ ức chế tối thiểu Chỉ số phân bố kích thước Hệ số di chuyển Retention Index Chỉ số lưu TT Thuốc thử tt/tt Thể tích/thể tích w/v weight/volume Khối lượng/thể tích ĐẶT VẤN ĐỀ Nấm tác nhân gây bệnh phổ biến giới, đặc biệt vùng thể có tiếp xúc trực tiếp với môi trường sống như: da, niêm mạc (hầu họng, lưỡi) móng, tai Trong đó, nấm tai thường gặp nhiễm nấm bán cấp mãn tính ống tai ngồi, gây ảnh hưởng nghiêm trọng đến tai giữa, gây ảnh hưởng đến thính lực gây điếc khơng điều trị Bệnh nấm tai phát nhiều quốc gia có khí hậu nhiệt đới cận nhiệt đới Brazil, Việt Nam…1,2,3 Hai chủng nấm thường gặp nấm tai Aspergillus Candida spp Lựa chọn điều trị chỗ ưu tiên sử dụng4 tính hiệu an tồn, bao gồm: (i) thứ dung dịch nhỏ tai có chứa acid acetic/propylen glycol, (ii) thứ hai clotrimazole (iii) cuối nystatin Dạng dung dịch thường lựa chọn cấu trúc tai có nhiều góc nhỏ khó tiếp xúc nên dạng dung dịch với độ nhớt phù hợp giúp dễ chảy phủ bề mặt diện tích bên lỗ tai Theo bác sĩ điều trị bệnh nấm tai, tỷ lệ vận động viên bơi lội bị nhiễm nấm tai cao Hiện nay, phương pháp điều trị dùng tân dược thường mang đến số tác dụng phụ Ví dụ dùng dung dịch acid boric để lại tinh thể boric kết tinh trắng bên lỗ tai thường gây kích ứng sử dụng Do đó, bác sĩ mong muốn ngành dược phát triển thêm sản phẩm nhỏ tai kháng nấm với tác dụng phụ Xu hướng sử dụng tinh dầu việc điều trị bệnh liên quan đến nấm ngày ưa chuộng an tồn gần chưa phát vấn đề đề kháng thuốc Tinh dầu Hương nhu trắng (HNT) chiết xuất từ HNT (Ocimum gratissimum L.), thuộc họ Lamiaceae (họ Bạc Hà), hoạt chất tiềm việc ức chế diệt các chủng nấm Eugenol xác định thành phần có hoạt tính kháng nấm tinh dầu HNT, việc đánh giá hàm lượng tinh dầu HNT thường quy định lượng hàm lượng eugenol Kết tra khảo tài liệu nhóm nghiên cứu cho thấy việc sử dụng tinh dầu Hương nhu trắng làm thuốc nhỏ tai chưa công bố cơng trình nghiên cứu trước Do đó, để góp phần làm phong phú thêm lựa chọn điều trị cho bệnh nhân Việt Nam, bước đầu nghiên cứu chế phẩm thuốc nhỏ tai thực thông qua đề tài “Nghiên cứu điều chế dung dịch nhỏ tai chứa tinh dầu Hương nhu trắng” Mục tiêu tổng quát đề tài là: Nghiên cứu công thức điều chế đánh giá tác dụng kháng nấm in vitro dung dịch nhỏ tai chứa tinh dầu Hương nhu trắng Các mục tiêu cụ thể bao gồm : Xây dựng cơng thức quy trình bào chế thuốc nhỏ tai chứa tinh dầu Hương nhu trắng dạng dung dịch Đánh giá hoạt tính kháng nấm thuốc nhỏ tai dung dịch chứa tinh dầu Hương nhu trắng Xây dựng thẩm định phương pháp định lượng Eugenol tinh dầu dung dịch tinh dầu Hương nhu trắng CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan bệnh nấm tai 1.1.1 Cấu trúc sinh lý tai Tai chuỗi cấu trúc nhỏ, phức tạp liên kết với để trì cân người cảm giác thính giác Để miêu tả cấu trúc chức năng, tai thường tách thành phần riêng biệt tai ngồi, tai giữa, phận thính giác tiền đình tai 1.1.1.1 Tai ngồi Tai ngồi bao gồm phần tai nhìn thấy (loa tai), lỗ tai ống tai dẫn đến màng nhĩ Tai bao gồm : loa tai ống tai ngồi Hình dạng loa tai cho phép dẫn sóng âm vào quan thính giác bên Các nếp gấp khác cấu trúc loa tai khuếch đại số thành phần tần số cao âm Nó giúp xác định âm mặt phẳng thẳng đứng Khi âm chạm vào loa tai từ xuống, đường chúng đến phần lỗ tai khác độ dài thời gian đến lỗ tai Cấu trúc nếp gấp đảm bảo chức hoạt động lỗ tai để thuốc tiếp xúc tồn diện tích cần điều trị cần lựa chọn dạng bào chế phù hợp Cấu trúc tai ngồi trình bày Hình 1.1 Hình 1 Loa tai lỗ tai người trưởng thành Helix – Sụn vành tai; Darwen’s tubercle – Sụn tai Darwen; Concha – Loa tai, Antitragus – Gờ đối bình tai; Lobule – dái tai; Triangular fossa – hố tam giác; External auditory meatus – Lỗ tai ngồi; Tragus – Bình tai; Inter-tragal notchđiểm khuyết phần bình tai 1.1.1.2 Tai Đây khơng gian chứa đầy khơng khí phần xương thái dương Chức tai truyền dao động âm khơng khí màng nhĩ đến dịch tai cửa sổ tiền đình Tai có chức thiết bị trở kháng để ngăn chặn tiếng vang Tai bao gồm màng nhĩ, quầng thính giác, ống Eustachian, tế bào xương chũm tai Cấu trúc tai trình bày Hình 1.2 Hình Cấu trúc tai Tympanic membrane – Màng nhĩ; Round window – cửa sổ ốc tai ; Stapedius muscle – Cơ bàn đạp ; Eustachian tube - ống Eustachian; Ligaments- dây chằng 1.1.1.3 Tai Tai ống có hình dạng phức tạp nằm lơ lửng ống xương – mê đạo Tai có chức Chức dẫn truyền áp lực âm thành xung thần kinh thính giác Chức thứ hai trì cố định thị giác có chuyển động giúp trì thẳng đứng tư Điều xảy hệ thống tiền đình Tai bao gồm: ốc tai, quan thăng bằng, dịch ốc tai, dây chằng xoắn ốc Cấu trúc tai trình bày Hình 1.3 Hình Cấu trúc tai hệ thống tiền đình Semicircular ducts - ống bán khuyên màng (Anterior- mặt trước; Lateral- mặt bên; Posterior-mặt sau); Vestibular duct- Ống tiền đình; Cochlear duct - Ống ốc tai, Tympanic duct- Ống màng nhĩ; Cochlea- Ốc tai; Cristae within ampullae- mào bóng tai; Utricle – xoang nang; Saccul – tiểu nang; Vestibulocochlear nerve – thần kinh tiền đình ốc tai 1.1.1.4 Hệ thống tiền đình Bao gồm ba ống bán khuyên màng, tiểu nang thông nang, dây thần kinh số Ba dây thần kinh sọ thứ tám dây thần kinh riêng biệt Có hai dây thần kinh tiền đình (trên dưới) dây thần kinh ốc tai Chúng chạy với qua hộp sọ ống tai Ống chứa dây thần kinh thứ (dây thần kinh mặt) cung cấp máu cho tai – động mạch tai Các dây thần kinh qua màng não đến thân não Do đó, sản phẩm thuốc nhỏ tai cần đạt tiêu giới hạn vi sinh vật 1.1.2 Đặc điểm bệnh nấm tai Nấm tai bệnh nhiễm trùng nấm ống tai ngồi, tìm thấy khắp nơi giới tập trung với tần suất cao vùng khí hậu nhiệt đới nóng ẩm Andrall Gaverret người mô tả chi tiết nhiễm trùng nấm tai Ở vùng nhiệt đới, bệnh nấm tai chiếm tới 30% số bệnh nhân mắc bệnh tai có triệu chứng, tình trạng phổ biến khí hậu ơn đới (chỉ chiếm 9% trường hợp viêm tai ngoài) 7,8 Nấm mốc nấm men thường phát bệnh nhân nấm tai Hầu hết tất ca bệnh nấm tai nhóm Aspergillus Candida gây Aspergillus Candida có ảnh hưởng đến trình viêm tai Độ pH ống tai thơng thường có tính acid (pH từ đến 7), điều kiện gây bệnh tối ưu Aspergillus spp Các chủng Aspergillus chủ yếu phân lập từ tai Aspergillus niger, A.fumigatus, A.flavus, A.nidulans, A.terreus Trong đó, A.niger A.flavus hai chủng thường gặp tiếp đến chủng Candida spp Ngồi ra, cịn có chủng nấm khác Penicillium, Mucor Rhizopus 8,9,6 1.1.3 Triệu chứng bệnh nấm tai Các triệu chứng viêm tai nấm vi khuẩn thường phân biệt Các triệu chứng bật bệnh nấm tai gây đau, ngứa tiết dịch, sau thính giác đầy tai Ù tai triệu chứng không thường xuyên xuất Trong 90% trường hợp, có tai bị ảnh hưởng Khám nội soi thường phát diện mảnh vụn ống tai có máu ban Trong nhiễm trùng mãn tính, thay đổi chàm lichen hố ống tai trở nên rõ rệt 7,10 1.1.4 Điều trị bệnh nấm tai Làm ống tai dùng thuốc thường xuyên làm nhiễm trùng Tuy nhiên, trường hợp nhiễm trùng nguyên phát dai dẳng cần dùng thuốc kháng nấm 10 Đa số điều trị nấm tai điều trị chỗ Thuốc kháng nấm toàn thân yêu cầu 11 Một số chế phẩm điều trị nhiễm nấm tai trình bày Bảng 1.1 Bảng 1 Thuốc điều trị nhiễm nấm tai Sản phẩm Thành phần kháng nấm Dung dịch nhỏ tai Domeboro Acid acetic 2% Acid boric Dung dịch nhỏ tai VoSol Acetic acid 2% Lotion Fungizone Amphotericin B (3%) Thimerosal Dung dich Lotrimin Clotrimazol Dung dịch Mycelex Clotrimazol Dung dịch Cresylate m- Cresyl acetat (25%) Dung dịch thuốc tím Tím tinh thể (1%) Merthiolate Thimerosal (0,1%) Lotion Monistat-Derm Miconazol Hỗn dịch Nystatin Nystatin (100,000 U/mL) 1.2 Tổng quan tinh dầu Hương Nhu Trắng 1.2.1 Đặc điểm Hương Nhu Trắng Tên khoa học : Ocimum gratissimum L, họ Bạc hà (Lamiaceae) Tên gọi khác : É trắng Bộ phận dùng : Đoạn đầu cành có khơng có hoa Đặc điểm mơ tả: Đoạn đầu thân cành có thiết diện vng mặt ngồi màu xanh nhạt hay trắng, có nhiều lông Lá mọc đối chéo chữ thập, cuống dài đến cm Phiến hình trứng nhọn, mép có cưa, mặt màu xanh lục, mặt màu nhạt hơn, phủ lông mịn Hoa xim co đầu cành, mẫu có hoa Quả bế, với bốn phân đựng đài tồn Tồn có mùi thơm đặc trưng, vị cay tê 12 1.2.2 Đặc điểm tinh dầu Hương Nhu Được chiết xuất từ cành mang lá, hoa, Hương Nhu trắng (HNT) phương pháp cất kéo nước 13 1.2.2.1 Tính chất tinh dầu Hương nhu Trắng Chất lỏng trong, màu vàng nhạt Mùi thơm đặc trưng, vị cay nồng, nếm có cảm giác tê lưỡi Dễ tan ethanol, ether acid acetic băng Thực tế không tan nước Tỷ trọng : Ở 20oC : từ 1.030 đến 1.050 1.2.2.2 Phương pháp định tính định lượng • Định tính 13 Phương pháp sắc ký lớp mỏng Bản mỏng : Silicagel G Dung môi khai triển : Toluen – Ethyl acetat (9:1) Dung dịch thử : Dung dịch tinh dầu 0.1 % cloroform Dung dịch đối chiếu : Dùng Eugenol chuẩn tinh dầu HNT (mẫu chuẩn) làm dung dịch đối chiếu với nồng độ tương dung dịch thử Cách tiến hành : Chấm riêng biệt lên mỏng 20 μl dung dịch trên, triển khai sắc ký đến dung môi khoảng 10 cm, lấy mỏng ra, để khơ nhiệt độ phịng, phun dung dịch sắt (III) clorid (TT) 3% Quan sát ánh sáng thường Trên sắc ký đồ, dung dịch thử xuất vết màu nâu sẫm với gía trị Rf khoảng 0,81 – 0,82 tương ứng với vết Eugenol, dung dịch thử dung dịch đối chiếu xuất vết có màu sắc giá trị Rf • Định lượng 13 Đánh giá hàm lượng tinh dầu thơng qua hàm lượng Eugenol có tinh dầu Sử dụng phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao Điều kiện sắc ký: Cột C18 (250 mm x 4,6 mm; µm), nhiệt độ phịng (25 ± 5°C) Detector quang phổ tử ngoại khả kiến đo bước sóng 282 nm Tinh dầu phải chứa 60 % (thể tích/thể tích) Eugenol (C10H12O) (theo Dược điển Việt Nam V) 1.2.3 Thành phần tinh dầu Hương nhu trắng Lemos cộng (2005) phân tích mẫu tinh dầu HNT thu hái từ Brazil tìm thành phần chứa Eugenol (57,82%), αbisabolene (17,19 %) and thymol (9,8 %) 14 Sesou cộng phân tích mẫu tinh dầu hương nhu Benin cho thấy thành phần chủ yếu tinh dầu HNT thymol (28,1%), γ-terpine (21.30%) p-cymene (16,5%) Những thành phần phụ khác bao gồm mycrene (7,2%), α-thujene (5,8%) and limonene (2,5%) 15 Matayosh tìm thấy Eugenol (68,81%) methyl eugenol (13,21%) thành phần tinh dầu HNT Kenya 16 Kết phân tích tinh dầu P.N.T Dung cộng (2021) từ tỉnh Thái Bình, cho thấy thành phần Eugenol (65,13%), tiếp sau Germacrene D (12,03%) 17 Tỷ lệ phần trăm thành phần hoá học tinh dầu tuỳ thuộc vào vị trí địa lý khác Thành phần tinh dầu dễ bị ảnh hưởng khí hậu, thời tiết loại đất định chất lượng tinh dầu Mùa thời gian thu hoạch làm thay đổi mùi tinh dầu 18 1.2.4 Tác dụng dược lý tinh dầu Hương nhu trắng 1.2.4.1 Tác dụng kháng khuẩn Tinh dầu HNT ức chế Staphylococcus aureus nồng độ (0,75 mg/ml) Tinh dầu hoạt động chống lại vi khuẩn họ Enterobacteruaceae 10 Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) Shigelle flexineri, viêm ruột Salmonella, Escherichia coli, Klebsiella sp Proteus nồng độ khác từ đến 12 µg/ml Hợp chất có tính kháng khuẩn tinh dầu HNT xác định Eugenol.19 1.2.4.2 Tác dụng kháng nấm Tinh dầu HNT có đặc tính kháng nấm mạnh Có nhiều nghiên cứu khác cung cấp chứng việc sử dụng dầu thực vật việc ức chế Candida albicans, sinh vật gây nhiễm trùng da người nấm mốc Aspergillus bao gồm A.flavus, A.fumigatus A.niger 20,21,22,23 Lima cộng (1993) thử nghiệm hoạt tính kháng nấm 13 loại tinh dầu thu từ thực vật Trong số loại tinh dầu thử nghiệm, tinh dầu HNT có tác động mạnh nhất, ức chế 80% chủng nấm thử nghiệm tạo vùng có đường kính lớn 10 mm 24 Nakaruma cộng (2004) phân tích tinh dầu HNT có tác dụng kháng nấm chủng Candida gồm Candida albicans, C.tropicalis, C.parapsilosis C.krusei Nghiên cứu tìm tác dụng kháng nấm tinh dầu HNT, chế hoạt động chưa xác định 22 Nồng độ ức chế tối thiểu tinh dầu HNT cho chủng nấm C.albicans 50 mg/ml 25 Tinh dầu HNT ức chế phát triển loại nấm khác Botryosphaeria rhodina, Rhizoctonia sp chủng loài Alternaria Penicillum chryssogenum 1.2.4.3 Tác dụng chống oxy hoá Tinh dầu HNT cho thấy hoạt động chống oxy hố mạnh lượng Eugenol cao Khả chống oxy hoá tinh dầu HNT tác dụng hiệp lực diện thành phần phenol khác cis-sabinene hydrate, trans-sabinene hydrate, terpine-4-ol, a-terpineol, thymol, carvacrol 11 epi-cubebol diện với hàm lượng nhỏ (2,1% tổng lượng tinh dầu) Do đó, tinh dầu HNT cho thấy đặc tính chống oxy hố tốt eugenol ngun chất 26 1.2.4.4 Tác dụng ống tiêu hoá Tác dụng giãn tinh dầu HNT tác động trực tiếp lên trơn hồi tràng tác động gián tiếp lên giải phóng chất dẫn truyền thần kinh Ngồi ra, tinh dầu HNT cịn đảo ngược hồn tồn co thắt Acetylcholine gây Tá dụng giãn cho hiệu tổng hợp nhiều thành phần tinh dầu.27 1.2.4.5 Khả kích ứng tinh dầu HNT Nhiễm độc cấp tính qua đường miệng cận mãn tính phúc mạc tinh dầu HNT nghiên cứu Thử nghiệm độc tính cấp cận mãn tính với dạng nhũ tương 4% tt/tt chuột cống chuột nhắt tiến hành Nghiên cứu cho thấy tinh dầu HNT có khả gây phản ứng viêm chuyển từ cấp tính sang mãn tính sử dụng liên tục Tinh dầu HNT dung nạp tốt uống cần xem xét tiềm độc tính dùng lâu dài 28 1.3 Tổng quan thuốc nhỏ tai 1.3.1 Định nghĩa thuốc nhỏ tai Là dung dịch chứa nhiều dược chất chất lỏng thích hợp để đưa vào hốc tai không gây áp lực có hại lên màng nhĩ Có thể thêm tá dược để điều chỉnh độ đẳng trương, độ nhớt, điều chỉnh hay ổn định pH, làm tăng tính tan dược chất hoăc ổn định chế phẩm Các tác dược không làm giảm tác dụng trị liệu thuốc hay gây độc tính gây kích ứng chỗ nồng độ sử dụng 29,30 12 Trừ có dẫn khác, thuốc nhỏ tai có chất dẫn nước đóng gói lọ chứa đa liều phải cho thêm vào chất bảo quản nồng độ thích hợp trừ thân chế phẩm có tính sát khuẩn 29,30 1.3.2 Một số nghiên cứu thuốc nhỏ tai Do cấu trúc thuốc nhỏ tai không khác biệt với dạng dung dịch hỗn dịch lỏng khác, nên nghiên cứu chuyên biệt thuốc nhỏ tai công bố riêng Hoạt chất nghiên cứu thuốc nhỏ tai chủ yếu hướng đến tác dụng chỗ kháng viêm, kháng khuẩn, kháng nấm Hai nghiên cứu thuốc nhỏ tai trình bày tóm tắt bên Dung dịch nhỏ tai Flucionlone acetonide Năm 2015, Ruiz I Pol cộng công bố nghiên cứu dung dịch nhỏ tai Fluocinolone Acetonide Đây chế phẩm nhỏ tai vô trùng không chứa chất bảo quản dạng dung dịch nước bao gồm: 0,01-0,1% (w/v) (kl/tt) Fluocinolone Acetonide, tuỳ chọn kết hợp với 0,1 – 0,8% Ciprofloxacin; chất hoạt động bề mặt khơng ion hố (polysorbat 80); chất điều chỉnh trương lực (glycerin) chất tăng độ nhớt (Povidon K 90F) Chế phẩm sử dụng để ngăn ngừa điều trị viêm tai, kèm theo nhiễm trùng vi khuẩn cho việc dùng thuốc từ lọ chứa sử dụng lần.31 Dung dịch nhỏ tai chứa Moxifloxacin hydroclorid Dexamethasone phosphate Singhl cộng công bố nghiên cứu công thức dung dịch nhỏ tai chứa Moxifloxacin hydrochloride Dexamethasone phosphat Chế phẩm bào chế dạng dung dịch nước Là chế phẩm dung dịch đa liều Thành phần dung dịch nhỏ tai bao gồm Moxifloxacin hydrochloride, dexamethasone phosphate, edetate dinatri (EDTA), chất ion hoá điều chỉnh trương lực (acid boric), chất hoạt động bề mặt khơng ion hố, benzalkonium clorua, sorbitol Chế phẩm có độ pH từ 7.5-8 32 13 CHƯƠNG PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng nghiên cứu Dung dịch nhỏ tai chứa tinh dầu Hương nhu trắng 2.2 Nguyên vật liệu nghiên cứu 2.2.1 Nguyên liệu Các nguyên liệu hoá chất, dung mơi sử dụng nghiên cứu trình bày Bảng 2.1 Bảng Danh mục nguyên liệu sử dụng nghiên cứu STT Nguyên liệu Tiêu chuẩn Nguồn gốc Tinh dầu HNT TCCS Việt Nam Tween 80 TCCS Trung Quốc Tween 20 TCCS Trung Quốc Kolliphor RH 40 USP 43 Mỹ Kolliphor HS 15 USP 43 Mỹ HPMC E15 TCCS Việt Nam Natri CMC TCCS Việt Nam PVP K30 TCCS Việt Nam Hydroclorid 0,01 N TCCS Việt Nam 10 Eugenol chuẩn TCCS Mỹ 11 Nước cất TCCS Việt Nam Các chủng nấm : A niger, A.flavus, A terreus phân lập, định danh lưu trữ, cung cấp môn Vi ký sinh, Khoa Dược, Đại học Y Dược thành phố Hồ Chí Minh Các mơi trường ni cấy cung cấp môn Vi ký sinh, Khoa Dược, Đại học Y Dược thành phố Hồ Chí Minh 14 2.2.2 Trang thiết bị Các trang thiết bị sử dụng nghiên cứu trình bày Bảng 2.2 thiết bị khác nuôi cấy vi sinh môn Vi ký sinh, Khoa Dược, Đại học Y Dược thành phố Hồ Chí Minh Bảng 2 Thiết bị sử dụng đề tài STT Tên thiết bị Mã số Nguồn gốc Bể siêu âm Sonorex Super RK 510H Đức Cân phân tích Satorius – CPA 224S Đức Cân kỹ thuật Satorius Đức Máy lắc xoáy Labnet Mỹ Máy đo pH Mettler Toledo Thuỵ Sĩ Máy khuấy từ Stuart CB 162 Đức Máy ly tâm Hermle Z233M-2 Đức Máy đo kích thước hạt Zetasizer Nano ZS Anh 10 Tủ sấy Gallenkamp WB/OP 7-45 Đức 11 Tủ lạnh Samsung Hàn Quốc 12 Máy sắc ký lỏng hiệu Waters Alliance Mỹ cao 2.3 Phương pháp nghiên cứu Nghiên cứu thực thông qua bước sau: i Khảo sát lựa chọn chất diện hoạt có khả tạo dung dịch suốt tinh dầu HNT nước ii Khảo sát lựa chọn nồng độ chất diện hoạt thấp giữ độ ổn định dung dịch tinh dầu HNT iii Khảo sát nồng độ tinh dầu HNT tải công thức với loại chất diện hoạt lựa chọn 15 iv Khảo sát hoạt tính kháng nấm dung dịch lựa chọn để xác định nồng độ tinh dầu công thức v Khảo sát chất tạo độ nhớt phù hợp dựa yêu cầu không làm thay đổi cấu trúc (độ trong, đo kích thước tiểu phân) vi Đánh giá lại khả kháng nấm cơng thức hồn chỉnh 2.3.1 Khảo sát thành phần thuốc nhỏ tai chứa tinh dầu HNT 2.3.1.1 Khảo sát chất diện hoạt • Khảo sát chất diện hoạt khả hoà tan tinh dầu vào nước - Cách tiến hành : Trong ống nghiệm khác nhau, cân trực tiếp 0,05 g tinh dầu HNT micropipet vào ống Trong ống, cho lượng chất diện hoạt khảo sát (Tween 80, Tween 20, Kolliphor RH 40 Kolliphor HS 15) tương ứng với tỷ lệ tinh dầu : chất diện hoạt từ 1:2 đến 1:9 Lắc xốy cẩn thận để trộn hỗn hợp vịng phút Cho 0,05 g nước micropipet vào ống, tiếp tục lắc xoáy phút, quan sát cảm quan ghi nhận kết Lượng nước thêm đến đục hẳn dừng khơng thêm - Yêu cầu : Lựa chọn ống có cảm quan suốt, lỏng đồng để tiến hành khảo sát độ bền hỗn hợp Tinh dầu, chất diện hoạt nước Cảm quan đánh giá theo mức độ đục, đục, mờ suốt theo Hình 2.1 16 A B C D Hình Mức độ đánh giá cảm quan A – Rất đục B – Đục C – Trong mờ D – Trong suốt • Khảo sát độ bền hỗn hợp tinh dầu, chất diện hoạt nước - Cách tiến hành : Ly tâm 10,000 vòng/ phút 10 phút hỗn hợp chọn phần khảo sát khả hoà tan tinh dầu vào nước Quan sát tách lớp ghi nhận kết Hỗn hợp đánh giá bền hỗn hợp suốt, không xảy tượng tách lớp, kết tinh, kết hay lắng cặn - Yêu cầu : Lựa chọn hỗn hợp có tỷ lệ chất diện hoạt thấp giữ suốt, khơng có tượng tách lớp, kết tinh, kết hay lắng cặn sau ly tâm 2.3.1.2 Khảo sát nồng độ tinh dầu HNT có hoạt tính kháng nấm • Khảo sát khả tải tinh dầu HNT - Cách tiến hành 12 ống nghiệm thuỷ tinh chia làm nhóm tương ứng với chất diện hoạt lựa chọn thí nghiệm xác định chất diện hoạt nồng độ tương ứng bên Trong ống nghiệm nhóm, cân trực tiếp vào 0,05 g, 0,2 g, 0,25 g, 0,3 g tinh dầu HNT tương ứng với tỷ lệ % tinh dầu công thức 1%, 4%, 5% 6% Sau đó, cân trực tiếp vào ống 17 nghiệm lượng chất diện hoạt (một ba chất diện hoạt) với tỉ lệ xác định Lắc xoáy ống nghiệm phút Cuối cân trực tiếp nước vào bổ sung vừa đủ g cho ống nghiệm Lắc xoáy ống nghiệm phút Riêng với chất diện hoạt lựa chọn cuối sau thử nghiệm 12 ống nghiệm trên, tiến hành chuẩn bị thêm ống thứ 13 với nồng độ tinh dầu 8% để đánh giá khả tải tinh dầu - Yêu cầu : Lựa chọn cơng thức có khả tải tinh dầu hàm lượng cao đạt cảm quan suốt • Khảo sát khả kháng nấm dung dịch tinh dầu HNT Sử dụng phương pháp khuếch tán đĩa Khảo sát chủng nấm : A.niger, A flavus A terreus Chuẩn bị môi trường thử nghiệm : Môi trường PDA Khoai tây 200 mg Glucose .20 g Cloramphenicol 50 mg Nước khử khống lít Chuẩn bị vi nấm thử nghiệm Các chủng nấm hoạt hố PDA, ủ nhiệt độ phịng từ đến ngày Chuẩn bị dịch treo vi nấm nước muối sinh lý 0,85% NaCl 0,05% Tween 80 hấp tiệt trùng, lắc xoáy khoảng 30 giây, mật độ vi nấm xác định cách đếm bào tử nấm buồng đếm hồng cầu Neubauer Mật độ vi nấm điều chỉnh khoảng – x 106 CFU/ml 18 - Cách tiến hành : Dựa vào khuếch tán mẫu thử vào mơi trường, mẫu thử có tác dụng ức chế phát triển vi nấm xung quanh đĩa tẩm chất thử vi nấm không phát triển Đường kính vịng ức chế vi sinh vật với mẫu chứng cho biết mức độ hoạt tính chất thử Mỗi đĩa petri thử nghiệm cho xác 15 ml mơi trường PDA Dùng que vô trùng tẩm dịch treo nấm chuẩn bị trước trải lên bề mặt thạch Chất thử tẩm lên đĩa giấy với thể tích 10 µl, đặt đĩa giấy tẩm chất thử lên bề mặt thạch Đọc kết sau ngày Thử nghiệm lặp lại lần đo đường kính kháng nấm trung bình ghi nhận kết Hoạt tính kháng nấm đánh giá theo Bảng 2.3 Bảng Đánh giá mức độ kháng vi sinh vật chất thử có nguồn gốc thực vật dựa đường kính kháng nấm Đường kính vịng kháng vi sinh vật (mm) Mức độ kháng vi sinh vật 15 Mạnh 10 – 14 Vừa