Mục đích của nghiên cứu này là xác định phương pháp phá vách bào tử nấm Linh Chi Ganoderma lucidum. Enzyme chitinase trong dịch nuôi cấy Trichoderma harzianum T2 và chế phẩm thương mại C20032 hoạt động tối ưu ở 500C và pH 5. Tỉ lệ phá v vách bào tử bào tử nấm Linh Chi Ganoderma lucidum khi kết hợp enzyme dịch nuôi cấy nấm Trichoderma harzianum T2 và chế phẩm thương mại cellulase C20032 ở 500C, pH 5 trong 10 ngày là 53,5%. Mời các bạn cùng tham khảo!
Hội nghị Khoa học An toàn dinh dưỡng An ninh lương thực lần năm 2018 ỨNG DỤNG ENZYME VÀ SIÊU ÂM PHÁ VÁCH BÀO TỬ NẤM LINH CHI (GANODERMA LUCIDUM) *Đặng Thị Kim Tuyền; Trần Điền Ánh Tuyết Trường Đại học Cơng nghệ TP.HCM Email: *dtkimtuyen96@gmail.com TĨM TẮT Mục đích nghiên cứu xác định phương pháp phá vách bào tử nấm Linh Chi Ganoderma lucidum Enzyme chitinase dịch nuôi cấy Trichoderma harzianum T2 chế phẩm thương mại C20032 hoạt động tối ưu 500C pH Tỉ lệ phá v�vách bào tử bào tử nấm Linh Chi Ganoderma lucidum kết hợp enzyme dịch nuôi cấy nấm Trichoderma harzianum T2 chế phẩm thương mại cellulase C20032 500C, pH 10 ngày 53,5% Sau xử lý enzyme, áp dụng chế độ siêu âm công suất 500 W phút độ khuếch đại 100%, tỉ lệ phá v�bào tử tăng lên đến 71,7% Tiền xử lý bào tử trước thực phản ứng enzyme bước khơng thể thiếu, nhiên khơng có khác biệt tỉ lệ phá v�vách bào tử điều kiện nhiệt độ -40C, -200C, -700C (đá khô) -1960C (nitơ lỏng) Sau phá v�bào tử enzyme, dịch sau ly tâm chứa 12,03% polysaccharide 50,5% lipid tổng, từ phần vỏ bào tử thu 0,04% polysaccharide 1,08% lipid tổng Sau phá v�bào tử enzyme kết hợp siêu âm, dịch sau ly tâm chứa 16,80% polysaccharide 86,17% lipid tổng, từ phần vỏ bào tử thu 0,03% polysaccharide 6,75% lipid tổng Từ đó, quy trình phá v�bào tử nấm Linh chi enzyme kết hợp siêu âm thu hồi hoạt chất từ bào tử phá v�được đề nghị Từ khóa: chitinase, phá vách bào tử Ganoderma lucidum, polysaccharide, lipid, siêu âm GIỚI THIỆU Bào tử Linh Chi (Ganoderma lucidum spores) có kích thước nhỏ (khoảng 5-6 × 8,5 – 12 μm), chứa thành phần có hoạt tính sinh học polysacharide, triterpenoid, acid béo, amino acid, vitamin nguyên tố vi lượng với hàm lượng đậm đặc thể nấm Linh Chi từ – 20 lần (Cheng CR et al., 2010, Heim et al., 1992, Boh B et al., 2007) Các hoạt chất có giá trị dinh dư�ng dược lý tăng cường sức khỏe, giúp ngăn ngừa ung thư tái phát Tuy nhiên, bào tử Linh Chi có lớp vách đơi cứng, dày c�0,7 - 1,2 μm, enzyme tiêu hóa thể người phá v� Chỉ vách ngồi bị phá v�thì hợp chất có hoạt tính sinh học phát huy tác dụng quý giá trị liệu Thành phần vách bào tử nấm Linh Chi chứa 19,01% Si, 19,01% Ca, 52,08% - 57,64% chitin (Jingjing Ma et al., 2007) Cấu trúc phức tạp vách bào tử nấm Linh Chi nhờ liên kết cellulose với thành phần tạo vách bền vững giúp cho bào tử nấm Linh Chi chống chịu acid kiềm Việc phân hủy 391 Hội nghị Khoa học An toàn dinh dưỡng An ninh lương thực lần năm 2018 chitin đóng vai trị quan trọng việc phá vách bào tử nấm Linh chi Nhiều nghiên cứu phá v�vách bào tử sử dụng phương pháp nghiền Một số khác sử dụng enzyme để giảm thiểu ảnh hưởng nhiệt độ lên hoạt tính sinh học hoạt chất bào tử (Patent CN 101596220 A, 2009) Các thông số kỹ thuật q trình khơng cơng bố rõ ràng Đó lý nghiên cứu tiến hành nhằm xác định thông số phá v�bào tử nấm Linh Chi enzyme kết hợp siêu âm, từ trích ly hoạt chất đưa vào ứng dụng NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP Nguyên liệu Bào tử nấm Linh Chi thu thập từ trại nấm địa bàn Tp Hồ Chí Minh, sấy nhiệt độ 400C, bảo quản điều kiện khô Trichoderma harzianum T2 phân lập từ thể nấm Linh Chi phịng thí nghiệm Viện Khoa học Ứng dụng trường Đại học Công nghệ TP.HCM cung cấp Enzyme thương mại C20032 cung cấp công ty TNHH Khoa học Công nghệ Sài Gịn Phương pháp nghiên cứu Ni cấy Trichoderma harzianum T2 Môi trường chứa glucose g/L, chitin huyền phù 10 g/L, NH4NO3 0,5 g/L, MgSO4.7H2O 0,5 g/L, K2HPO4 0,7 g/L, KH2PO4 0,3 g/L, FeSO4.7H2O 0,01 g/L, ZnSO4 0,001 g/L, chloramphenicol 0,005 g/L, hấp tiệt trùng 1210C, atm, 15 phút Cấy bào tử Trichoderma harzianum T2 nuôi cấy ngày môi trường PDA với mật độ 106 bào tử/ml, lắc 150 vòng/phút nhiệt độ phòng Sau ngày nuôi cấy, thu dịch sau ly tâm 4000 vòng/phút 10 phút Khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ pH lên hoạt động enzyme chitinase dịch nuôi cấy Trichoderma harzianum T2 (DNC) chế phẩm C20032 (EC) Hoạt động enzyme chitinase dịch nuôi cấy xác định với chất chitin 1%, nhiệt độ 300C, 400C, 500C, 600C, 700C, pH 4, 5, 6, Thời gian phản ứng 60 phút, bất hoạt enzyme cách đun sôi phút, ly tâm 4000 vòng/phút phút thu dịch Đường khử tạo thành xác định phương pháp DNS đo bước sóng 535 nm dựa đường chuẩn glucosamine (Elson et al., 1933) Từ xác định t0opt pHopt dịch nuôi cấy Khảo sát động học phá vách bào tử nấm Linh Chi hỗn hợp enzyme dịch nuôi cấy nấm Trichoderma harzianum T2, enzyme thương mại C20032 20 g bào tử nấm Linh Chi 200 ml nước cất lạnh đông -40C 12 giờ, sau rã đơng nhiệt độ phòng thu hồi ly tâm 4000 vòng/ phút 10 phút, cuối ngâm có khuấy từ 300 ml dung dịch enzyme T harzianum T2 bổ sung 300 ml dung dịch C20032 10%, 400 ml đệm acetate 50 mM pH 500C Sau thời gian tối đa 10 ngày, bào tử 392 Hội nghị Khoa học An toàn dinh dưỡng An ninh lương thực lần năm 2018 nguyên vẹn đếm buồng đếm hồng cầu kính hiển vi quang học độ phóng đại x100 tỉ lệ phá v�bào tử xác định Hoạt lực chitinase xác định điều kiện tiêu chuẩn chất chitin 1%, pH = 5, nhiệt độ 500C, thời gian 60 phút Một đơn vị hoạt lực chitinase lượng enzyme xúc tác thủy phân chitin tạo µmol glucosamine thời gian phút điều kiện phản ứng Phá vỡ bào tử sóng siêu âm Hút 15 ml dịch bào tử sau ủ enzyme bổ sung 15 ml đệm tiến hành siêu âm máy phá tế bào sóng siêu âm Qsonica với công suất 500 W, độ khuếch đại 100% phút, giữ mẫu đá lạnh kiểm sốt nhiệt độ mẫu khơng q 500C Tỉ lệ phá v�bào tử xác định Ảnh hưởng chế độ tiền xử lý bào tử nấm Linh chi lạnh đông g bào tử bổ sung 20 ml nước cất lạnh đông -40C (ngăn đá tủ lạnh), -200C (tủ đông), 700C (đá khô), -1960C (nitơ lỏng) 12 giờ, rã đơng nhiệt độ phịng thực bước khảo sát tương tự phương pháp phá bào tử nêu Tỉ lệ phá v�bào tử xác định Xác định tỉ lệ phá vỡ bào tử Tỉ lệ phá vỡ bào tử (%) = (số lượng bào tử ban đầu - số lượng bào tử sau xử lý)/ số lượng bào tử ban đầu × 100 Định tính hợp chất có bào tử nấm Linh Chi Huyền phù bào tử sau thực phản ứng enzyme siêu âm ly tâm 4000 vòng/phút 15 phút Dịch sau ly tâm trích ly lỏng lỏng thể tích diethyl ether thu pha hữu Sau đuổi dung môi, phát saponin thực theo Fontan-Kaudel, protein sử dụng thử nghiệm Biuret, carbonhydrate thực theo thử nghiệm Molisch triterpenoid thực theo thử nghiệm Liebermann-Burchard (Saha et al., 2011) Định lượng polysaccharide tổng số phương pháp Phenol – Sulfuric (Brennan et al., 2008) Định lượng lipid tổng số phương pháp Adam – Rose – Gottlieb (Pearson’s Composition and Analysis of Foods, 9th Edn, 1991) Phân tích thống kê Kết thể dạng trung bình SD Số liệu xử lý phần mềm SAS 9.4 Đồ thị vẽ phần mềm Microsoft Excel với độ lệch chuẩn (STD) Mỗi đơn vị thí nghiệm thực ba lần 393 Hội nghị Khoa học An toàn dinh dưỡng An ninh lương thực lần năm 2018 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Ảnh hưởng nhiệt độ pH lên hoạt lực enzyme chitinase dịch nuôi cấy Trichoderma harzianum T2 Chủng Trichoderma harzianum T2 phân lập từ nấm Linh Chi sử dụng để sinh enzyme ứng dụng phá v�vách bào tử nấm với kỳ vọng enzyme dịch nuôi cấy, đặc biệt chitinase mang tính đặc hiệu chất chitin vách bào tử Kết bảng cho thấy enzyme chitinase thể hoạt lực cao nhiệt độ 500C, pH với giá trị hoạt lực 0,170 ± 0.001 (U/ml) Từ chọn điều kiện nhệt độ 500C pH = để ứng dụng enzyme từ Trichoderma harzianum T2 phá v�vách bào tử nấm Linh Chi Bảng 1: Ảnh hưởng nhiệt độ pH lên hoạt lực chitinase (U/ml) dịch nuôi cấy T harzianum T2 pH pH pH Hoạt lực (U/ml) Hoạt lực (U/ml) Hoạt lực (U/ml) 0,110 ± 0,003 0,151 ± 0,004 0,134 ± 0,008 0,105 ± 0,002 40 0,126 ± 0,012 0,157 ± 0,007 0,135 ± 0,009 0,106 ± 0,002 50 0,127 ± 0,010 0,170 ± 0,001 0,143 ± 0,004 0,118 ± 0,009 60 0,107 ± 0,003 0,150 ± 0,004 0,127 ± 0,002 0,109 ± 0,004 70 0,037 ± 0,014 0,084 ± 0,020 0,077 ± 0,011 0,094 ± 0,022 Nhiệt độ (0C) Hoạt lực (U/ml) 30 pH Ghi chú: Hoạt tính thể dạng TB ± SD Ảnh hưởng nhiệt độ lên hoạt lực enzyme chitinase chế phẩm C20032 Vì enzyme T.harzianum T2 enzyme chủ đạo phá v�bào tử nấm Linh Chi, điều kiện hoạt động enzyme ưu tiên, đặc biệt pH = Tuy nhiên, sử dụng enzyme dẫn đến tỉ lệ phá v�bào tử không đáng kể Chế phẩm thương mại C20032 khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ lên hoạt lực chitinase pH = Bảng 2: Kết khảo sát hoạt tính enzyme chitinase có mặt chế phẩm C20032 pH = Nhiệt độ (0C) Hoạt tính (U/ml) 30 0,234b ± 0,020 40 0,245a ± 0,043 50 0,248a ± 0,031 60 0,227c ± 0,031 70 0,219d ± 0,012 Ghi chú: Hoạt tính thể dạng TB ± SD 394 Hội nghị Khoa học An toàn dinh dưỡng An ninh lương thực lần năm 2018 Bảng cho thấy enzyme chitinase có mặt chế phẩm C20032 thể hoạt lực cao hai nhiệt độ 400C 500C Lựa chọn nhiệt độ 500C để kết hợp với enzyme dịch nuôi cấy nấm Trichoderma harzianum T2 thí nghiệm thích hợp Ảnh hưởng tỉ lệ dịch enzyme Trichoderma harzianum T2 chế phẩm C20032 10% lên tỉ lệ phá vỡ bào tử nấm Linh Chi Bảng 3: Ảnh hưởng tỉ lệ dịch nuôi cấy chế phẩm C20032 10% lên tỉ lệ phá v�bào tử nấm Linh Chi theo thời gian Tỷ lệ enzyme T.harzianum T2: C20032 10% 48 72 96 1:0 (3,93:0 U/g) 0,85b ± 0,22 2,49d ± 0,33 3,20d ± 0,85 0:1 (0:6,40 U/g) 0,71b ± 0,24 3,41d ± 0,64 3,91d ± 1,05 1:1 (3,93 + 6,40 U/g) 5,33a ± 1,19 13,29a ± 0,81 18,55a ± 0,85 1:2 (3,93+12,80 U/g) 4,19a ± 1,01 8,03b ± 0,65 10,95b ± 1,17 2:1 (7,86 + 6,40 U/g) 0,78b ± 0,33 4,98c ± 0,53 6,47c ± 0,96 Ghi chú: Tỉ lệ % phá vỡ thể dạng TB ± SD Trong cột hàng mang chữ khác thể khác biệt có ý nghĩa thống kê mức ý nghĩa α=0,05 theo trắc nghiệm LSD Kết bảng cho thấy tỉ lệ % bào tử nấm Linh Chi bị phá v�đạt cao (18,55%) ngày theo dõi thứ kết hợp dịch nuôi cấy chế phẩm enzyme C20032 10% theo tỉ lệ 1:1 (NT3 (1 DNC : C20032 10%)) Với việc sử dụng riêng rẽ dịch nuôi cấy hay chế phẩm C20032 10% để thực thí nghiệm phá vách bào tử nấm Linh Chi nhận thấy kết thu thấp (NT1 (1 DNC)), NT2 (1 C 10%)) Khi có sử dụng dịch nuôi cấy chế phẩm C20032 10% với tỉ lệ khác nhận thấy bào tử nấm Linh Chi bị phá vách có tăng lên khơng đáng kể (NT4(1 DNC:2 EC10%), NT5(2 DNC:1 EC10%)) Ảnh hưởng nồng độ chế phẩm C20032 kết hợp enzyme Trichoderma harzianum T2 lên tỉ lệ phá vỡ bào tử nấm Linh Chi Nhằm xác định nồng độ enzyme tối thiểu phản ứng phá v�vách bào tử nấm Linh Chi nhờ enzyme, tỉ lệ chế phẩm thương mại giảm dần, dịch enzyme từ nuôi cấy Trichoderma harzianum T2 khơng cần pha lỗng Kết trình bày bảng 395 Hội nghị Khoa học An toàn dinh dưỡng An ninh lương thực lần năm 2018 Bảng 4: Ảnh hưởng nồng độ chế phẩm C20032 kết hợp enzyme Trichoderma harzianum T2 lên tỉ lệ phá v�bào tử nấm Linh Chi Enzyme T harzianum T2: C20032 Ngày Ngày Ngày 10 10% (3,93 + 6,40 U/g) 18,98a ± 0,57 21,46a ± 0,96 24,45a ± 1,86 5% (3,93+3,20 U/g) 14,78b ± 0,89 17,20b ± 0,81 18,76b ± 1,54 1% (3,93+0,64 U/g) 5,19cd ± 0,86 6,47c ± 0,75 7,39cd ± 0,65 0,5% (3,93+0,32 U/g) 3,91cd ± 0,65 4,83d ± 0,65 6,18cd ± 0,85 0,1% (3,93+0,06 U/g) 2,70cd ± 0,65 3,70d ± 0,69 4,26cd ± 0,77 Ghi chú: Tỉ lệ % phá vỡ thể dạng TB ± SD Trong cột hàng mang chữ khác thể khác biệt có ý nghĩa thống kê mức ý nghĩa α=0,05 theo trắc nghiệm LSD Bảng cho thấy bào tử nấm Linh Chi bị phá v�nhiều ngày thứ 10 (24,45%) giữ nồng độ chế phẩm C20032 10% Khi giảm nồng độ C20032 xuống 1%, 0,5%, 0,1% tỉ lệ bào tử nấm Linh Chi bị phá v�khơng đáng kể Hình 1: Vịng phân giải hỗn hợp enzyme đĩa thạch chứa chitin theo thời gian ủ với bào tử: a) Ngày 0; b) Ngày 3; c) Ngày 7; d) Ngày 9; e) Ngày 10 Việc ủ enzyme bào tử kéo dài 10 ngày dựa sở enzyme trì hoạt tính điều kiện thí nghiệm pH 50oC Hình cho thấy sau 10 ngày ủ, enzyme chitinase hỗn hợp phản ứng suy yếu chưa hồn tồn bất hoạt Như kéo dài phản ứng enzyme đến 10 ngày để đạt hiệu phá v�bào tử cao điều kiện thí nghiệm 396 Hội nghị Khoa học An toàn dinh dưỡng An ninh lương thực lần năm 2018 Tỉ lệ phá vỡ bào tử nấm Linh Chi kết hợp xử lý enzyme sóng siêu âm Phá v�bào tử nấm Linh Chi đạt hiệu cao phản ứng enzyme thực điều kiện thí nghiệm có khuấy đảo Sóng siêu âm áp dụng sau phản ứng enzyme giúp tăng tỉ lệ phá v�bào tử Hình tổng hợp tỉ lệ phá v�của bào tử nấm Linh Chi theo ngày (ngày 2, 3, 5, 7, 8, 10) ủ bào tử với enzyme Trichoderma harzianum T2: C20032 10% theo tỉ lệ 1:1, khuấy từ gia nhiệt 50oC hai trường hợp có không kết hợp siêu âm Khi ủ enzyme với bào tử khơng siêu âm điều kiện thí nghiệm có khuấy đảo, tỉ lệ phá v�đạt 53,5% Siêu âm phút sau xử lý enzyme 10 ngày phá v�71,7 % bào tử Hình 2: Tỉ lệ phá v�bào tử nấm Linh Chi xử lý enzyme không có siêu âm (giá trị TB theo sau chữ khơng có khác biệt có ý nghĩa thống kê mức ý nghĩa α = 0,05 theo trắc nghiệm Duncan (CV% = 3.077117) a) c) b) d) Hình 3: a) Bào tử nấm Linh Chi trước xử lý enzyme; b) Sau xử lý enzyme Trichoderma harzianum T2 + C20032 10% tỉ lệ 1:1 500C sau 10 ngày; c) Sau xử lý enzyme kết hợp siêu âm; d) Enzyme bị bất hoạt sau siêu âm 397 Hội nghị Khoa học An toàn dinh dưỡng An ninh lương thực lần năm 2018 Hình cho thấy kết hợp siêu âm sau enzyme, bào tử phá v�hiệu Hình 3d cho thấy siêu âm bất hoạt hoàn toàn enzyme Ảnh hưởng phương pháp tiền xử lý lạnh đông lên tỉ lệ phá vỡ bào tử Bảng 5: Ảnh hưởng chế độ lạnh động tiền xử lý lên tỉ lệ phá v�bào tử nấm Linh Chi Nhiệt độ (0C) Tỉ lệ phá v�(%) 30 -4 -20 -70 -196 8,73b±5,51 67,07a±4,63 60,23a ±10,02 73,70a ±8,27 64,22a ±2,74 Ghi chú: Tỉ lệ % phá vỡ thể dạng TB ± SD Trong cột hàng mang chữ khác thể khác biệt có ý nghĩa thống kê mức ý nghĩa α=0,01 theo trắc nghiệm LSD Bảng cho thấy không tiền xử lý bào tử lạnh đông tỉ lệ phá v�bào tử không đáng kể (8,73%) Khi tiền xử lý lạnh đông chế độ khác sau 12 buồng lạnh đông tủ lạnh -40C, tủ âm -200C, đá khô (-700C) Nitơ lỏng (-1960C) tỉ lệ phá v�cao đạt -700C đá khô (73,7%), nhiên sai khác khơng có ý nghĩa thống kê so với chế độ tiền xử lý khác Như chọn chế độ tiền xử lý lạnh đông qua đêm sau 12 sử dụng buồng lạnh đông tủ lạnh -40C lý tiện lợi kinh tế Phương pháp nghiền đạt đến tỉ lệ phá v�bào tử 100% (Pattent CN 101596220 A, 2009) Tuy nhiên chi phí đầu tư thiết bị lớn chất lượng hoạt chất khơng bảo đảm Định tính hợp chất dầu bào tử sau trích ly lỏng lỏng dịch thủy phân bào tử Sau trích ly lỏng lỏng dịch thủy phân bào tử diethyl ether, dầu bào tử thu hồi sau đuổi tồn dung mơi Định tính dầu bào tử phương pháp thường quy cho thấy dầu bào tử khơng cịn chứa protein (âm tính thuốc thử Biuret), nhiên có chứa polysaccharide (dương tính thuốc thử Mollisch) triterpenoid (dương tính thuốc thử Liebermann-Burchard) Định lượng polysaccharide tổng số lipid tổng số có dịch bào tử sau phá vỡ Định lượng polysaccharide tổng số Chú thích kí hiệu: KSA: Khơng siêu âm SA: Siêu âm BT: Vỏ bào tử PHC: Pha hữu PN: Pha nước 398 Hội nghị Khoa học An toàn dinh dưỡng An ninh lương thực lần năm 2018 Bảng 3.7: Hàm lượng polysaccharide có dịch phá v�bào tử vỏ bào tử từ 100 g bào tử phá v�bằng enzyme kết hợp siêu âm không siêu âm (Hiệu suất thu hồi polysaccharide) Mẫu Hiệu suất thu hồi polysaccharide (%) Dịch KSA 12,03b±1,00 BT KSA 0,04c±0,00 Dịch SA 16,80a±1,15 BT SA 0,03c±0,01 Ghi chú: Hiệu suất thu hồi (%) thể dạng TB ± SD Trong cột hàng mang chữ khác thể khác biệt có ý nghĩa thống kê mức ý nghĩa α=0,01 theo trắc nghiệm LSD Kết bảng 3.7 cho thấy polysaccharide chủ yếu tìm thấy pha lỏng sau ly tâm Siêu âm làm tăng nồng độ polysaccharide thu từ 12,3% lên 16,80%, tức tăng 1,37 lần) Bào tử phá v�còn chứa polysaccharide, so với pha lỏng chiếm 0,3% 0,17% cho BT KSA SA Từ thấy sử dụng phương pháp enzyme phá v�tế bào có siêu âm hay khơng siêu âm, polysaccharide chủ yếu thu pha lỏng sau ly tâm tách bào tử So sánh với nghiên cứu Zhu X cộng (2012), sử dụng phương pháp hóa – học để chiết xuất polysaccharide, thời gian trích ly 130 phút hàm lượng polysaccharide tổng số thu 5,92±013% Các chất chống oxy hóa trung hịa gốc DPPH cách cho hydrogen (Krings and Berger, 2001) Thí nghiệm thực để đánh giá khả kháng oxy hóa polysaccharide từ bào tử bị phá v�chiết xuất phương pháp hóa – học Kết nghiên cứu Zhu X cộng thu khả kháng oxy hóa polysaccharide tăng tăng nồng độ, cao đối chứng dương BHT (Butylated hydroxytoluene) lại thấp Vc (Vitamin C) nồng độ Dựa vào kết khả kháng oxy hóa xếp theo thứ tự Vc > polysaccharide > BHT Giá trị IC50 polysaccharide, Vc BHT 0,36 mg/mL, 0,25 mg/mL 0,43 mg/mL Bảng 3.8: Bảng phân tích hàm lượng polysaccharide hai pha trích ly lỏng lỏng dịch phá v�bào tử diethyl ether từ 100 g bào tử không siêu âm siêu âm PHC (%) PN (%) KSA 0,25c ± 0,02 11,77b ± 0,99 SA 0,30c ± 0,01 16,50a ± 1,15 Ghi chú: Hàm lượng (%) thể dạng TB ± SD Trong cột hàng mang chữ khác thể khác biệt có ý nghĩa thống kê mức ý nghĩa α=0,01 theo trắc nghiệm LSD Từ bảng 3.8, phân tích định lượng cho thấy pha nước thu hồi sau trích ly lỏng lỏng chứa phần lớn polysaccharide, sai khác siêu âm khơng siêu âm có ý nghĩa thống kê Đối với dung môi 399 Hội nghị Khoa học An toàn dinh dưỡng An ninh lương thực lần năm 2018 diethyl ether pha hữu chứa 2,1% không siêu âm 1,81% siêu âm so với pha nước, sai khác khơng có ý nghĩa thống kê Từ cho thấy thu hồi hoạt chất từ dịch ly tâm sau phá v�bào tử cách trích ly lỏng lỏng dung mơi diethyl ether (hay dung môi không phân cực khác) thu pha hữu phần lớn polysaccharide bị loại bỏ pha nước Định lượng lipid tổng số Thành phần lipid bào tử gồm triterpenoid acid béo Tuy nhiên khơng có chất chuẩn nên triterpenoid khơng phân tích Bảng 3.9: Hàm lượng lipid có dịch phá v�bào tử vỏ bào tử từ 100 g bào tử phá v�vách enzyme kết hợp siêu âm không siêu âm (hiệu suất thu hồi lipid tổng) Mẫu Hiệu suất thu hồi lipid (%) Dịch KSA 50,50b ± 1,32 BT KSA 1,08c ± 0,63 Dịch SA 86,17a ± 10,41 BT KSA 6,75c ± 1,75 Ghi chú: Hàm lượng (%) thể dạng TB ± SD Trong cột hàng mang chữ khác thể khác biệt có ý nghĩa thống kê mức ý nghĩa α=0,01 theo trắc nghiệm LSD Dựa vào bảng 3.9 hàm lượng lipid tổng số thu đạt giá trị cao 86,17% mẫu dịch có siêu âm, cao mẫu khơng siêu âm (50,50%) Có thể nói, nhờ kết hợp enzyme siêu âm nâng hàm lượng lipid thu lên 1,7 lần so với không siêu âm Bên cạnh đó, dịch trích ly bào tử siêu âm thu hàm lượng lipid 6,75%, cao mẫu bào tử khơng siêu âm (1,08%) nhiên khơng có ý nghĩa mặt thống kê So sánh với phần lớn lipid thu hồi pha dịch sau ly tâm, việc dùng dung môi hữu chủ yếu để thu hồi lipid có triterpenoid, thành phần có phần khác biệt với thể Theo Li JJ cộng (2014), hàm lượng triterpenoid thể nấm chiếm 0,44% - 1,42%, bào tử phá v�chiếm 1,89% - 3,15% Từ kết luận phương pháp siêu âm làm tăng tỉ lệ phá v�và tăng hàm lượng polysaccharide lipid thu hồi phần dịch phá v�bào tử cao vỏ bào tử Đề nghị quy trình phá vỡ bào tử nấm Linh chi thu hoạt chất Như vậy, quy trình phá vách thu hồi dịch chiết bào tử nấm Linh chi đề nghị bao gồm q trình sau: – Tiền xử lý lạnh đơng -40C 12 giờ, rã đông – Ủ bào tử với hỗn hợp enzyme dịch nuôi cấy Trichoderma harzianum T2 (3,93 U/ml chitinase) chế phẩm cellulase C20032 (6,40 U/ml chitinase), 500C, pH = 5,0 đệm acetate 10 ngày 400 Hội nghị Khoa học An toàn dinh dưỡng An ninh lương thực lần năm 2018 – Siêu âm phút, 500C, độ khuếch đại 100% – Ly tâm 4000 vịng phút, 15 phút tách pha – Trích ly pha rắn ethanol – Phối trộn dịch trích ethanol pha dịch sau ly tâm – Cô quay chân không loại bỏ phần lớn dung môi – Sấy phun đông khô KẾT LUẬN Các kết thu nghiên cứu cho thấy phá v�khoảng 70% bào tử nấm Linh Chi phương pháp rẻ tiền sử dụng enzyme kết hợp siêu âm Tỉ lệ phá v�bào tử không cao so với phương pháp nghiền, enzyme phá v�vách bào tử hiệu cần tiếp tục nghiên cứu, thành phần hoạt tính sinh học chất thu sau phá v� vách enzyme siêu âm TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] Boh B, Berovic M, Zhang J, Zhi-Bin L Ganoderma lucidum and its pharmaceutically active compounds Biotechnol Annu Rev 2007;13:265–301 [2] Brennan, C.S., Yuliarti, O., Goh, K., Matia-Merino, L., Mawson, J & Drummond, L (2008) Effect of extraction techniques and conditions on the physicochemical properties of the water soluble polysaccharides from gold kiwifruit (Actinidia chinensis) International Journal of Food Science and Technology, 43, 2268–2277 [3] Cheng CR, YueQX, WuZY, et al Cytotoxic triterpenoids from Ganoderma Lucidum Phytochemistry 2010; 71: 1579-1585 [4] Elson, LA and Morgan, W (1933) A colorimetric method for the determination of glucosamine and chondrosamine, Biochem J 27, 1824-1828 [5] Heim, Y R Li, Q Chen, Z Lin, D Xia, L Ma, 1992 Chemical studies on immunologically active polysaccharides of Ganoderma lucidum (Leyss Ex Fr.) Karst Chung – Kuo – Chung – Yao – Tsa – Chih 17 (4):266 – 256 (1992) [6] Jungjing MA, Zhengyi FU, Peiyan MA, Yanli SU, Qingjie Z (2007) Breaking and characteristics of Ganoderma lucidum spores by high speed centrifugal shearing pulverizer J Wuhan Univ Tech-Mater Sci Ed 22: 617-621 [7] Krings, U & Berger, R.G (2001) Antioxidant activity of some roasted foods Food Chemistry, 72, 223–229 [8] Li J.J., Hu X.Q., Zhang X.F., Liu J.J., Cao L.S (2014) Study on variation of main ingredients from spores and fruiting bodies of Ganoderma lucidum, Article in Chinese 401 Hội nghị Khoa học An toàn dinh dưỡng An ninh lương thực lần năm 2018 [9] Pattent CN 101596220 A (2009) Wall-breaking method of Ganoderma lucidum spore [10] Pearson’s Composition and Analysis of Foods, 9th Edn, 1991 page 538 [11] Saha, S., Subrahmanyam, E V S., Kodangala, C., & Shastry, S C (2011) Isolation and characterization of triterpenoids and fatty acid ester of triterpenoid from leaves of Bauhinia variegata Der Pharma Chemica, 3, 28-37 [12] Zhu X., Chen X., Xie J., Wang P., Su W (2012) Mechanochemical-assisted extraction and antioxidant activity of polysaccharides from Ganoderma lucidum spores Int J Food Technol, 47 (5), 927 – 32 COMBINATION OF ENZYMATIC AND ULTRASONIC METHODS FOR THE BREAKAGE OF GANODERMA LUCIDUM SPORE WALLS ABSTRACT The purpose of this study was to determine the method for Ganoderma lucidum spore wall breakage Chitinase activity in the Trichoderma harzianum T2 extract and commercial enzyme C20032 displayed their optimal temperature of 500C and their optimal pH of 5.0 Spore wall breakage efficiency was found to be 53.5% when using simmultanneously Trichoderma harzianum T2 enzyme chitinase and commercial enzyme C20032 at 500C, pH during 10 days After enzymatic treatment, applying 500W ultrasound in minutes with 100% amplification increased the spore breakage efficiency to 71.7% Freezing Ganoderma lucidum spores as a pretreatment step seemed to be a prerequisite for spore wall breakage However, there was no significant difference between freezing methods such as storage under -40C, -200C, -700C (in dry ice) and -1960C (in liquid nitrogen) For spore wall breakage by enzyme only, the centrifugal supernatant contained 12.03% total polysaccharide and 50.5% total lipid, while from the spore walls in pellet only 0.04% total polysaccharide and 1.08% total lipid were extracted By combining enzymatic and ultrasonic methods for the breakage spore walls, the centrifugal supernatant contained up to 16.80% total polysaccharide and 86.17% total lipid, while the spore walls in pellet as in the previous case kept only a small part of spore substances, namely 0.03% total polysaccharide and 6.75% total lipid A flow chart of breaking spore wall by combining enzymatic and ultrasonic methods and active substance recovery was designed Keywords: chitinase, Ganoderma lucidum spore wall breakage, polysaccharide, lipid, ultrasound 402 ... cứu cho thấy phá v�khoảng 70% bào tử nấm Linh Chi phương pháp rẻ tiền sử dụng enzyme kết hợp siêu âm Tỉ lệ phá v? ?bào tử khơng cao so với phương pháp nghiền, enzyme phá v? ?vách bào tử hiệu cần tiếp... xử lý enzyme sóng siêu âm Phá v? ?bào tử nấm Linh Chi đạt hiệu cao phản ứng enzyme thực điều kiện thí nghiệm có khuấy đảo Sóng siêu âm áp dụng sau phản ứng enzyme giúp tăng tỉ lệ phá v? ?bào tử Hình... tự phương pháp phá bào tử nêu Tỉ lệ phá v? ?bào tử xác định Xác định tỉ lệ phá vỡ bào tử Tỉ lệ phá vỡ bào tử (%) = (số lượng bào tử ban đầu - số lượng bào tử sau xử lý)/ số lượng bào tử ban đầu