Thiết lập quy trình phá vách bào tử nấm linh chi ganoderma lucidum kết hợp với enzyme và siêu âm

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP HỒ CHÍ MINH ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP THIẾT LẬP QUY TRÌNH PHÁ VÁCH BÀO TỬ NẤM LINH CHI GANODERMA LUCIDUM KẾT HỢP VỚI ENZYME VÀ SIÊU ÂM Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giảng viên hướng dẫn : TS NGUYỄN HOÀI HƯƠNG Sinh viên thực MSSV: 1411100465 : ĐẶNG THỊ KIM TUYỀN Lớp: 14DSH03 TP Hồ Chí Minh, 2018 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan số liệu kết nghiên cứu đồ án hoàn toàn trung thực, chưa cơng bố cơng trình khác Các thơng tin, tài liệu trích dẫn đồ án ghi rõ nguồn gốc TP Hồ Chí Minh, tháng 07 năm 2018 Sinh viên thực Đặng Thị Kim Tuyền LỜI CẢM ƠN Trong thời gian thực đồ án, nhận nhiều hỗ trợ giúp đỡ từ phía nhà trường gia đình Chính lí đó, tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc đến họ giúp tơi đạt thành hôm Lời xin gửi tới Ban Giám hiệu Trường Đại học Công nghệ Thành phố Hồ Chí Minh tạo điều kiện để tơi học tập thật tốt trường thời gian qua quý Thầy (Cô) Viện Khoa học Ứng dụng lời cảm ơn sâu sắc, niềm tự hào học tập Bên cạnh đó, để hồn thành báo cáo này, xin chân thành cảm ơn TS Nguyễn Hồi Hương tận tình dạy tơi, cho tơi thêm động lực gặp khó khăn, nhờ có tơi hồn thành tốt đề tài Tơi xin chân thành cảm ơn anh chị, bạn làm đồ án phịng thí nghiệm Cơng nghệ Sinh học, trường Đại học Cơng Nghệ Thành phố Hồ Chí Minh em Nguyễn Bảo Trân, Nguyễn Ngọc Gia Bảo Hồ Lí Hải Vân (15DSH) giúp đỡ tơi nhóm thực đề tài nhiệt tình suốt trình thực đồ án Ngồi tơi xin cảm ơn q Thầy (Cơ), anh chị phụ trách phịng thí nghiệm khoa Dược, trường Đại học Cơng Nghệ Thành phố Hồ Chí Minh hỗ trợ tơi thiết bị dụng cụ để tơi hồn thành đồ án tốt nghiệp Cuối xin bày tỏ lịng biết ơn gia đình, người thân bạn bè tôi, quan tâm, động viên tơi q trình học tập hồn thành báo cáo Trong q trình hồn thiện báo cáo khơng tránh khỏi thiếu sót định mà tơi chưa thể khắc phục nên tơi mong nhận góp ý quý Thầy (Cô) để đề tài hồn chỉnh Tơi xin chân thành cảm ơn! Sinh viên thực Đặng Thị Kim Tuyền Đồ án tốt nghiệp MỤC LỤC DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT v DANH MỤC B ẢNG vi DANH MỤC HÌNH ẢNH ix ĐẶT VẤN ĐỀ .1 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN .4 1.1 Giới thiệu nấm Linh chi bào tử nấm Linh chi .4 1.1.1 Giới thiệu nấm Linh chi .4 1.1.1.1 Phân loại 1.1.1.2 Đặc điểm sinh học nấm Linh chi 1.1.2 Bào tử nấm Linh chi 1.2 Thành phần hóa học chủ yếu nấm Linh chi bào tử nấm Linh chi 12 1.2.1 Các polysaccharide peptidoglycan 15 1.2.2 Triterpenes 17 1.2.3 Saponin 22 1.2.4 Acid béo 23 1.2.5 Các thành phần khác 24 1.3 Công dụng nấm Linh chi bào tử Nấm Linh chi 24 1.3.1 Phòng chống ung thư 26 1.3.2 Khả kháng oxi hóa 27 1.3.3 Điều trị bệnh đái tháo đường 28 1.3.4 Điều trị bệnh tim mạch 28 1.3.5 Tăng cường hệ miễn dịch 29 1.4 Phương pháp phá vỡ trích ly hoạt chất từ bào tử nấm Linh chi 29 1.4.1 Enzyme chitinase 30 1.4.2 Giới thiệu siêu âm phá tế bào 33 1.4.2.1 Khái niệm 33 1.4.2.2 Bản chất sóng âm 34 1.4.2.3 Nguyên lý tác động sóng siêu âm 34 i Đồ án tốt nghiệp 1.4.2.4 Tác động sóng siêu âm lên tế bào 36 1.4.2.5 Ứng dụng sóng siêu âm 36 1.4.2.6 Thiết bị phát sóng siêu âm 37 1.4.3 Các phương pháp phá vỡ bào tử nấm Linh chi 38 1.4.4 Phương pháp trích ly hoạt chất thu dầu bào tử 41 CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 46 2.1 Vật liệu nghiên cứu 46 2.1.1 Vật liệu 46 2.1.2 Nơi thực 46 2.1.3 Thời gian thực 46 2.1.4 Thiết bị - dụng cụ hóa chất 46 2.1.4.1 Thiết bị 46 2.1.4.2 Dụng cụ 47 2.1.4.3 Hóa chất – Mơi trường nuôi cấy 48 2.2 Phương pháp nghiên cứu 52 2.2.1 Thu enzyme chitinase lên men thể rắn 54 2.2.1.1 Phương pháp nuôi cấy Trichoderma harzianum T2 môi trường thạch PDA 55 2.2.1.2 Phương pháp hoạt hóa Trichoderma harzianum T2 55 2.2.1.3 Thu enzyme dịch trích ly phương pháp tăng sinh môi trường rắn 55 2.2.1.4 Phương pháp xác định môi trường nuôi cấy nấm Trichoderma harzianum T2 tối ưu hóa để thu enzyme chitinase 55 2.2.2 Khảo sát ảnh hưởng siêu âm phá vỡ bào tử nấm Linh chi 56 2.2.2.1 Phá vách bào tử nấm linh chi phương pháp lạnh đông kết hợp sử dụng enzyme thương mại Cellulase (EC), dịch tăng sinh nấm Trichoderma harzianum T2 (DTL) siêu âm 57 2.2.2.2 Phương pháp xác định số lượng bào tử buồng đếm hồng cầu 57 2.2.3 Khảo sát ảnh hưởng chế độ tiền xử lý bào tử 60 ii Đồ án tốt nghiệp 2.2.4 Khảo sát ảnh hưởng siêu âm lên thành phần hóa học hoạt tính sinh học 61 2.2.4.1 Quy trình trích ly hoạt chất có bào tử nấm Linh chi 63 2.2.4.2 Định tính số hoạt chất có bào tử nấm Linh chi 65 2.2.4.3 Định lượng số hoạt chất có bào tử nấm Linh chi sau bị phá vỡ 67 2.2.4.4 Phương pháp kháng oxi hóa DPPH 69 2.2.4.5 Phương pháp thử độc tính tế bào artemia 71 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 73 3.1 Thu enzyme chitinase môi trường lên men thể rắn 73 3.2 Ảnh hưởng siêu âm lên tỉ lệ phá vỡ bào tử nấm Linh chi 74 3.3 Ảnh hưởng chế độ tiền xử lí lạnh đơng 78 3.4 Định tính thành phần hóa học sau phá vỡ bào tử nấm Linh chi 79 3.4.1 Định tính thành phần hóa học dịch phá vỡ bào tử 80 3.4.1.1 Định tính protein 81 3.4.1.2 Định tính saponin 82 3.4.1.3 Định tính polysaccharide 85 3.4.1.4 Định tính triterpenoid 85 3.4.2 Định tính thành phần hóa học cịn lại vỏ bào tử phá vỡ enzyme kết hợp siêu âm 87 3.4.2.1 Định tính protein 87 3.4.2.2 Định tính saponin 87 3.4.2.3 Định tính polysaccharide 88 3.4.2.4 Định tính triterpenoid 88 3.5 Định lượng hoạt chất thu từ dịch phá vỡ bào tử bị phá vỡ 90 3.5.1 Định lượng polysaccharide dịch trích ly bào tử mẫu không siêu âm mẫu siêu âm phương pháp Phenol – Sulfuric 90 3.5.2 Định lượng lipid dịch trích ly bào tử mẫu không siêu âm mẫu siêu âm phương pháp Adam – Rose – Gottlieb 92 3.6 Khảo sát hoạt tính kháng oxi hóa 97 iii Đồ án tốt nghiệp 3.7 Thử độc tính tế bào Artemia nauplii 101 CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 104 4.1 Kết luận 104 4.2 Kiến nghị 104 TÀI LIỆU THAM KHẢO 106 Tài liệu tiếng Việt 106 Tài liệu tiếng Anh 106 PHỤ LỤC A PHỤ LỤC B 13 iv Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT PDA: Potato Dextro Agar EC: Enzyme Cellulase C20032 DTL: Dịch trích ly A.nauplii: atermia nauplii DPPH: 1,1 - Diphenyl - - picryl – hydrazyl Trolox: – Hydroxy – 2, 5, 7, - tetramethychroman - – carboxylic CMC: Sodium carboxymethyl cellulose DNS: acid - - hydroxyl - 3,5 – dinitrobenzoic DMSO: Dimethyl sulfoxit ĐC: Đối chứng KSA: Không siêu âm SA: Siêu âm SA 75%: Siêu âm độ khuếch đại 75% SA100%: Siêu âm độ khuếch đại 100% PHC: Pha hữu PN: Pha nước DI: Diethyl ether HE: Hexane BT: Bào tử v Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Biến động kích thước bào tử đảm nấm Linh chi chuẩn mẫu vật khác (Lê Xuân Thám, 1996) 10 Bảng 1.2 Thành phần dược tính nấm Linh chi 12 Bảng 1.3 Hàm lượng hoạt chất sinh học thể bào tử nấm Linh chi (Li JJ cộng (2014)) 15 Bảng 1.4 So sánh khả ức chế ung thư vú phận trạng thái khác nấm Linh chi (2,5 mg/mL) 27 Bảng 1.5 Những nghiên cứu phá vỡ vách bào tử nấm Linh chi Thế giới 39 Bảng 1.6 Các phương pháp trích ly 41 Bảng 1.7 Các dung môi chiết xuất lipid Ganoderma lucidum (CN1099455C) 44 Bảng 2.1 Bố trí thí nghiệm thử độc tính tế bào artemia nauplii 71 Bảng 3.1 Đường kính vịng phân giải chitin enzyme chitinase thu từ hai môi trường chất (mm) 73 Bảng 3.2 Bảng so sánh ảnh hưởng độ khuếch đại đến tỉ lệ phá vỡ bào tử nấm Linh chi qua ngày ủ enzyme 75 Bảng 3.3 Biểu đồ so sánh ảnh hưởng độ khuếch đại đến tỉ lệ phá vỡ bào tử nấm Linh chi qua ngày 76 Bảng 3.4 Kết so sánh ảnh hưởng chế độ tiền xử lí lạnh đơng 78 Bảng 3.5 Kết định tính protein theo thử nghiệm biuret trích ly hai dung mơi 81 Bảng 3.6 Bảng ghi nhận kết chiều cao cột bọt (cm) bền theo thời gian định tính saponin theo thử nghiệm Fontan – Kaudel trích ly diethyl ether 82 Bảng 3.7 Bảng ghi nhận kết chiều cao cột bọt (cm) bền theo thời gian định tính saponin theo thử nghiệm Fontan – Kaudel trích ly hexane 84 Bảng 3.8 Kết định tính saponin trích ly hai dung môi 85 Bảng 3.9 Kết định tính polysaccharide trích ly hai dung môi 85 Bảng 3.10 Kết định tính triterpenoid trích ly hai dung mơi 86 vi Đồ án tốt nghiệp Bảng 3.11 Bảng tổng kết thử nghiệm định tính thành phần hóa học dịch phá vỡ hai dung môi 86 Bảng 3.12 Kết định tính protein theo thử nghiệm biuret trích ly vỏ bào tử 87 Bảng 3.13 Kết định tính saponin theo thử nghiệm tạo bọt, Fontan - Kaudel trích ly vỏ bào tử 88 Bảng 3.14 Kết định tính polysaccharide theo thử nghiệm Molisch trích ly vỏ bào tử 87 Bảng 3.15 Kết định tính triterpenoid theo thử nghiệm Liebermann-Burchard trích ly vỏ bào tử 88 Bảng 3.16 Bảng tổng kết thử nghiệm định tính phần vỏ bào tử 88 Bảng 3.17 Bảng tổng kết thử nghiệm tất pha trích ly dịch phá vỡ bào tử vỏ bào tử 89 Bảng 3.18 Hàm lượng polysaccharide có dịch phá vỡ bào tử vỏ bào tử từ 100g bào tử phá vỡ vách enzyme kết hợp siêu âm không siêu âm 91 Bảng 3.19 Bảng phân tích hàm lượng polysaccharide hai pha trích ly lỏng lỏng dịch phá vỡ bào tử diethyl ether hexane từ 100 g bào tử không siêu âm siêu âm 92 Bảng 3.20 Hàm lượng lipid có dịch phá vỡ bào tử vỏ bào tử từ 100g bào tử phá vỡ vách enzyme kết hợp siêu âm không siêu âm 92 Bảng 3.21 Giả sử hàm lượng polysaccharide tổng lipid mẫu khơng siêu âm 100% từ tính được% polysaccharide tổng lipid mẫu lại nhằm so sánh ảnh hưởng siêu âm lên hàm lượng polysaccharide lipid bào tử nấm Linh Chi 93 Bảng 3.22 Tỉ lệ phần trăm quét gốc tự DPPH đối chứng dương Trolox 97 Bảng 3.23 Tỉ lệ phần trăm (%) quét gốc tự DPPH mẫu dầu bào tử 97 Bảng 3.24 Bảng giá trị IC50 (µg/ml) mẫu dầu bào tử 98 Bảng 3.25 Tỉ lệ phần trăm chết ấu trùng Artemia nauplii theo nồng độ hoạt chất dung dịch nuôi cấy Artemia nauplii PHC SA (mg/ml) 101 vii Đồ án tốt nghiệp Note: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate Alpha 0.01 Error Degrees of Freedom Error Mean Square 6.399078 Critical Value of t 3.70743 Least Significant Difference 7.6575 Means with the same letter are not significantly different t Grouping Mean N MAU A 23.810 SASA A A 16.650 KSA B 5.693 SATR XỬ LÍ ANOVA SO SÁNH GIỮA SIÊU ÂM VÀ KHÔNG SIÊU ÂM ‘SO SANH SA VA KSA’ The ANOVA Procedure Dependent Variable: SL Source DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F Model 76.8984000 76.8984000 Error 33.2860000 8.3215000 Corrected Total 110.1844000 9.24 0.0384 R-Square Coeff Var Root MSE SL Mean 0.697906 Source DF MAU 14.25952 2.884701 20.23000 Anova SS Mean Square F Value Pr > F 76.89840000 76.89840000 9.24 0.0384 The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for SL Note: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate 15 Đồ án tốt nghiệp Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom Error Mean Square 8.3215 Critical Value of t 2.77645 Least Significant Difference 6.5395 Means with the same letter are not significantly different t Grouping Mean N MAU A 23.810 SASA B 16.650 KSA XỬ LÍ ANOVA ẢNH HƯỞNG CỦA ĐỘ KHUẾCH ĐẠI SA 75% SA 100% QUA CÁC NGÀY D2: ngày 2, D4: ngày 4, D6: ngày 6, D8: ngày 8, D10: ngày 10 S75: siêu âm độ khuếch đại 75 %, SA100: siêu âm độ khuếch đại 100 % ‘TY LE PHA VO THEO NGAY VOI DO KHUECH DAI SIEU AM 75 VA 100’ The GLM Procedure Dependent Variable: TL Source DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F Model 11 1754.294743 159.481340 Error 18 44.228007 2.457111 Corrected Total 29 1798.522750 64.91 F K 2.727060 1.363530 0.55 0.5836 D 446.487333 111.621833 45.43