Tổng quan quy trình phá vỡ bào tử nấm linh chi và bước đầu nghiên cứu điều kiện nẩy mầm của bào tử này

Đồ án tốt nghiệp MỤC LỤC MỤC LỤC i DANH MỤC CÁC HÌNH iv DANH MỤC CÁC BẢNG vi LỜI MỞ ĐẦU 1.Tính cấp thiết đề tài Tình hình nghiên cứu Mục đích đề tài .2 4.Nhiêm vụ nghiên cứu Phương pháp nghiên cứu Kết đạt đề tài CHƯƠNG I: TỔNG QUAN .4 1.1 Nấm Linh chi 1.2 Phân loại 1.2.1 Phân loại theo khoa học 1.2.2 Phân loại theo hình dạng màu sắc 1.3 Đặc tính sinh học nấm Linh chi .8 1.3.1 Mũ nấm 1.3.2 Thụ tầng 10 1.3.3 Cuống nấm 10 1.3.4 Bào tử nấm Linh chi 10 1.4 Chu kỳ sống nấm Linh chi 14 1.5 Điều kiện sinh trưởng phát triển nấm Linh chi .15 1.5.1 Dinh dưỡng 15 1.5.2 Nhiệt độ 16 1.5.3 Độ ẩm 16 1.5.4 Khơng khí 16 1.5.5 Ánh sáng .16 i Đồ án tốt nghiệp 1.5.6 Trị số pH .16 1.6 Tác dụng trị liệu nấm Linh chi bào tử nấm Linh chi 16 1.7 Thành phần hóa dược bản, thành phần khống đặc tính dược lý nấm Linh chi bào tử nấm Linh chi 21 1.7.1 Thành phần hóa dược đặc tính dược lý 25 1.7.2 Thành phần khoáng nấm Linh Chi 36 1.7.3 Thành phần khoáng đa lượng nấm Linh chi (chủng Linh chi Đà Lạt) 37 1.8 Phá vỡ vách bào tử nấm Linh chi phương pháp nảy mầm kết hợp phương pháp hóa học học 38 1.8.1 Sơ đồ bước phá vách bào tử nấm Linh chi phương pháp nảy mầm (theo patent EP 092 765 A2) 41 1.8.2 Sơ đồ bước thúc đẩy nảy mầm bào tử nấm Linh chi (CN 1807575 A) 50 1.9 Định lượng định tính số hoạt chất sinh học nấm Linh chi (Đàm Nhận, 1996) 53 1.9.1 Định tính Triterpenoid (kết xem phụ lục A) 53 1.9.2 Định tính thành phần chất khử (kết xem phụ lục A) 53 1.9.3 Định tính aminoacid (kết xem phụ lục A) 53 CHƯƠNG II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP .54 2.1 Vật liệu – thiết bị - hóa chất 54 2.1.1 Vật liệu 54 2.1.2 Thiết bị dụng cụ .54 2.1.3 Môi trường 55 2.2 Phương pháp .57 2.2.1 Phương pháp luận 57 2.2.2 Xác định tác nhân khử trùng 58 2.2.3 Khảo sát khả khử trùng tác nhân khử trùng thích hợp theo nồng độ 58 ii Đồ án tốt nghiệp 2.2.4 Sơ đồ bố trí thí nghiệm bào tử nảy mầm .60 2.2.5 Nảy mầm bào tử nấm Linh chi mơi trường thóc 61 2.2.6 Nảy mầm bào tử nấm Linh chi môi trường dịch chiết khoai tây 61 2.2.7 Kích hoạt nảy mầm bào tử nấm Linh chi 62 2.2.8 Phương pháp xác định sơ khả tổng hợp enzyme chitinase cách đo đường kính vòng phân giải 63 CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 64 3.1 Xác định tác nhân khử trùng .64 3.2 Khảo sát khả khử trùng tác nhân khử trùng thích hợp theo nồng độ 66 3.3 Nảy mầm bào tử mơi trường thóc .66 3.4 Nảy mầm bào tử nấm Linh chi môi trường dịch chiết khoai tây 68 3.5 Kích hoạt nảy mầm bào tử nấm Linh chi dung dịch dinh dưỡng 69 3.6 Xác định sơ khả tổng hợp enzyme chitinase cách đo đường kính vòng phân giải 70 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 72 TÀI LIỆU THAM KHẢO 79 PHỤ LỤC iii Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC CÁC HÌNH Trang Hình 1.1: Hồng chi (Laetiporus sulphureus) Hình 1.2: Thanh chi (Ganoderma genus) Hình 1.3: Bạch chi (Fomitopsis officinalis) Hình 1.4: Hồng chi (Ganoderma tsugae) Hình 1.5: Hắc chi (Polyporus melanopus) Hình 1.6: Tử chi (Ganoderma sinense) Hình 1.7: Cấu tạo nấm Linh chi Hình 1.8: Hình thái giải phẫu thể bào tử đảm 12 Hình 1.9: Các kiểu bào tử đảm đặc thù họ Linh chi Ganodermataceae 14 Hình 1.10: Chu kì sống nấm Linh chi 15 Hình 1.11: 29 triterpenoids chiết xuất từ bào tử nấm Linh chi từ năm 1988 (Bingji Ma et al., Nov 2011) 30 Hình 1.12: Sơ đồ tổng quát bước phá vỡ theo EP 092 765 A2 43 Hình 1.13: Sơ đồ kích hoạt nảy mầm dịch chiết malt 45 Hình 1.14: Sơ đồ kích hoạt nảy mầm nước dừa 46 Hình 1.15: Sơ đồ kích hoạt nảy mầm dịch chiết nấm Linh chi 47 Hình 1.16: Sơ đồ kích hoạt nảy mầm môi trường dinh dưỡng chứa biotin 48 Hình 1.17: Sơ đồ kích hoạt nảy mầmbằng dung dịch dinh dưỡng chứa kali photphat magnesium sulfate 49 Hình 1.18: Sơ đồ kích hoạt nảy mầm dung dịch dinh dưỡng chứa 5% capillitia dịch chiết malt 1% 50 Hình 1.19 Sơ đồ kích hoạt nảy mầm nước cất 51 Hình 1.20 Sơ đồ kích hoạt nảy mầm theo patent CN 1807575 A 52 Hình 2.1 Sơ đồ khái qt quy trình thí nghiệm 61 Hình 2.2 Sơ đồ bố trí thí nghiệm 64 Hình 2.3 Quy trình kích hoạt nảy mầm bào tử nấm Linh chi 66 Hình 3.1:Tác nhân khử trùng H2O2 nước cất vô trùng 68 iv Đồ án tốt nghiệp Hình 3.2 Tác nhân khử trùng javel 2% 69 Hình 3.3.Ảnh hưởng H2O2 lên khả nảy mầm bào tử nấm Linh chi 70 Hình 3.4: Tơ nấm Linh chi phát triển mạnh mơi trường thóc 71 Hình 3.5: Tơ nấm Linh chi quan sát kính hiển vi (100X) 71 Hình 3.6 Sợi nấm Linh chi môi trường dịch chiết khoai tây 72 Hình 3.7: Bào tử kích hoạt nước dừa 73 Hình 3.8: Bào tử kích hoạt PD lỏng có bổ sung 0,1% KH3PO4 0,1% MgSO4.7H2O 73 Hình 3.9: Khả sinh tổng hợp enzyme chitinase 75 v Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 1.1: Biến động kích thước bào tử đảm nấm Linh chi chuẩn mẫu vật khác (Lê Xuân Thám, 1996) 11 Bảng 1.2: Lục bảo linh chi tác dụng trị liệu 18 Bảng 1.3: Thử nghiệm chiết cồn – nước rửa loài Ganoderma 19 Bảng 1.4: Thành phần hóa học Ganoderma lucidum (Trung Quốc Việt Nam) xác định gồm chất 24 Bảng 1.5: Một số loài Linh Chi phân chất 24 Bảng 1.6: Thành phần hoạt chất nấm Linh chi (Lê Xuân Thám, 1996) 25 Bảng 1.7: Danh sách triterpenoids từ bào tử nấm Linh chi 31 Bảng 1.8: Hàm lượng khoáng đa lượng thể nấm Linh chi 38 Bảng 1.9: Hàm lượng khoáng đa lượng bào tử đảm 39 Bảng 1.10: Thành phần hoạt chất nấm Linh chi với trạng thái sinh lý khác .39 Bảng 1.11: So sánh khả ức chế ung thư vú phận trạng thái khác nấm Linh chi (2.5mg/mL) 42 Bảng 1.12: Một số Patent nảy mầm phá vách bào tử 43 Bảng 2.1: Thành phần dinh dưỡng thóc (lúa) 55 Bảng 2.2: Thành phần khống thóc (lúa) 56 Bảng 3.1: Thành phần khoáng thóc nấm Linh chi 63 Bảng 3.2: Hoạt tính enzyme sinh giai đoạn nuôi tơ nấm Linh chi 24 68 vi Đồ án tốt nghiệp LỜI MỞ ĐẦU 1.Tính cấp thiết đề tài Hơn 4.000 năm trước (từ thời Hoàng đế 2550 – 2140 TCN), giá trị dược liệu nấm Linh chi ghi chép thư tịch cổ (Zhao, J.D…1994) Từ tới trải qua thăng trầm lịch sử, bao biến động thời tiết, khí hậu, môi trường, Linh chi trường tồn thể giá trị siêu dược liệu nhân sâm (Đỗ Tất Lợi et al., 1994) Việc nghiên cứu, phát triển sử dụng Linh chi công nghiệp hóa với quy mơ rộng lớn, phân loại học, thu hái tự nhiên, nuôi trồng chủ động, chế biến bào chế dược phẩm đồng thời nghiên cứu hóa dược hoạt chất, tác dụng dược lý phương cách điều trị lâm sàng Tuy nhiên, theo nhìn thấy, Linh chi nước ta từ bao đời hoang dại có nguy xói mòn nguồn gen q tượng suy thối mơi trường Vì cho nên, vấn đề đặt khai thác, nghiên cứu, tận dụng chúng cách có hiệu để khơng lãng phí ưu đãi thiên nhiên Mặc dù người ta tin bào tử Linh đại diện cho chất Linh chứa tất chất hoạt tính sinh học Linh chi, hầu hết nghiên cứu nấm Linh chi tiến hành cách sử dụng thể sợi nấm Linh chi làm vật liệu thử nghiệm, bào tử nấm Linh chi nghiên cứu tỷ lệ nảy mầm chúng thấp – 15% Vì việc nghiên cứu nảy mầm bào tử nấm Linh chi quan trọng định thành công giai đoạn nghiên cứu sau nảy mầm Tình hình nghiên cứu Các nước Châu dẫn đầu nghiên cứu hóa dược, ni trồng bào chế loại Linh chi Thực tế số tác giả quan tâm phân tích lớp vỏ láng lồi Ganoderma Amauroderma vào thập niên 20, phát ergosterol enzyme phennoloxydase, peroxydase,…ở nấm Linh chi Ganoderma lucidum Gần có lẻ tẻ khảo cứu tác dụng gây dị ứng bệnh đường hô hấp bào tử số loài Linh chi Ganoderma Aukland (New Zealand)(Hasnain, SM., et al 1985), Đồ án tốt nghiệp đặc biệt thành tố chiết từ G applanatum, G lucidum G meredithiae New Orleans (Hoa Kỳ) Hội nghị nấm học giới 7/1994 Vancouver (Canada) dành riêng hội thảo Linh chi, kết đến định thành lập Viện nghiên cứu Linh chi Quốc tế nấm Linh chi, đặt trụ sở New York (Hoa Kỳ) Do vậy, vào tháng 10/1994 Hội nghị Quốc tế nấm Linh chi tổ chức Bắc Kinh, Trung Quốc Tại quan điểm tồn độc lập họ Linh chi Ganodermataceae Donk với tầm quan trọng nấm làm thuốc quý Vào tháng 7/1996, Hội nghị Quốc tế nấm học Châu á, lại dành năm Hội thảo cho báo cáo Linh chi đại học Chiba, Nhật Bản Tại Hội nghị số báo cáo lớn, thể tầm quan trọng kinh tế phong phú nấm Linh chi Vào thập niên 70 – 80, bắt đầu trào lưu khảo cứu hóa dược học nấm Linh chi Chủ yếu Trung Quốc, Nhật Bản, Hàn Quốc, Đài Loan Việt Nam Gần số phòng thí nghiệm Hoa Kỳ vùng Đông Nam bắt đầu tham gia vào tiến trình Ở Việt Nam, với vi trí địa lý tự nhiên nằm vùng trung tâm phân bố họ Ganodermataceae Donk Tuy nhiên kể từ nghiên cứu Patouillard, N 100 năm trước, việc nghiên cứu hệ nấm Việt Nam nói chung Linh chi nói riêng tiến hành sơ hệ thống học, kỹ thuật nuôi trồng So với quy mô nhịp độ chung giới khu vực phải cố gắng nhiều Chính lẽ đó, nên tơi muốn đóng góp phần nhỏ cố gắng chung nghiên cứu sơ “TỔNG QUAN VỀ QUY TRÌNH PHÁ VỠ BÀO TỬ NẤM LINH CHI VÀ BƯỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU ĐIỀU KIỆN NẢY MẦM CỦA BÀO TỬ NÀY” khóa luận tốt nghiệp Mục đích đề tài -Tìm hiểu phương pháp phá vỡ bào tử nấm Linh chi qua khảo sát sáng chế liên quan - Áp dụng phương pháp biết gây nảy mầm bào tử nấm Linh chi nhiều phương pháp khác Đồ án tốt nghiệp 4.Nhiêm vụ nghiên cứu - Tổng quan nấm Linh chi tác dụng dược lý nấm Linh chi - Tổng quan quy trình phá vỡ bào tử nấm Linh chi giới - Thí nghiệm bước đầu : o Khảo sát phương pháp khử trùng bào tử o Nảy mầm bào tử nấm Linh chi môi trường thóc o Nảy mầm bào tử nấm Linh chi môi trường lỏng lắc o Khảo sát sơ hoạt tính enzyme chitinase q trình hình thành sợi nấm Phương pháp nghiên cứu Tổng quan tài liệu tiến hành thực nghiệm Kết đạt đề tài - Tổng quan quy trình phá vỡ thơng số kỹ thuật quy trình - Nảy mầm thành công bào tử nấm Linh chi trân môi trường rắn môi trường lỏng - Xác định hoạt tính enzyme chitinase ngoại bào bào tử nảy mầm - Tương đối khắc phục nhiễm q trình ni cấy Hạn chế đề tài Quá trình khắc phục tác nhân gây nhiễm nhiều thời gian, phải tiến hành thí nghiệm lặp lại nhiều lần, ảnh hưởng đến kết cần đạt Các nghiên cứu tiến hành sơ Đồ án tốt nghiệp CHƯƠNG I: TỔNG QUAN 1.1 Nấm Linh chi Từ đầu kỷ 17, nấm Linh chi nuôi trồng Trung Quốc, chính giá trị dược liệu cao chúng Ngay từ thời Hoàng đế, thư tịch cổ ghi chép giá trị Linh Chi (Zhao Ji-ding, Zhang Xiao-quing, 1994) cách 4000 năm Trong thảo cương mục ghi chép chuẩn mực hơn, nấm Linh Chi ngày coi trọng Cho nên, dễ hiểu nhà y dược Việt Nam, kế tục Lý Thời Trân, phát Linh Chi nước ta Lê Q Đơn rõ “nguồn sản vật quý đất rừng Đại Nam” 1.2 Phân loại 1.2.1 Phân loại theo khoa học Linh chi có nhiều tên gọi khác Bất Lão Thảo, Vạn Niên Thảo, Nấm lim…Mỗi tên gọi Linh chi gắn liền với giá trị dược liệu Tên gọi Linh chi bắt nguồn từ Trung Quốc, hay theo tiếng nhật Reishi Mannentake, tên gọi Latinh: Ganoderma lucidum Nấm Linh chi có vị trí phân loại rộng rãi Giới : Mycetalia Ngành nấm đảm: Basidiomycota Lớp nấm đảm: Basidiomycetes Bộ nấm lỗ: Ganodermatales Họ : Ganogermataceae Chi : Ganoderma Lồi : Ganoderma lucidum Theo trình định danh, có đến lần đặt tên khoa học cho lồi Kể từ lần Curtis W (1781) P.A Karsten – nhà nấm học Phần Lan xác định tên thức: Ganoderma lucidum (Leyss Ex Fr ) Karst đến 100 năm (1881) Đồ án tốt nghiệp 3.2 Khảo sát khả khử trùng tác nhân khử trùng thích hợp theo nồng độ Bào tử nấm Linh chi khử trùng với H2O2các nồng độ 3% 5%, cấy vào mơi trường thóc tiến hành ủ tơ từ – ngày Hình 3.3 Ảnh hưởng H2O2 lên khả nảy mầm bào tử nấm Linh chi Theo kết hình 3.3 cho thấy: - Sử dụng H2O2 với nồng độ 3% hạn chế nhiễm không gây ảnh hương đến khả nảy mầm bào tử nấm Linh chi - Sử dụng H2O2 5% môi trường không bị nhiễm nhiên bào tử nảy mầm nồng độ khử trùng cao gây tổn thương bào tử Kết luận: H2O2 có hiệu vi sinh vật vi khuẩn, nấm men, nấm, virus bào tử tùy thuộc vào nồng độ thời gian tiếp xúc (Emel Karadeniz et al., 12/1/2013) Vì vậy, thí nghiệm H2O2 3% tác nhân khử trùng thích hợp sử dụng để loại bỏ tác nhân gây nhiễm bào tử nấm Linh chi 3.3 Nảy mầm bào tử mơi trường thóc Sau cấy bào tử nấm lên mơi trường thóc ủ tơ bóng tối từ – 5, hệ tơ nấm bắt đầu phát triển ngày thứ ba mạnh ngày thứ năm Tơ nấm Linh 66 Đồ án tốt nghiệp chi có mà trắng đục quan sát mắt thường biết chúng có vách ngăn quan sát kính hiển vi vật kính 100X Hình 3.4 Tơ nấm Linh chi phát triển mạnh mơi trường thóc Hình 3.5.Tơ nấm Linh chi quan sát kính hiển vi (100X) 67 Đồ án tốt nghiệp 3.4 Nảy mầm bào tử nấm Linh chi môi trường dịch chiết khoai tây Nấm Linh chi thuộc nhóm nấm hoại sinh hiếu khí, q trình ni cấy hệ sợi nấm Linh chi mơi trường lỏng nên bổ sung khí oxy thiết bị lắc Trong thí nghiệm oxy cung cấp cho hệ sợi phát triển cách dung máy lắc quy mơ phòng thí nghiệm với số vòng lắc 150 vòng/phút Hình 3.6 sợi nấm Linh chi môi trường dịch chiết khoai tây - Các búi sợi nấm hình thành đồng ngày thứ q trình ni cấy, chứng tỏ mơi trường dịch chiết khoai tây mơi trường thích hợp cho nảy mầm bào tử nấm Linh chi 68 Đồ án tốt nghiệp 3.5 Kích hoạt nảy mầm bào tử nấm Linh chi dung dịch dinh dưỡng Ngâm bào tử vào môi trường với dụng dịch kích hoạt nảy mầm nước dừa 350C 30 phút PD lỏng 210C sau chuyển vào đĩa petri có chứa giấy lọc làm ẩm Cả hai phương pháp nhằm mục đích quan sát giai đoạn hình thành ống mầm bào tử nấm Linh chi nảy mầm Hình 3.7 Bào tử kích hoạt nước dừa Hình 3.8 Bào tử kích hoạt PD lỏng có bổ sung 0,1% KH3PO4 0,1% MgSO4.7H2O 69 Đồ án tốt nghiệp Ở hai thí nghiệm khơng quan sát thấy hình thành ống mầm, bào tử trạng thái ngủ Thí nghiệm khơng thành cơng giai đoạn kích hoạt nảy mầm sử dụng dung dịch dinh dưỡng chuyển sang giai đoạn ủ tiến hành môi trường ẩm không bổ sung dinh dưỡng nên bào tử khơng có điều kiện nảy mầm Từ nhận xét này, người thực đề tài cho cần tiếp tục nghiên cứu môi trường dinh dưỡng nên bổ sung vào giai đoạn ủ để tạo điều kiện thuận lợi cho bào tử nảy mầm 3.6 Xác định sơ khả tổng hợp enzyme chitinase cách đo đường kính vòng phân giải Khi ni cấy mơi trường có bổ sung huyền phù chitin, vi khuẩn sinh enzyme chitinase phân giải chitin thành dạng có cấu trúc mạch ngắn n-acetyl-D- glucosamie Các dạng không cho phản ứng màu với thuốc thử lugol Do cho thuốc thử lugol, độ lớn phần suốt môi trường phản ánh khả sinh tổng hợp chitinase vi khuẩn Phương pháp định tính enzyme, đánh giá sơ khả tổng hợp enzyme chitinase chưa xác định hoạt độ chitinase Theo nghiên cứu trước (EP 092 765 A2) số enzyme sử dụng để hổ trợ cho trình phá vách bào tử nấm Linh chi, có enzyme chitinase Cho đến nay, chưa có nghiên cứu khẳng định thành phần lớp vỏ kép bảo vệ bên bào tử nấm Linh chi Tuy nhiên, dựa vào quy luật chung cấu tạo loại nấm tin cấu tạo lớp vỏ bào tử nấm Linh chi có phần chitin Và việc sử dụng enzyme chitinnase nấm sinh trình nảy mầm để tiến đến việc sử dụng chúng để ứng dụng vào quy trình phá vách bào tử hồn tồn Kết thí nghiệm khả tổng hợp enzyme ngoại bào chitinase nấm Linh chi giai đoạn phát triển hệ sợi: 70 Đồ án tốt nghiệp Hình 3.9 khả sinh tổng hợp enzyme chitinase Bảng 3.2.Hoạt tính enzyme sinh giai đoạn nuôi tơ nấm Linh chi 24 enzyme D (cm) d (cm) Hoạt tính enzyme (D – d) chitinase 0,8 1,2 Kết chứng minh được: - Linh chi có khả tổng hợp enzyme chitinase trình nảy mầm - Việc đề nghị sử dụng enzyme chitinase quy trình phá vách bào tử có sơ sở 71 Đồ án tốt nghiệp CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận Nấm Linh chi với đặc điểm hình thái đặc biệt đặc tính dược lý đa dạng quan tâm nghiên cứu từ lâu đời Cho đến có nhiều nghiên cứu khẳng định khả siêu dược liệu chúng Và từ đó, nấm Linh chi ứng dụng vào y học cách có hiệu Các nước giới sâu vào nghiên cứu khả dược liệu nấm Linh chi thông qua sáng chế nảy mầm phá vách bào tử Các sáng chế góp phần khơng nhỏ công nghiên cứu nảy mầm, phá vỡ tách chiết nhằm nâng cao giá trị dược liệu lồi nấm Thơng qua q trình nghiên cứu sơ bộ, người thực đề tài thu thông số sau: - H2O2 3% tác nhân thích hợp cho việc khử trùng bào tử nấm Linh chi - Mơi trường thóc mơi trường ni ủ tơ nấm Linh chi thích hợp, độ thống khí mơi trường tương đối cao, thích hợp với nhu cầu hiếu khí phát triển tơ nấm Linh chi - Bào tử nấm Linh chi có khả sinh tơ môi trường lỏng lắc cụ thể môi trường dịch chiết khoai tây lỏng với vòng lắc 150 vòng/ phút - Đã xác định khả sinh enzyme ngoại bào chitinase nấm Linh chi giai đoạn phát triển hệ sợi Kiến nghị - Thí nghiệm cần lặp lại nhiều lần - Tiếp tục nghiên cứu điều kiện kích hoạt nảy mầm bào tử với dung dịch dinh dưỡng khác - Tiếp tục nghiên cứu ảnh hưởng enzyme chitinase lên vách bào tử nhằm phục vụ cho việc phá vỡ thuận lợi tách chiết hoạt chất 72 Đồ án tốt nghiệp TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng việt [1] Bùi Chí Hiếu, Nguyễn Minh Luân, Nguyễn Thiện Thành, Nguyễn Văn Thành Tìm hiểu tác dụng lâm sàng nấm Lingzhi Ganoderma lucidum Thành phố Hồ Chí Minh 1993 [2] Đỗ Tất Lợi, Lê Duy Thắng, Trần Văn Luyến Nấm Linh chi nuôi trồng sử dụng NXB Nông Nghiệp , Thành phố Hồ Chí Minh (1994) [3] Lê Xuân Thám Nấm Linh Chi nguồn dược liệu quý Việt Nam Nhà xuất Mũi Cà Mau (1996) [4] Đàm Nhận, nghiên cứu thành phần loài số đặc điểm sinh học họ nấm Linh chi (Ganodermataceae Donk) Việt Nam, Hà Nội 1996 [6] Đàm Nhận, Lê Xuân Thám Nghiên cứu tương đồng tính trạng hình thái hóa sinh đại diện chi Ganoderma Karsten Tạp chí di truyền ứng dụng, 4:10 – 13 Hà Nội (1994) [7] Lê Xuân Thám, Thêm loài nấm Linh chi Ganoderma amboinense (Lam Ex Fr.) Pat.được nuôi trồng Đà Lạt Tài liệu tiếng nước [8] Bingji Ma, Wei Ren, Yan Zhou, Jinchuan Ma, Yuan Ruan, and Chun – Nan Wen, Triterpenoids from the spores of Ganoderma lucidum, North American Journal of Medical Sciences, 2011 November, 3(11): 495-498 [9] Báo cáo FDA 1/8/1999 [10] Chee-Keung Chung, Siu-Kan Tong Effects of sporoderm-broken germination activated ganoderma spores on treatment of spinal cord injury Patent 7132103 7/11/2006 [11] Chee-Keung Chung, Siu Kan Tong Anti-aging/menopause symptoms relief using ganoderma lucidum spores Patent 6908614 21/6/2005 [12] Chee-Keung Chung, Siu-Kan Tong External preparation for skin containing oleaginous substances extracted from Patent 7060286 13/6/2006 73 Đồ án tốt nghiệp [13] Chee-Keung Chung, Siu Kan Tong Ganoderma lucidum spores for treatment of autoimmune diseases Patent 6893641.17/5/2005 [14] Chen T W., Y K Wong, S S Lee In vitro cytotoxicity of Ganoderma lucidun on oral cancer cells Chung – Hua – I – Hsueh – Tsa – Chinh – Taipei 1991 [15] Chen, T Q., K B Li, Q Y Wen, Z Sh Chen, J Xu, 1994 A primary report of the study on enrichment of germanium in fruitbodies og Ganoderma lucidum Proc 94 Inter Symp On Ganoderma Res : 78 – (1994) [16] Chi-Chen Lin, Yen-Ling Yu, Chia-Chiao Shih, Ko-Jiunn Liu, Keng-Liang Ou, Ling-Zong Hong, Jody D C Chen, Ching-Liang Chu A novel adjuvant Ling Zhi-8 enhances the efficacy of DNA cancer vaccine by activating dendritic cells 17/4/2011 [17] Chung Chee-Keung, Method for promoting Ganoderma lucidum spore gemination, CN 1807575 A 20/6/2006 [18] Department of health & human services food and drug administration, AUG 1/8/1999 [19] Emel Karadeniz *, Fatma Esen Sarigullu and Isil Untac Isolation and germination of Ganoderma lucidum basidiospores and effect of H2O2 on the germination of spores 12/1/2013 [20] Erdtman, G., 1952 Pollen Morphology and Plant Taxonomy An introduction to palynology I Stockholm (1952) [21] Gau, J P., C K Lin S S Lee S R Wang 1990 The lack of antiplatelet effect of crude extracts from Ganoderma lucidum on HIV – positive hemophiliacs Am J Chin Med [22] Hasnain, S.M.,J.D Wilson, F J Newhook 1985 Fungal allergy and respiratory disease, New Zealand med.J 98 (778): 342 – 346 (1985) [23] Hansen, L 1958 On the anatomy of the Danish species of Ganoderma Bot Tidsskrifft 54:333 – 352 (1958) 74 Đồ án tốt nghiệp [24] He, Y R Li, Q Chen, Z Lin, D Xia, L Ma, 1992 Chemical studies on immunologically active polysaccharides of Ganoderma lucidum (Leyss Ex Fr.) Karst Chung – Kuo – Chung – Yao – Tsa – Chih 17 (4):266 – 256 (1992) [25] Hikino H., C Konno, Y Mirin, and T Hayashi 1985 Isolation and hypoglycemic activity of Ganoderans A and B glycans of Ganoderma lucidum fruiting bodies Planta Med : 339 – 340 (1985) [26] Jian-Ping Yuan et al, Determination of Ergosterol in Ganoderma Spore Lipid from the Germinating Spores of Ganoderma lucidum by High-Performance Liquid Chromatography, Food Engineering Research Center of State Education Ministry [27] Jing-Ping Zhang1, Limin Zheng1, Jiang-Hai Wang2, Karl-Eric Magnusson3 and Xiu Liu 2* Lipid Extract from Completely SporodermbrokenGerminating Ganoderma sinensis Spores Elicits Potent Antitumor Immune Responses in Human Macrophages [28] Kino K., A Yamashita K Yamaoka, J Watanabe S Tanaka K Ko K Shimizu and H Ysunoo 1989 Isolation and characterization of a new immunomodulatory protein, Lingzhi – I Biol chem 264 : 472 – 478 (1989) [29] Kino K., T Sone J Watanabe A Yamashita., H Tsuboi, H Miyajima H Tsunoo 1991 Immunomodulator, L Z prevent antibody production in mice [30] Lei L S., Z B Lin 1993 Effect of Ganoderma lucidum extracts and filtrate of Escherichia coli culture on leukocyte and immune function in aged mice Yao – Hsueh – Hsueh – Pao, 28(8): 577 – 82 (1993) [31] Liu, G T T T.Bao X Y Niu, s Z Li and Z Y Sung 1979 Some pharmacological actions of the spores of Ganoderma lucidum and the mycelium of Ganoderma capense cultivated by submerged fermentation Chinese Medical J 92 496 – 500 (1979) [32].Liu, Xin, Chung, Chee-Keung EP 092 765 A2, 16/05/2000 75 Đồ án tốt nghiệp [33] Lin Zh., Sh Lei 1994 The immunomodulatory effects of Ganoderma polysaccharides and its mechanisms Proc 94 inter Sym On Ganoderma Res :37 – 38 Beijing China (1994) [34] Lu Zh W., Zh B Lin 1994 Amtagonistic effect of Ganoderma polysaccharides peptide against immunomosuppression of morphine Pro 94 inter Sym On Ganoderma Res :82 Beijing, China (1994) [35] Lui X J 1994 Hepatopathy and Uterofunctional Bleeding mainly Treated with Ganoderma lucidum Proc 94 Inter Sym On Ganoderma Res :58 – Beijing China.(1994) [36] Lui X J., 1994 Hepatopathy and Uterofunctional Bleeding mainly Treated with Ganoderma lucidum Proc 94 inter Sym On Ganoderma Res :58 – Beijing China (1994) [37] Mims C W., and F Seabury 1989 Ultrastructure of tube formation and basidiospores development in Ganoderma lucidum Mycologia 81: 754 – 764 (1989) [38] Patouillard, N 1989 Le genre Ganoderma Bull Soc Mycol France : 64 – 80 (1889) [39] Perihan Güler1*, Fatih Kutluer2 and İlknur Kunduz1 Screening to Mycelium Specifications of Ganoderma lucidum (Fr.) Karst (Reishi) 2011 [40] Perreau J 1973 Contribution aletude des ornaments sporaux chez Ganodermes Rev mycol Paris 37:241 – 252 (1973) [41] Seanleegardner The Different Kinds of Reishi 11/5/2012 [42] Sissi Wachtel-Galor, John Yuen, John A Buswell, and Iris F F Benzie Ganoderma lucidum (Lingzhi or Reishi) 2011 [43] Sliva D1, Sedlak M, Slivova V, Valachovicova T, Lloyd FP Jr, Ho NW Biologic activity of spores and dried powder from Ganoderma lucidum for 76 Đồ án tốt nghiệp the inhibition of highly invasive human breast and prostate cancer cells 9/4/2003 [44] Sone Y., R Okuda, N Wada., E Khishida, and A Misaki 1985: Structures and antitumor activities of the polysaccharides isolated from fruiting body and the grow culture of mycelium of Ganoderma lucidum Agric Biol Chem 49: 2641 – 2653 (1985) [45] Tao, J., Feng K., 1990 Experimental and clinical studies on inhibitory effect of Ganoderma lucidum on Platelet aggregation J Tongji Univ 10(4):240 – (1990) [46] Wang, C N., J C Chen, M S Shiao, and C T Wang 1989 The aggregation of human platelet induced by ganodermic acid S Biochemica et Biophysica Acta 986 : 151 – 160 (1989) [47] Wang, Chi Zh Y Hua, 1994 A new kind of preparation of Ganoderma lucidum in treating 35 patients with coronary cardiac disease Proc 94 inter Symp On Ganoderma Res Beijing, china (1994) [48] Wang, J F., J J Zhang W W Chen 1985 Study of the action of Ganoderma lucidum on scavenging hydroxyl radicals from plasma J Tradit Chin Med 5(1) :55 – 60 [49] Xiao, P G., S.T.Xing L.W.Wang 1993 Immunological aspects of chinese medicinal plant as antiageing drugs J Ethnopharmacol [50] Xin Liu, Chee-Keung Chung Germination activated Ganoderma lucidum spores and method for producing the same Patent 6468542 22/10/2002 [52] Xin Liu, Chee-Keung Chung Germination activated red Ganoderma lucidum spores and method for producing the same Patent 6316002 13/11/2001 [53] Xin Liu, Xiao-Ni Huang, Peter Chee-Keung Chung Method for extracting oleaginous substances from germination-activated Ganoderma lucidum spores Patent 6440420 27/8/2002 77 Đồ án tốt nghiệp [54] Yang J J., D Q Yu 1990 Synthesis of ganoderma alkaloid A and B Yao – Hsueh – Hsueh – Pao, 25(7):555 – (1990) [55] Zhao, J.D.,Zhang, X.Q., 1994 Resources and taxonomy of lingzhi Ganoderma in China Proc 94 inter Sym On Ganoderma Res.:44 – 47 Beijing, China (1994) 78 Đồ án tốt nghiệp PHỤ LỤC Phụ lục A: Kết định tính hoạt chất sinh học nấm Linh chi Kết định tính thành phần triterpenoid Ganoderma lucidum sắc ký lớp mỏng với thuốc thử Vanilin acid phosphoric Vết số Rf Rx so với Acid Hiện màu với thuốc Oleanolic thử Vanilin phosphoric acid quan sát ánh sáng thường Acid Oleanolic 0,35 – 0,45 Tím – Xanh tím Dịch chiết 0,08 – 0,12 0,23 – 0,27 Tím đỏ Ganoderma 0,15 – 0,20 0,43 – 0,45 Xanh nhạt lucidum 0,25 – 0,35 0,65 – 0,70 Xanh 0,35 – 0,45 Xanh nhạt 0,45 – 0,55 1,20 – 1,30 Tím đậm – Xanh tím Ngồi sắc phổ có thêm vết phụ màu xanh tím nhạt Rf: 0,60 – 0,70 Rf: 0,75 – 0,85 Kết định tính thành phần chất khử sắc ký lớp mỏng với thuốc thử Tetrazolium Blue loài Ganoderma lucidum Vết Rf Hiện màu với thuốc thử Tetrazolium Blue quan sát ánh sáng thường Dịch chiết phân 0,30 – 0,375 Màu tím xanh đoạn vả lồi 0,40 – 0,475 Màu tím xanh 0,17 – 0,25 Màu tím Ganoderma lucidum Dung dịch coctison acetat 0,1% Đồ án tốt nghiệp Kết định tính thành phần aminoacid loài Ganoderma lucidum sắc ký giấy với thuốc thử NIH Sắc phổ dịch chiết Ganoderma Vết Sắc phổ aminoacid chuẩn lucidum phân đoạn Dịch Màu sắc Rf Rf Màu sắc aminoacid chiết Linh chi Tím 0,02 – 0,04 0,02 – 0,05 Tím Cystin Tím 0,05 – 0,10 0,05 – 0,10 Tím Lysin Tím 0,10 – 0,15 0,10 – 0,15 Tím Arginin Tím 0,17 – 0,20 0,10 – 0,15 Tím Histidin Tím 0,20 – 0,25 0,30 – 0,35 Tím Threonin Tím 0,30 – 0,35 0,50 – 0,55 Tím Methionin Đỏ 0,35 – 0,37 0,50 – 0,55 Tím Valin Vàng 0,37 – 0,42 0,65 – 0,70 Tím Leuxin Tím 0,50 – 0,55 0,75 – 0,80 Xanh tím Phenylalanin Tím 0,65 – 0,70 10 Tím 0,70 – 0,75 11 Tím 0,85 – 0,90 12 ... chung nghiên cứu sơ “TỔNG QUAN VỀ QUY TRÌNH PHÁ VỠ BÀO TỬ NẤM LINH CHI VÀ BƯỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU ĐIỀU KIỆN NẢY MẦM CỦA BÀO TỬ NÀY” khóa luận tốt nghiệp Mục đích đề tài -Tìm hiểu phương pháp phá vỡ bào. .. lý nấm Linh chi - Tổng quan quy trình phá vỡ bào tử nấm Linh chi giới - Thí nghiệm bước đầu : o Khảo sát phương pháp khử trùng bào tử o Nảy mầm bào tử nấm Linh chi môi trường thóc o Nảy mầm bào. .. nghiệm bào tử nảy mầm .60 2.2.5 Nảy mầm bào tử nấm Linh chi môi trường thóc 61 2.2.6 Nảy mầm bào tử nấm Linh chi môi trường dịch chi t khoai tây 61 2.2.7 Kích hoạt nảy mầm bào tử nấm Linh chi