Nghiên cứu chiết tác limonene và một số dẫn xuất từ nguồn thực vật việt nam sử dụng phòng trừ côn trùng trong y tế

Những nội dung đề tài thực hiện: - Khảo sát hàm lượng Limonene trong một số vỏ quả có múi. - Tiến hành tách Limonene bằng hai phương pháp: cất lôi cuốn hơi nước kết hợp cất phân đoạn dưới áp suất giảm và chiết Limonene bằng SCO2 (Supercritical Carbondioxide). - Phân tích và so sánh chất lượng sản phẩm chiết bằng hai phương pháp trên. - Gia công thử nghiệm chế phẩm. - Thử hoạt tính sinh học về tác dụng phòng ngừa ruồi, muỗi.

BỘ CÔNG THƯƠNG VIỆN HÓA HỌC CÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

BỘ CÔNG THƯƠNG VIỆN HÓA HỌC CÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

Chủ nhiệm đề tài: ThS Nguyễn Ngọc Thanh

Cán bộ tham gia: TS Phan Thanh Bình

CN Lê Ngọc Thức

KS Đoàn Thị Xuân Liễu

Hà Nội 12/2010

MỤC LỤC

LỜI MỞ ĐẦU 1

1 Các biện pháp phòng trừ côn trùng y tế 2

1.1.Tác hại của côn trùng y tế tới sức khỏe cộng đồng 2

1.2 Các biện pháp phòng trừ ruồi muỗi 5

1.2.1.Biện pháp diệt ruồi, muỗi 3

1.2.2 Các biện pháp phòng ngừa ruồi, muỗi 5

1.3 Limonen và ứng dụng trong phòng ngừa côn trùng y tế 6

1.3.1 Nguồn tinh dầu chứa Limonene 6

1.3.2 Thành phần hóa học của một số tinh dầu vỏ quả có múi thuộc

1.4 Đặc tính hóa lý và hoạt tính sinh học của Limonene (D- Limonene) 9

1.4.1 Đặc tính hóa lý 9

1.4.2 Hoạt tính sinh học của Limonene 10

1.5 Tình hình nghiên cứu và ứng dụng Limonene (D-Limonene) 11

1.6 Các phương pháp chiết tinh dầu và Limonene 13

1.6.1 Cất lôi cuốn hơi nước 13

1.6.2 Chiết SCO2 (CO2 ở trạng thái siêu tới hạn) 13

1.6.3 Các phương pháp khác 15

1.6.4 Lựa chọn phương pháp án công nghệ 15

CHƯƠNG II THỰC NGHIỆM 18

2.1 Đối tượng nghiên cứu 16

2.2 Phương pháp nghiên cứu 16

2.2.1 Cất lôi cuốn hơi nước 16

2.2.1.1 Thiết kế nghiên cứu 16

2.2.1.2 Cách tiến hành 17

2.2.2 Chiết bằng SCO2 18

2.2.2.1 Lựa chọn đối tượng nghiên cứu 18

2.2.2.2 Quy hoạch hóa thực nghiệm xác định điều kiện chiết tối ưu 18

2.5.1 Quy trình khảo nghiệm đối với ruồi (quy trình diệt) 22

2.5.2 Quy trình khảo nghiệm đối với muỗi (quy trình diệt) 23

CHƯƠNG III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 24

3.1 Lựa chọn đối tượng nghiên cứu 24

3.1.1 Khảo sát hàm lượng Limonene bằng phương pháp chưng cất lôi cuối

và cất phân đoạn 24 3.2.1 Khảo sát hàm lượng D- Limonene trong tinh dầu vỏ quả theo phương

3.2 Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến quy trình tách Limonene 26

3.2.1 Ảnh hưởng của thời gian đến hiệu suất chưng cất tinh dầu 26

3.2.2 Ảnh hưởng của lượng nước 27

3.3 Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu suất chiết dầu cam bằng

3.3.1 Mô hình hóa thực nghiệm xác định điều kiện chiết tối ưu 29

3.3.2 Khảo nghiệm về kích thước nguyên liệu ảnh hưởng đến hiệu suất

3.4 Kết quả thực nghiệm tách D-Limonene và gia công chế phẩm 31

3.4.1 Tách D- Limonene bằng phương pháp cất phân đoạn 31

3.4.2 Chiết D- Limonene bằng phương pháp SCO2 31

3.4.3 Phân tích cấu trúc D- Limonene 32

3.5 Gia công thử nghiệm chế phẩm phòng trừ côn trùng y tế 33

3.6 Khảo nghiệm hoạt tính sinh học Limonene ( D-Limonene) trên ruồi,

muỗi 33 3.6.1 Thử nghiệm hoạt tính trên ruồi (quy trình diệt) 33

3.6.2 Thử nghiệm hoạt tính trên muỗi (quy trình diệt) 37

3.6.3 Thử nghiệm hoạt tính của chế phẩm đối với ruồi và muỗi 39

3.7 Đề xuất quy trình sản xuất chế phẩm Limonene 40

LỜI MỞ ĐẦU

Với mục tiêu vì một môi trường an toàn nên ngày nay rất nhiều sản phẩm về lĩnh vực bảo vệ thực vật và diệt trừ côn trùng gây hại đã sử dụng nguồn nguyên liệu

tự nhiên, thân thiện với môi trường

Tinh dầu là một sản phẩm được sử dụng rộng rãi trong các ngành thực phẩm

mỹ phẩm, dược phẩm Một trong những tác dụng chung của tinh dầu là có tính chất diệt khuẩn, có độ sát trùng cao

Việt Nam có một thảm thực vật vô cùng phong phú phát triển trong điều kiện khí hậu nhiệt đới nên các loại cây cho tinh dầu được khẳng định là dồi dào và độc

đáo Trong đó, giống Citrus họ Rustaceae tuy có tiềm năng lớn nhưng chưa được khai thác và tận dụng triệt để Tinh dầu trong vỏ quả của giống Citrus có chứa thành

phần chính là Limonene có đặc tính xua đuổi và diệt trừ côn trùng gây bệnh ở người

và động vật

Tuy nhiên ở nước ta vẫn chưa có nghiên cứu nào theo hướng sử dụng Limonene trong phòng trừ côn trùng y tế Vì vậy, kết hợp với mục tiêu tận dụng phụ phẩm của các nghành chế biến rau quả tạo ra các sản phẩm hữu ích thân thiện với môi trường chúng tôi đã tiến hành đề tài nghiên cứu ứng dụng Limonene trong

vỏ quả của một số loại cây có múi làm thuốc diệt trừ côn trùng trong nghành y tế:

Nghiên cứu chiết tách Limonene và một số dẫn xuất từ nguồn thực vật Việt Nam

sử dụng trong lĩnh vực sát trùng gia dụng (phòng trừ côn trùng y tế)

Nội dung đề tài cần thực hiện:

- Khảo sát hàm lượng Limonene trong một số vỏ quả có múi

- Tiến hành tách Limonene bằng hai phương pháp: cất lôi cuốn hơi nước kết hợp cất phân đoạn dưới áp suất giảm và chiết Limonene bằng SCO2 (Supercritical Carbondioxide)

- Phân tích và so sánh chất lượng sản phẩm chiết bằng hai phương pháp trên

- Gia công thử nghiệm chế phẩm

- Thử hoạt tính sinh học về tác dụng phòng ngừa ruồi, muỗi

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN

1.Các biện pháp phòng trừ côn trùng y tế

1.1.Tác hại của côn trùng y tế tới sức khỏe cộng đồng

Ruồi, muỗi, kiến, gián…là những loại côn trùng mang theo các vi trùng, vi khuẩn từ những nơi kém vệ sinh nhất tới nguồn thức ăn của con người thông qua đặc điểm sống của chúng

Loài ruồi nhà thường gặp có tên khoa học là Musca domestica, sống rất gần

gũi với loài người trên toàn thế giới Chúng thường được tìm thấy ở những khu dân

cư hoặc súc vật sinh sống, nơi có nhiều thực phẩm và chất thải vì thế chúng có thể mang và phát tán nhiều loại mầm bệnh khác nhau

Đa số mầm bệnh do ruồi truyền đều nhiễm trực tiếp qua đường thức ăn, nước uống Những bệnh do ruồi truyền như kiết lỵ, ỉa chảy, thương hàn, tả và một số bệnh giun sán, nhiễm trùng mắt và một số bệnh ngoài da như mụn cóc, nấm, phong Riêng đối với loài gián, chúng còn thải ra nhiều mùi hôi tại những khu vực bị chúng tấn công

Đối với loài muỗi, muỗi Ae aegypti được coi là véc tơ chính trong các vụ

dịch sốt xuất huyết ở nhiều nước như: Singapo, Philippin, Thái Lan (1958 và các năm tiếp theo), Malaysia, Lào, Việt Nam (vào tháng 6 đến tháng 8 /1963 vụ dịch sốt

xuất huyết ở Sài Gòn đã phân lập được vi rút Dengue từ muỗi Ae Aegypti; tháng 6– 8/2009 dịch sốt xuất huyết ở một số huyện của tỉnh Phú Yên muỗi Ae Eagypti cũng

là véc tơ chính)

Những năm gần đây bệnh sốt xuất huyết bùng phát thành dịch ở nhiều nơi làm hàng ngàn người mắc và hàng trăm người tử vong, việc phòng chống bệnh sốt xuất huyết cũng đang là vấn đề quan tâm của cộng đồng

Muỗi truyền bệnh sốt rét thuộc giống Anopheles, có chân dài mảnh như tơ

và cánh lốm đốm Muỗi gây bệnh là giống cái, vì muỗi cái cần nhiều huyết cầu tố

để nuôi trứng Các ký sinh trùng sốt rét phá hủy nhiều tế bào hồng cầu tới mức gần như không đủ duy trì các chức năng tồn tại

Trong năm 2006, trùng sốt rét tấn công hơn 1/2 tỷ người, trong số này tối thiểu một triệu người chết Phần lớn các nạn nhân này là trẻ dưới năm tuổi và ở Châu Phi Năm 2009, Tổ chức Y tế thế giới (WHO) đã phải dùng 23 triệu USD từ quỹ từ thiện của Bill và Melinda Gates để ngăn chặn dòng sốt rét kháng Artemisinin lan rộng đến châu Phi, nơi có đến 90 % ca bệnh sốt rét trên thế giới Vì vậy, việc

ngăn ngừa các nguồn bệnh từ ruồi, muỗi và các côn trùng gây bệnh trung gian là một vấn đề rất quan trọng và bức thiết trên toàn cầu

1.2 Các biện pháp phòng trừ ruồi, muỗi

1.2.1 Biện pháp diệt ruồi, muỗi

* Diệt ruồi:

Để diệt ruồi người ta thường dùng hai phương pháp:

- Phương pháp vật lý: đập ruồi, bẫy ruồi bằng bẫy đèn, bẫy dính, bẫy nước,

Quét dọn vệ sinh sạch sẽ để ruồi không có chỗ đẻ trứng Đặt cóng bẫy trứng

ở những nơi mật độ ruồi cao (chợ, các nhà hàng ăn uống) để thu hút ruồi cái vào cóng đẻ trứng, rồi thu hồi trứng đem đốt hoặc giội nước sôi Cóng bẫy trứng là các chai lọ, hộp có miệng hình tròn, đặt phễu lên miệng cóng Trong cóng đặt 1 thìa cà phê sữa bò hoặc nước cháo cám để hấp dẫn ruồi cái đẻ

Đặt cóng khoảng 8-9h, thu hồi khoảng 17h, hàng ngày mỗi cóng có thể thu được hàng vạn trứng (1ml=6.000 trứng)

- Nhựa dính bẫy ruồi

Có thể pha chế theo thành phần: Nhựa thông (2gr), dầu thực vật (2gr), đường hoặc mật (7gr), nước (10gr) Đun nhỏ lửa cho nhựa thông chảy ra rồi đổ dầu, đường mật và nước vào quấy đều lên Phết nhựa dính lên mảnh bìa cứng, đem đặt ở những nơi ruồi tập trung để bẫy ruồi

Một cách khác: Nhựa thông 12gr, dầu thực vật 6gr, mỡ tra máy 2gr Đun nhỏ lửa cho nhựa thông chảy ra, đổ dầu vào mỡ và quấy đều Phết nhựa dính vào mảnh bìa cứng, những băng giấy (5 x 40cm) hoặc lấy sợi dây gai (40cm) tẩm vào nhựa dính Đem đặt hoặc treo ở những nơi ruồi tập trung đậu nghỉ ban đêm để bẫy chúng

Cứ 5-10cm2 treo 1 sợi dây gai hoặc 1 băng giấy

Khi mật độ ruồi dày đặc trên nhựa thì đem đốt huỷ

- Phun không gian:

- Phun hóa chất dạng sương: được áp dụng trong các không gian bên trong nhà nhằm tiêu diệt ngay các loài ruồi đang có mặt

- Phun hóa chất dạng khói mù nóng: phun chủ yếu ở khu vực khuôn viên bên ngoài nhằm tiêu diệt ngay lập tức các loài ruồi đang có mặt

- Phun tồn lưu:

Phun trực tiếp hóa chất lên bề mặt vách tường trong tòa nhà, các khu vực cống thoát nước, bãi rác, chu vi bao ngoài tòa nhà, sân vườn nhằm tiêu diệt ngay các loại côn trùng, ấu trùng đồng thời thiết lập một hàng rào hóa chất ngăn chăn sự sinh sản và thâm nhập của côn trùng

* Diệt muỗi:

a Phương pháp sinh học :

- Nuôi cá nhỏ trong bể nước để tiêu diệt bọ gậy

- Có thể tạo ra chủng muỗi đực mất khả năng sinh sản bằng cách chiếu phóng xạ rồi thả chúng vào tự nhiên Các con muỗi đực vô sinh sẽ cạnh tranh giao phối với muỗi đực thường, giảm tỷ lệ sinh của muỗi

b Phương pháp vật lý:

- Đèn bẫy muỗi: Được chế tạo với một đèn phát ánh sáng hấp dẫn muỗi và côn

trùng tụ tập đến, bao quanh bởi lưới kim loại có hiệu điện thế thấp Khi muỗi và côn trùng sa vào lưới, dòng điện nhỏ sẽ phóng qua và tiêu diệt chúng Phương pháp này

sử dụng được trong nhà và ngoài trời

- Vợt điện: Thiết kế như vợt bắt muỗi cầm tay, chỉ gồm lưới kim loại có điện thế,

chạy pin Vợt này đòi hỏi kỹ thuật sử dụng của người bắt muỗi, có thể có ích trong nhà, nhưng không có tính hiệu quả cao

c Phương pháp hóa học:

Sử dụng Hương xua muỗi (còn gọi là nhang muỗi), được đốt trong nhà Nó

có thể tiêu diệt muỗi trong phạm vi nhà ở và không duy trì được tác dụng lâu dài Hương xua muỗi có thể gây độc cho người, và tạo nguy cơ hỏa hoạn

Thông dụng nhất là dùng hóa chất đặc trị, áp dụng quy trình kỹ thuật phun thuốc sát trùng cho cả hai phương pháp phun không gian và phun tồn lưu Hai

phương pháp này thường được sử dụng để diệt cả ruồi và muỗi

1.2.2 Các biện pháp phòng ngừa ruồi, muỗi

- Vệ sinh môi trường: Làm giảm hoặc loại trừ nơi đẻ trứng của ruồi bằng cách vệ

sinh chuồng trại gia súc, gia cầm, quản lý phân và chất thải con người, xử lý rác thải tốt

- Làm giảm nguồn thu hút ruồi từ nơi khác đến như mùi của thức ăn, mùi của các ổ

đẻ của ruồi

- Đề phòng sự tiếp xúc của ruồi và mầm bệnh như hố xí, người ốm và chất thải của

họ, lò mổ, động vật chết

- Bảo vệ không cho ruồi tiếp xúc với thức ăn, vệ sinh nhà ăn

- Ruồi thích ánh sáng thường ban ngày, như do ruồi có mắt kép phản xạ nhanh với ánh sáng phản chiếu bởi loại gương cầu Vì vậy người ta cho nước sạch vào túi nylon, treo trong nhà, ruồi bay qua bay lại gặp phải ánh sáng phản quang từ các túi nylon đựng nước, ruồi sợ và bay xa Đây là biện pháp mà các quán hàng ăn uống thường sử dụng rất có hiệu quả

- Màn ngủ: là phương pháp hiệu quả để phòng chống muỗi đốt khi ngủ

- Lưới cửa: là các lưới kim loại (hay nhựa) có lỗ nhỏ, không cho muỗi hay các loại côn trùng vượt qua và xâm nhập vào nhà ở, nhưng vẫn đảm bảo thoáng khí và ánh sáng

Sử dụng thuốc bôi lên da để xua muỗi khỏi da, tiện dụng khi đi du lịch đến vùng đất nhiều muỗi Chúng thường chứa các hóa chất sau:

DEET(Diethyltoluamide), D.E.P (Diethylphtalat) tinh dầu bạc hà mèo, nepetalactone, tinh dầu sả hay tinh dầu bạch đàn (dầu khuynh diệp)

Tác dụng xua đuổi côn trùng của Diethyltoluamide được I.H Gilbert và cộng

sự công bố từ năm 1955, sau đó đươc Hãng Hercules Agrochemicals Inc đăng ký và

sản xuất với tên thương mại là metadelphin.[1]

Dietyltoluamide, chất lỏng màu hổ phách, sôi ở 111oC/ mmHg, là chất xua

đuổi côn trùng gây hại, đặc biệt là muỗi LD50 2000 mg/kg Trong số các đồng

phân thì đồng phân meta hiệu quả hơn so với orto và para

Trong các biện pháp phòng ngừa ruồi, muỗi nêu trên thì phương pháp sử dụng hóa chất để diệt vẫn được dùng nhiều nhất Ngoài tác dụng diệt côn trùng, các thuốc này với hàm lượng nhất định sẽ có tác dụng lên con người, vật nuôi và môi trường Thuốc có thể gây ô nhiễm nguồn nước, làm chết các động vật thủy sinh

Bên cạnh đó, việc hóa chất vẫn còn tác dụng với côn trùng một thời gian dài sau khi phun chứng tỏ thuốc vẫn tồn lưu trong môi trường và con người hằng ngày vẫn chịu sự phơi nhiễm đối với những hóa chất này

Ngay đối với những hoá chất diệt côn trùng đã được Bộ Y tế đảm bảo về độ

an toàn thì việc thường xuyên tiếp nhận chúng qua đường hô hấp cũng hoàn toàn không có lợi cho sức khỏe

Hiện nay, các loại thuốc sử dụng phòng trừ côn trùng gây hại tại Việt Nam hầu hết được nhập khẩu Chúng được sản xuất bởi các hãng hóa chất nổi tiếng của các nước có nền khoa học kỹ thuật phát triển như Anh, Pháp, Bỉ, Mỹ, Đức, Italia, Nhật Bản,…Những loại hóa chất này hầu hết được chiết xuất từ thực vật như hoạt chất permethrin (chiếm 50% trong thuốc Map Permethrin 50EC của Hockley International Ltd – Anh quốc) thuộc nhóm pyrethroid tổng hợp được chiết xuất từ

hoa cây Cúc trừ sâu (Chrysanthemum cinerariaefolium Vis.) hoặc hoạt chất rotenon trong một số hóa chất khác được chiết xuất từ hạt cây Củ đậu (Pachyrhizus erosus

(L.) Urb.),…Tuy nhiên những loại hóa chất này cũng chỉ an toàn cho người sử dụng

trong một liều lượng nhất định nào đó. [19]

Chính vì vậy việc nghiên cứu, phát triển và đưa ra thị trường những sản phẩm có chứa hoạt chất diệt côn trùng thân thiện với môi trường, không gây độc với con người như Limonene đang là một trong những vấn đề được quan tâm hàng đầu của các cơ quan chức năng ở Việt Nam và trên nhiều quốc gia khác

1.3 Limonen và ứng dụng trong phòng ngừa côn trùng y tế

1.3.1 Nguồn tinh dầu chứa Limonene

Limonene là một monoterpen chiếm hàm lượng lớn trong tinh dầu vỏ các

loại quả có múi: cam, chanh, quýt, bưởi thuộc chi Citrus họ Rutaceae Đây là loài

thực vật được coi là một trong những chi có tiềm năng lớn về mặt thương mại trong các lĩnh vực mỹ phẩm, thực phẩm, hóa chất và y tế

Chi Citrus phân bố nhiều ở một số nước như Việt Nam, Trung Quốc, Nepal, Nhật

Bản Tại Việt Nam chi Citrus có khoảng 24 loài thông dụng, phân bố dải dọc suốt

từ miền Bắc đến Nam Những năm gần đây, các loại cây ăn quả trong cả nước đang phát triển khá mạnh với diện tích trên 750.000 ha Trong đó, riêng cây có múi phát triển mạnh nhất với diện tích gần 80.000 ha, sản lượng khoảng 532.000 tấn/năm và

là một trong những loại cây trồng, mang lại hiệu quả kinh tế cao cho nhà vườn

1.3.2.Thành phần hóa học của một số tinh dầu vỏ quả có múi thuộc chi Citrus[5]

Các loài thuộc họ Rutaceae ngoài việc sử dụng quả trong thực phẩm, tinh dầu

chiết từ hoa và vỏ còn được ứng dụng trong mỹ phẩm Hiện nay trên thế giới có rất nhiều nghiên cứu chỉ ra rằng các thành phần hóa học trong vỏ quả còn có tác dụng chống oxy hóa, kháng nấm, phòng và diệt trừ các côn trùng gây hại cho người và động vật

Dưới đây là một số hợp chất tiêu biểu trong thành phần hóa học của các loại quả có múi:

Lim onene Sabinene

Bảng 1.1: Thành phần hóa học trong vỏ Bưởi (Citrus maxima)

1.4 Đặc tính hóa lý và hoạt tính sinh học của Limonene(D-limonene)

1.4.1.Đặc tính hóa lý [39]

Limonene bao gồm 2 cấu hình Limonene và L-Limonene, trong đó Limonene được biết đến là cấu tử hữu ích chính của vai trò thể hiện hoạt tính sinh học và chiếm hàm lượng từ 80%-95% của hỗn hợp limonene trong tinh dầu vỏ quả

D-có múi Vì vậy D-có thể hiểu rằng D-Limonene là cấu tử thể hiện tính chất và các ứng dụng hữu ích của Limonene

D-Limonene là chất lỏng, không màu, có mùi thơm nhẹ, dễ cháy và không tan trong nước

1.4.2 Hoạt tính sinh học của Limonene

Thành phần hóa học chính trong vỏ các loài thuộc giống Citrus là các tecpen

mà chiếm hàm lượng lớn là Limonene Đây cũng chính là thành phần quan trọng nhất có vai trò chủ đạo trong chất lượng của tinh dầu vỏ quả và thể hiện các hoạt tính chống oxy hóa, kháng nấm và diệt trừ các côn trùng gây bệnh

Các nghiên cứu của Chang cùng cộng sự năm 2008 đã thử khả năng kháng nấm của tinh dầu vỏ Bưởi (Citrus maxima), tinh dầu vỏ cam (Citrus sinensis) và

Limonene đối với nấm A.flavus Nấm A.flavus được nuôi cấy trong môi trường

thạch trong 07 ngày, nhiệt độ ủ dao động từ 280C-300C khi đạt bán kính 5mm thì đưa ra thử nghiệm Limonene, tinh dầu vỏ cam, tinh dầu vỏ bưởi hòa tan trong aceton rồi đưa vào môi trường ở các nồng độ 250ppm, 500ppm, 750ppm, 1000ppm

và một mẫu trắng Nấm được cấy vào các hộp pectri có chứa môi trường đã trộn hoạt chất Theo dõi sự phát triển của nấm trong 10 ngày.[39]

Kết quả thể hiện như sau:

Bảng 1.3: Hoạt tính kháng nấm của tinh dầu bưởi, tinh dầu Cam và Limonene

Sự phát triển của nấm trong 10 ngày (mm) Hoạt chất Nồng độ

(ppm) 0 ngày 2 ngày 4 ngày 6 ngày 8 ngày 10 ngày %GI

Qua kết quả thử hoạt tính kháng nấm trên cho thấy Limonene đạt hiệu quả kháng 100% ở nồng độ 500 ppm Điều đó chứng tỏ Limonene đóng vai trò chính

trong việc thể hiện khả năng kháng nấm A.flavus.[39]

1.5 Tình hình nghiên cứu và ứng dụng Limonene(D-Limonene)

D-Limonene là một monotecpen được dùng làm chất phụ gia trong thực phẩm, xà phòng, nước hoa để tạo mùi và hương thơm Ngoài ra, D-Limonene còn được dùng làm chất tẩy nhờn trong các nhà máy sản xuất máy tính và thiết bị điện thay thế cho chlorofluorohydrocacbon (CFC) Một số nghiên cứu trên động vật đã chỉ ra rằng D-Limonene có tác dụng ngăn ngừa ung thư đối với động vật có vú như ung thư phổi, ung thư dạ dày và ung thư da.[39]

Năm 1990, NTP (National Toxicology Program) cho biết D-Limonene có khả năng gây ung thư thận ở chuột đực nhưng ở chuột cái và các loài khác lại không thấy thể hiện gì Nghiên cứu của NTP trên chuột đực và chuột cái có độ tuổi từ 7-8 tuần bằng cách đưa một lượng D-Limonene từ 0,3-600 mg/ngày (đối với chuột cái), 0,75-150 mg/ngày (đối với chuột đực) trộn cùng dầu ngô vào dạ dày trong 5 ngày/tuần và theo dõi trong 103 tuần Kết quả cho thấy trong 13 tuần đầu tiên dạ dày chuột có hiện tượng bị tổn thương, tỷ lệ sống sót tỉ lệ nghịch với liều lượng dùng D-Limonene Sự tồn tại có chọn lọc là 80% với liều thấp nhất và 58% đối với liều cao nhất Điều đó cho thấy D-Limonene gây tổn thương hoặc có thể gây tử vong đối với chuột ở một liều lượng phù hợp

Đối với người, Webb và đồng nghiệp đã chứng minh rằng chỉ sau 3 ngày, lượng D-Limonene được hấp thụ qua đường hô hấp đã giải phóng hoàn toàn bằng cách kiểm tra máu của những người sống và hít thở bình thường trong không gian được phun D-Limonene với liều lượng từ 225-450mg/m3.[5,19]

Hình 1.1: Một số sản phẩm từ D-Limonene

Trong thập kỷ qua, việc ứng dụng D-Limonene đã được mở rộng rất nhiều, người ta đã sử dụng nó trong cả ngành công nghiệp sơn hoặc dùng như là một chất lỏng làm mát thứ cấp Bước tiến lớn nhất là sử dụng D-Limonene vào việc tẩy rửa

cả trong công nghiệp lẫn quy mô hộ gia đình D-Limonene có thể được sử dụng như một dung môi thông thường hoặc pha loãng với nước

Là một dung môi thông thường, D-Limonene có thể thay thế một loạt các sản phẩm methyl ethyl ketone, acetone, toluene, ete glycol và các dung môi khử trùng chứa Flo và Clo Như hầu hết các dung môi hữu cơ khác, D-Limonene không tan trong nước, do đó có thể sử dụng trong các công đoạn tách nước điển hình D-Limonene có tính hòa tan tương tự CFC nhưng lại ít độc nên là một dung môi tốt hơn nhiều so với các dung môi tẩy rửa khác

Bằng cách pha D-Limonene với một gói chất hoạt động bề mặt cùng với nước pha loãng ta đã có một sản phẩm tẩy rửa an toàn Nồng độ sử dụng của D-Limonene trong những trường hợp này thường là 5-15% Nhìn chung các giải pháp này được sử dụng vào việc phun và lau rửa các thiết bị công nghiệp mà không để lại

dư lượng các chất hóa học như các chất tẩy rửa khác D-Limonene là một chất hóa học đa năng, an toàn và hiệu quả hơn so với các sản phẩm tẩy rửa điển hình.[8] Trong các hợp chất thiên nhiên, Limonene (D-Limonene) cũng được biết đến với đặc tính xua đuổi và diệt côn trùng, trừ sâu Đối với động vật cảnh, người ta đã dùng dung dịch tinh dầu có chứa Limonene để phun xịt trừ bọ chó, bọ mèo và côn trùng gây hại khác (ve, mò, rận rệp) Bên cạnh đó, Limonene còn có khả năng diệt

bọ gậy của nhiều chủng loại muỗi gây sốt rét và sốt xuất huyết, viêm não Nhật Bản, bệnh chân voi Những chủng loại bệnh này nếu không được ngăn ngừa rất có thể tạo ra đại dịch trên toàn thế giới, ảnh hưởng không nhỏ đến đời sống và sức khỏe của loài người

Hink và đồng nghiệp đã nghiên cứu D-Limonene trên trứng ruồi, ấu trùng ruồi và ruồi non cho thấy ở nồng độ D-Limonene 1.0% diệt được 62% trứng và 61% ấu trùng ruồi Đối với ruồi non, D-Limonene 10% diệt được 34% ruồi Khi tiếp tục tăng nồng độ của D-Limonene khảo nghiệm trên từng đối tượng đều cho kết quả không thay đổi Điều đó cho thấy D-Limonene có tác dụng đối với một số đối tượng có tính nhạy cảm cao(sức đề kháng kém).[5]

Ở Việt Nam hiện nay chưa có nghiên cứu nào cụ thể về ứng dụng của Limonene trong lĩnh vực phòng ngừa côn trùng y tế Phần lớn Limonene được dùng

làm chất tẩy rửa như nước lau nhà và nước rửa tay, xà phòng tắm,… do nó có mùi thơm dịu nhẹ và có tính diệt khuẩn cao

Vì vây, việc nghiên cứu chiết tách và thử nghiệm khả năng phòng trừ côn trùng của Limonene là cần thiết để tạo ra một sản phẩm có nguồn gốc tự nhiên, giảm ô nhiễm cho môi trường sống và an toàn cho người sử dụng

1.6 Các phương pháp chiết tinh dầu và Limonene

Hiện nay trên thế giới, người ta thường tách Limonene từ tinh dầu vỏ cam và

vỏ bưởi Vỏ cam tươi đưa về qua xử lý sau đó dùng các phương pháp như cất cuốn hơi nước hoặc ép, trích ly để tách lấy tinh dầu Từ tinh dầu người ta sẽ tách Limonene bằng cách chưng cất phân đoạn dưới áp suất giảm

1.6.1 Cất lôi cuốn hơi nước

Có rất nhiều phương pháp sản xuất tinh dầu từ vỏ quả có múi nhưng thông dụng nhất là phương pháp cất lôi cuốn hơi nước Đây là phương pháp được sử dụng khi chưng cất các hợp chất không bền nhiệt Ưu điểm của nó là giữ được mùi hương

tự nhiên và quy trình đơn giản

Có 3 dạng cất lôi cuốn tinh dầu như sau:

* Chưng cất với nước: Nguyên liệu và nước cùng cho vào một thiết bị Khi

đun sôi, hơi nước bay ra sẽ cuốn theo tinh dầu, ngưng tụ hơi bay ra sẽ thu được hỗn hợp gồm nước và tinh dầu, hai thành phần này không tan vào nhau nên dễ dàng tách

ra khỏi nhau

* Chưng cất bằng hơi nước không có nồi hơi riêng: Nguyên liệu và nước

cùng cho vào một thiết bị nhưng cách nhau bởi một vỉ nồi Khi đun sôi, hơi nước bốc lên qua khối nguyên liệu kéo theo tinh dầu và đi ra thiết bị ngưng tụ Để nguyên liệu khỏi rơi vào phần có nước ta có thể lót trên vỉ 1 hay nhiều lớp bao tải tùy theo từng loại nguyên liệu Phương pháp nay phù hợp với những cơ sở sản xuất có qui

mô trung bình

* Chưng cất bằng hơi nước có nồi hơi riêng: Phương pháp này phù hợp với

những cơ sở sản xuất lớn, hơi nước được tạo ra từ một nồi hơi riêng và được dẫn vào các thiết bị chưng cất

1.6.2 Chiết SCO 2 (CO 2 ở trạng thái siêu tới hạn)

Đối với mỗi một chất đang ở trạng thái khí, khi bị nén đẳng nhiệt tới một áp suất đủ cao, chất khí sẽ hóa lỏng và ngược lại Tuy nhiên, có một giá trị áp suất mà tại đó, nếu tăng nhiệt độ lên thì chất lỏng cũng không hóa hơi trở lại mà tồn tại ở

một dạng đặc biệt gọi là trạng thái siêu tới hạn Vật chất ở trạng thái trung gian này, mang đặc tính của cả chất khí và chất lỏng

Chất ở trạng thái siêu tới hạn có tỷ trọng tương đương như tỷ trọng của pha lỏng Nhưng sự linh động của các phân tử lại rất lớn, sức căng bề mặt nhỏ, hệ số

khuếch tán cao giống như khi chất ở trạng thái khí Hình 1.1 biểu thị vùng trạng

thái siêu tới hạn của một chất trong biểu đồ cân bằng pha rắn, lỏng và khí của chất

đó theo sự biến thiên của áp suất và nhiệt độ. [4,31,37,33]

Các dung môi siêu tới hạn có khả năng hòa tan tốt các chất ở cả 3 dạng rắn, lỏng và khí Dung môi siêu tới hạn có sự tác động lên cả các chất dễ bay hơi và cả các cấu tử không bay hơi của mẫu Hiệu quả phân tách kết hợp của quá trình chưng cất lôi cuốn và quá trình chiết ngược dòng lỏng - rắn

Hình 1.1: Đồ thị biểu diễn trạng thái của các chất ở vùng siêu tới hạn

Để đáp ứng các yêu cầu công nghệ chiết tách các hợp chất thiên nhiên, CO2 là dung môi được ưu tiên lựa chọn áp dụng vì các thuận lợi sau:

- CO2 là một chất dễ kiếm, rẻ tiền vì là sản phẩm phụ của nhiều ngành công nghệ hóa chất khác; [29]

Điểm ba (PT, TT) Điểm tới hạn (PC, TC)

Khí Lỏng

- Là một chất trơ, ít có phản ứng kết hợp với các chất cần tách chiết Khi được đưa lên đến trạng thái tới hạn, CO2 không tự kích nổ, không bắt lửa và không duy trì sự cháy; [35]

- CO2 không độc với cơ thể, không ăn mòn thiết bị;

- Điểm tới hạn của CO2 (Pc = 73 atm; Tc = 30,9oC) là một điểm có giá trị nhiệt

độ, áp suất không cao lắm so với các chất khác cho nên sẽ ít tốn năng lượng hơn để đưa CO2 tới vùng siêu tới hạn;

- Có khả năng hòa tan tốt các chất tan hữu cơ ở thể rắn cũng như lỏng, đồng thời cũng hòa tan được cả các chất thơm dễ bay hơi, không hòa tan các kim loại nặng và có thể điều chỉnh các thông số trạng thái như áp suất và nhiệt độ để nâng cao độ chọn lọc khi chiết tách;

- Khi sử dụng CO2 thương phẩm để chiết tách không có dư lượng cặn độc hại trong chế phẩm chiết

1.6.3 Các phương pháp khác

Theo phương pháp của Winniczuk và Parish (1997), Limonene được tách bằng cách thủy phân Vỏ cam được đưa vào bình thủy phân có bổ sung thêm axít sunfuric loãng ở nhiệt độ 1500C Sản phẩm sau khi thủy phân được chuyển vàobình hứng và đưa sang thiết bị ngưng thu được Limonene có hàm lượng có thể lên tới 99%

Theo một quy trình sản xuất khác, người ta thu nhận D-Limonene bằng cách

ép vỏ quả có múi được một dạng dịch sền sệt Sản phẩm thu được sau khi ép được đưa vào cất lôi cuốn hơi nước Sản phẩm cuối cùng là Limonene kỹ thuật ở dạng thô

1.6.4 Lựa chọn phương án công nghệ

Trong phạm vi của đề tài này, chúng tôi đã chọn phương pháp chiết bằng cách chưng cất lôi cuốn hơi nước tinh dầu vỏ quả kết hợp với cất phân đoạn dưới áp suất giảm để tách Limonene trong vỏ quả có múi Phương pháp đối chứng để so sánh là phương pháp chiết Limonene bằng phương pháp SCO2 Sản phẩm được đưa phân tích và thử nghiệm hoạt tính sinh học trong ứng dụng phòng ngừa ruồi, muỗi

CHƯƠNG II THỰC NGHIỆM

2.1 Đối tượng nghiên cứu

Khảo sát ba đối tượng vỏ quả có múi thông dụng

trên thị trường:

- Bưởi Đoan Hùng – Phú Thọ (Citrus maxima)

- Cam sành (Citrus sinensis L.Osbeck) phổ biến ở

Bắc Giang, Hưng Yên, Hà Giang, Tiền Giang…

- Chanh (Citrus limon) phân bố trên cả nước

Các mẫu nguyên liệu tươi được xay nhỏ và xử lý trước

khi chiết

2.2 Phương pháp nghiên cứu

Tiến hành khảo sát hàm lượng tinh dầu nói chung và Limonene nói riêng trong 3 loại vỏ quả nói trên ở trạng thái mẫu tươi bằng phương pháp cất lôi cuốn hơi nước Từ đó lựa chọn ra đối tượng phù hợp làm nguyên liệu tách Limonene cho hiệu suất cao nhất Song song làm thí nghiệm với phương pháp chiết bằng SCO2 để đối chứng

2.2.1 Cất lôi cuốn hơi nước

2.2.1.1 Thiết kế nghiên cứu

Để thực hiện các nhiệm vụ của đề tài, chúng tôi đã tiến hành các nghiên cứu theo thiết kế dưới đây

(Sơ đồ 2.1)

Sơ đồ 2.1: Thiết kế nghiên cứu

Các thông số thích hợp

Cất cuốn hơi nước

Các thông số thích hợp

Limonene

Nguyên liệu

D-Limonene 95%

phông hồi lưu vào bình cầu Thời gian chưng cất kéo dài cho đến khi thấy lượng tinh dầu trong ống thu không đổi

Sau khi kết thúc chưng cất, để nguội, đọc lượng tinh dầu trong ống thu Tách lớp tinh dầu, làm khan bằng Na2SO4 sau đó bảo quản trong lọ tối màu ở nhiệt độ thấp Xác định hiệu suất cất theo % khối lượng nguyên liệu Xác định thành phần tinh dầu bằng thiết bị sắc kí khí khối phổ GC-MS

Tinh dầu sau khi tinh chế được đưa vào thiết bị cất phân đoạn Fischer Tiến hành cất phân đoạn dưới áp suất giảm để tách Limonene

2.2.2 Chiết bằng SCO 2

Quá trình chiết Limonene bằng SCO2 được thực hiện trên hệ thiết bị chiết xuất SFT 250 Bình chiết có dung tích 2000 ml, áp suất làm việc tối đa 689,5 bar, vùng nhiệt độ làm việc từ 20-1500C Các thiết bị ngoại vi gồm có bơm đẩy dung môi phụ trợ 1011 B-100-S và máy nén khí làm việc tại 6,895 bar cung cấp khí nén tạo động lực cho bơm CO2 cao áp hoạt động

2.2.2.1 Lựa chọn đối tượng nghiên cứu

Trước tiên, tiến hành khảo sát sơ bộ với các điều kiện thực nghiệm: các mẫu

vỏ cam, vỏ bưởi, vỏ chanh được nghiền nhỏ Mỗi loại mẫu lấy 200g nguyên liệu/1 lần chiết cho vào trong túi vải sạch, đưa vào trong bình chiết Bình chiết được thiết

kế có màng lọc ngăn trước cửa các đường ống CO2 và tháo dịch chiết để tránh việc các hạt nhỏ lọt vào trong cản trở dung môi

Quá trình khảo sát sơ bộ được thực hiện ở các điều kiện chiết sau:

Thời gian chiết : 5h Nhiệt độ bình chiết : 600C

Áp suất bình chiết : 280 bar Phân tích và so sánh lượng Limonene thu được từ các mẫu nguyên liệu để lựa chọn đối tượng chiết cho hiệu suất cao nhất

2.2.2.2 Quy hoạch hóa thực nghiệm xác định điều kiện chiết tối ưu

a Giai đoạn 1: Chiết tinh dầu

Sau khi lựa chọn được đối tượng nghiên cứu thích hợp, chúng tôi tiến hành khảo sát sự ảnh hưởng của áp suất (P), nhiệt độ (T) và thời gian (t) tới hiệu suất dầu thu được (Y) Các nghiên cứu được thực hiện trên cơ sở mô hình thực nghiệm quy hoạch trực giao bậc 2 với ba yếu tố:

Thời gian chiết : 1 - 5h Nhiệt độ bình chiết : 30 - 600C

Áp suất bình chiết : 100 - 280 bar

Sử dụng phần mềm MODDE 9.0 để xây dựng phương trình thực nghiệm, mô phỏng kết quả trên đồ thị, tối ưu hóa các thông số công nghệ cho quá trình chiết Quy hoạch hóa trực giao bậc hai cần số thí nghiệm được xác định theo công thức:

N = 2 k-q +2k + n o Trong đó: N: tổng số thí nghiệm cần làm

2 k-q :số thí nghiệm làm ở ma trận gốc 2k: số thí nghiệm làm ở điểm sao

n o : số thí nghiệm làm lặp lại ở tâm (n o>1)

k: số yếu tố khảo sát q: mức rút gọn

Như vậy, cần tiến hành 17 thí nghiệm theo bảng quy hoạch, từ đó xây dựng hàm mục tiêu:

Y = a0 + a1T + a2P + a3t + a4TP + a5Pt + a6tT + a7T2 + a8P2 + a9t2

- Xác định các hệ số trong phương trình hồi quy (hàm mục tiêu)

- Đánh giá tính có nghĩa của các hệ số trong hàm mục tiêu tìm được dựa vào tiêu chuẩn Student

b b S

−

d

S : phương sai dư

S 2 l : phương sai lặp.

- Tìm điều kiện cực trị để hiệu suất chiết được tối ưu

Y max (%) = f (T opt , P opt , t opt ) Trong đó: T opt - nhiệt độ tối ưu (oC)

Popt - áp suất tối ưu (bar)

topt - thời gian tối ưu (h)

Sử dụng các điều kiện tối ưu tìm được, tiến hành khảo sát kiểm chứng lại kết quả lý thuyết Thực hiện 03 thí nghiệm, mỗi thí nghiệm 200g nguyên liệu tại các thông số tối ưu

b Giai đoạn 2: Chiết D-Limonene

Sử dụng lượng tinh dầu thu được ở giai đoạn 1 làm nguyên liệu cho quá trình chiết D-Limonene Dùng mô hình quy hoạch hóa thực nghiệm trực giao bậc 2 ba yếu tố xác định các thông số tối ưu (cách làm như giai đoạn 1)

Quá trình chiết được nghiên cứu ở các điều kiện sau:

Khối lượng mẫu : 50g;

- Bộ cất tinh dầu Clevender;

- Thiết bị chiết SCO2 SFT-250 (Mỹ);

- Thiết bị chưng cất phân đoạn Fischer;(Đức)

2.4 Phân tích sản phẩm

Thành phần các mẫu tinh dầu và hàm lượng Limonene được phân tích sắc ký

khí khối phổ trên thiết bị Shimazu GC-MS 2010 (Nhật Bản) với các điều kiện sau:

- Cột tách : DBS-MS 30m x 0,5µm;

- Detector : QP 2010;

- Nhiệt độ : Buồng bơm mẫu: 2000C, Detector: 2500C, Lò cột: 700C;

- Tốc độ tăng nhiệt: 50C/phút

- Máy đo độ quay cực: Kruss, SN 2200411007(Đức)

Các phân tích trên được thực hiện tại Trung tâm Giáo dục và Phát triển sắc ký EDC

– ĐH Bách khoa HN

Cấu trúc của sản phẩm được phân tích bằng các phương pháp phổ, thực hiện

tại Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam

- Phổ hồng ngoại (IR) được đo trên máy Impact 410 Nicolet FT;

- Phổ khối lượng (MS) được đo trên máy Aligent 6310 Ion Trap;

- Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (1H-NMR, 13C-NMR) được đo trên máy NMR

Brucke AVAN 500 MHz

2.5 Thử hoạt tính phòng ngừa ruồi, muỗi trong y tế của Limonene và chế phẩm từ Limonene

Limonene và chế phẩm được thử hoạt tính phòng ngừa ruồi, muỗi tại phòng

thí nghiệm Khoa Hóa thực nghiệm, Viện sốt rét – ký sinh trùng – côn trùng Trung

ương, áp dụng quy trình khảo nghiệm hóa chất, chế phẩm diệt và xua đuổi côn

trùng, diệt khuẩn dùng trong lĩnh vực gia dụng và y tế của Bộ Y tế (01/2000)

2.5.1 Quy trình khảo nghiệm đối với ruồi(quy trình diệt)

a Mục đích

Xác định hiệu lực diệt ruồi, an toàn của hoá chất diệt côn trùng bằng phương

pháp phun dưới dạng khí dung trong lồng kính

b Quy trình thử nghiệm

* Côn trùng thử nghiệm:

Ruồi nhà Musca domestica nuôi trong phòng thí nghiệm, đủ tiêu chuẩn, nhạy

cảm với hoá chất, nuôi bằng đường glucose 10%

Số ruồi cần cho thử nghiệm là 3000 con mỗi loại Lồng thử có kích thước

70 x 70 x 70 (cm)

* Kỹ thuật thử nghiệm:

Thả vào lồng 20 con ruồi 2 – 5 ngày tuổi nuôi trong phòng thí nghiệm, đã được no nước đường trước khi phun khí dung Định lượng trước (g/giây) khối lượng định phun theo liều hướng dẫn để phun vào lồng

Theo dõi số lượng ruồi quỵ 30 giây/lần trong khoảng thời gian 20 phút Sau 20 phút thu thập ruồi được thử trên ra cốc sạch và nuôi bằng nước đường 10% Tính tỷ lệ ruồi chết sau 24 giờ sau xử lý (tỷ lệ chết bao gồm những con chết

và những con còn bò được nhưng không bay được trên tổng số thử)

Nếu ở mẫu đối chứng có số côn trùng chết > 20% thử nghiệm phải hủy bỏ, chết từ

5% - 20% kết quả được điều chỉnh bằng công thức Abbot

c Đánh giá kết quả

Sau 24 giờ số ruồi chết từ 90-100% là có tác dụng diệt tốt

Sau 24 giờ số ruồi chết từ 70% - 90% là có tác dụng diệt trung bình

Sau 24 giờ số ruồi chết < 70% là có tác dụng diệt kém

d Đánh giá an toàn

Nhận xét các phản ứng phụ của sản phẩm đối với những người trực tiếp sử dụng (dựa vào bảng câu hỏi phỏng vấn về tác dụng phụ của một loại hoá chất, chế phẩm)

Căn cứ tài liệu của Tổ chức Y tế thế giới về độc chất, mức an toàn cho phép của hoá chất, chế phẩm

Kết quả khảo nghiệm, quy định mức an toàn cho phép đối với hoá chất, chế phẩm của nước sở tại

Căn cứ tài liệu, tiêu chuẩn an toàn của nhà sản xuất

2.5.2 Quy trình khảo nghiệm đối với muỗi(quy trình diệt)