Bộ y tế Kỹ thuật sản xuất dợc phẩm Tập II Kỹ thuật sản xuất thuốc phơng pháp sinh tổng hợp Sách đào tạo dợc sỹ đại học M số: Đ20.Z.09 Chủ biên: PGS.TS Từ Minh Koóng Nh xuất y học H nội - 2007 http://tieulun.hopto.org Chỉ đạo biên soạn Vụ Khoa học & Đo tạo, Bộ Y tế Chủ biên: PGS.TS Từ Minh Koóng Các tác giả biên soạn: PGS.TS Từ Minh Koóng Đàm Thanh Xuân Hiệu đính: Đàm Thanh Xuân â Bản quyền thuộc Bộ Y tế (Vụ Khoa học & Đo tạo) http://tieulun.hopto.org Lời giới thiệu Thực số điều Luật Giáo dục, Bộ Giáo dục v Đo tạo v Bộ Y tế đà ban hnh chơng trình khung đo tạo đối tợng l Dợc sỹ Đại học Bộ Y tế tổ chức biên soạn ti liệu dạy học môn sở, chuyên môn v chuyên ngnh theo chơng trình nhằm bớc xây dựng sách chuẩn chuyên môn để đảm bảo chất lợng đo tạo nhân lực y tế Sách Kỹ thuật sản xuất dợc phẩm, tập đợc biên soạn dựa chơng trình giáo dục Trờng Đại học Dợc H Nội sở chơng trình khung đà đợc phê duyệt Sách đợc nh giáo giu kinh nghiệm v tâm huyết với công tác đo tạo biên soạn theo phơng châm: Kiến thức bản, hệ thống; nội dung x¸c, khoa häc; cËp nhËt c¸c tiÕn bé khoa häc, kỹ thuật đại v thực tiễn Việt Nam Sách Kỹ thuật sản xuất dợc phẩm, tập đà đợc Hội đồng chuyên môn thẩm định sách v ti liệu dạy học chuyên ngnh Dợc sỹ Đại học Bộ Y tế thẩm định vo năm 2006 Bộ Y tế ban hnh lm ti liệu dạy học đạt chuẩn chuyên môn ngnh y tế giai đoạn 2006-2010 Trong trình sử dụng, sách phải đợc chỉnh lý, bæ sung vμ cËp nhËt Bé Y tÕ xin chân thnh cảm ơn cán giảng dạy Bộ môn Công nghiệp Dợc Trờng Đại học Dợc H Nội đà ginh nhiều công sức hon thnh sách ny, cảm ơn GS Lê Quang Ton v PGS TS Hong Minh Châu đà đọc, phản biện để sách đợc hon chỉnh, kịp thời phục vụ cho công tác đo tạo nhân lực y tế Vì lần đầu xuất bản, mong nhận đợc ý kiến đóng góp đồng nghiệp, bạn sinh viên v độc giả để lần xuất sau đợc hon thiện Vụ Khoa học v Đo tạo Bộ Y tế http://tieulun.hopto.org http://tieulun.hopto.org Lời nói đầu Cuốn giáo trình "Kỹ thuật sản xuất dợc phẩm" đợc biên soạn để giảng cho sinh viên Đại học Dợc vo học kỳ đà đợc xuất lần thứ năm 2001, gồm tập Theo chơng trình cũ, thời lợng giảng dạy môn học ny l so với kiến thức chung Dợc sỹ Đại học Đặc biệt tình hình nay, sau có nghị Bộ Chính trị (NQ-46/BCT-2005) phát triển Công nghiệp Dợc đất nớc tình hình mới, phải u tiên phát triển công nghiệp sản xuất nguyên liệu lm thuốc, trọng Công nghiệp Hóa dợc v Công nghệ Sinh học Ban chơng trình nh trờng định tăng thêm đơn vị học trình cho học phần "Sản xuất thuốc Công nghệ sinh học" Bộ môn đà biên soạn lại để xuất giáo trình gồm tập Cả ba tập có tên chung giáo trình: Kỹ thuật sản xuất dợc phẩm Giáo trình đợc biên soạn theo hai nội dung: Kỹ thuật sản xuất nguyên liệu lm thuốc Kỹ thuật sản xuất dạng thuốc thnh phÈm Trong ®ã: Néi dung thø nhÊt gåm tËp lμ: * TËp Kü thuËt s¶n xuÊt thuèc b»ng phơng pháp tổng hợp hóa dợc v chiết xuất dợc liƯu * TËp Kü tht s¶n xt thc b»ng phơng pháp sinh tổng hợp Nội dung thứ hai gồm tËp lμ: * TËp Kü thuËt s¶n xuÊt dạng thuốc So với lần xuất trớc, tác giả biên soạn đà cố gắng chắt lọc kiÕn thøc chđ u nhÊt ®Ĩ cung cÊp cho ng−êi học hiểu đợc ngnh khoa học vừa hấp dẫn vừa quan träng nμy Tuy nhiªn, víi néi dung phong phó, đa dạng v thời lợng hạn chế nên sâu đợc Vì giáo trình không tránh khỏi thiếu sót Các tác giả mong nhận đợc góp ý đọc giả để chỉnh sửa cho lần xuất sau đợc hon chỉnh Xin chân thnh cảm ơn Bộ môn Công nghiệp Dợc Trờng Đại học Dợc H Nội http://tieulun.hopto.org http://tieulun.hopto.org Mục lục phần I tổng quan Công nghệ sinh học Chơng Giới thiệu công nghệ sinh học 1.1 Công nghệ sinh học l gì? 1.2 Công nghệ sinh học - theo đuổi đa ngnh 1.3 Công nghệ sinh học - hạt nhân trung tâm ba thnh phần 1.4 An ton sản phẩm 1.5 Nhận thức cộng đồng công nghệ sinh học 1.6 Công nghệ sinh học v nớc phát triển Chơng Nguyên liệu cho công nghệ sinh học 2.1 Chiến lợc sinh khối 2.2 Nguyên liệu thô thiên nhiên 2.3 Tính sẵn có sản phẩm phụ 2.4 Nguyên liệu hoá học v hoá dầu 2.5 Nguyên liệu thô v tơng lai công nghệ sinh học Chơng Kỹ thuật lên men 3.1 Giới thiệu tổng quát 3.2 Các giai đoạn phát triển vi sinh vật 3.3 Thiết bị lên men vi sinh vật 3.4 Cung cấp không khí vô trùng cho nh máy lên men vi sinh vật 3.5 Khử trùng môi trờng công nghệ lên men 3.6 Lọc v thiết bị lọc công nghiệp sản xuất kháng sinh 3.7 Trình tự trình lên men 3.8 Thiết kế môi trờng cho trình lên men 3.9 Lên men chất rắn 3.10 Kỹ thuật nuôi cấy tế bo động vật v thực vật 3.11 Quá trình tinh chế để thu sản phẩm Chơng Kỹ thuật sản xuất enzym http://tieulun.hopto.org 4.1 Đại cơng 4.2 C¸c øng dơng cđa enzym 4.3 Kü tht di truyền công nghệ enzym 4.4 Kỹ thuật sản xuất enzym 4.5 Phơng pháp bất động enzym (immobilised enzym) Chơng Sản xuất Protein đơn bo 5.1 Sự cần thiết sản xuất protein đơn bo 5.2 Sản xuất sinh khối nấm men 5.3 Sản xuất tảo đơn bo 5.4 Sản xuất nấm sợi 5.5 Sản xuất nấm ăn 64 Chơng Sản xuất sản phẩm trao đổi chất bậc dùng Y học 6.1 Sản xuất aminoacid 66 6.2 S¶n xuÊt acid glutamic 67 6.3 S¶n xuÊt Dextran 70 6.4 Sinh tổng hợp Vitamin B12 6.4.1 Đại cơng 73 73 6.4.2 Cấu trúc hoá học v tính chất 6.4.3 Lên men sinh tổng hợp 6.4.4 Quy trình sản xuất 74 75 76 6.4.5 Quy trình chiết xuất 78 phần II Công nghệ sản xuất kháng sinh Chơng Đại cơng kháng sinh 7.1 Định nghĩa kháng sinh 83 7.2 Đơn vị kháng sinh 83 7.3 Phân loại kháng sinh 83 7.4 Các phơng pháp phân lập vi sinh vật sinh kháng sinh 84 7.5 Phơng pháp gây đột biến vi sinh vật để nâng cao hiệu suất 87 7.6 Nghiên cứu điều kiện nuôi cấy chủng vi sinh vật sinh kháng sinh phân lập đợc 89 7.7 Nghiên cứu chiết xuất v tinh chế kháng sinh 89 http://tieulun.hopto.org 7.8 Nghiên cứu hoạt tính kháng khuẩn v độc tính 89 7.9 Nghiên cứu dợc lý v điều trị kháng sinh 90 7.10 Tiêu chuẩn kháng sinh 90 7.11 Phơng pháp định lợng kháng sinh 91 7.12 ứng dụng kháng sinh ngoi lĩnh vực y học 94 Chơng Sản xuất kháng sinh nhóm -lactam 8.1 Đại cơng -lactam 100 8.2 Sinh tổng hợp kháng sinh Penicillin 100 8.3 Sản xuất 6-APA v Penicillin bán tổng hợp 8.4 Sản xuất Cephalosporin 110 116 8.5 Sản xuất 7ACA; 7ADCA v kháng sinh bán tổng hợp nhãm cephalosporin 120 8.6 Sinh tỉng hỵp acid clavulanic 122 Chơng sản xuất kháng sinh nhóm Tetracyclin 9.1 Đại cơng 128 9.2 Công thức cấu tạo v tính chất 128 9.3 Sinh tổng hợp Tetracyclin tự nhiên 130 9.4 Sinh tỉng hỵp Clotetracyclin 134 9.5 Sinh tỉng hỵp Tetracyclin 136 9.6 Sinh tổng hợp Oxytetracyclin 139 9.7 Các Tetracyclin bán tổng hợp 142 Chơng 10 sản xuất kháng sinh nhóm aminoglycosid 10.1 Đại cơng chung aminoglycosid 146 10.2 Sinh tỉng hỵp Streptomycin 150 10.3 Sinh tỉng hợp Gentamicin 157 Chơng 11 sản xuất kháng sinh nhóm macrolid 11.1 Tỉng quan vỊ c¸c Macrolid 11 Sinh tổng hợp Erythromycin 162 165 chơng 12 sản xuất kháng sinh chống ung th 12.1 Đại cơng 168 12.2 Các phơng hớng điều trị bệnh ung th 168 http://tieulun.hopto.org 12.3 C¸c kh¸ng sinh chèng ung th− nguån gèc sinh học 170 12.4 Sinh tổng hợp Daunorubicin 172 chơng 13 sản xuất kháng sinh có nguồn gốc từ vi khuẩn 13.1 Sinh tỉng hỵp Polymyxin 175 13.2 Sinh tỉng hỵp Bacitracin 178 10 http://tieulun.hopto.org thờng độc) Có thể đợc phân chia thnh nhóm sau (vừa theo chÕ t¸c dơng, võa theo ngn gèc ho¸ chÊt): a Ho¸ chÊt chèng ung th−: − Dacarbazin; busulphan; c¸c chÊt alkyl ho¸: cyclophosphamid, melphalan, iphosphamid, lomustin − C¸c chÊt chèng chun hãa: methotrexat, mercaptopurin, cytarabin; fluorouracin (chèng ung th− k×m h·m sù ph¸t triĨn cđa tÕ bμo) − C¸c alkaloid từ thực vật v sản phẩm tự nhiên khác: vinblastin, vincristin (dừa cạn); etoposid, teniposid, paclitaxel, taxoid (từ thông đỏ) b Các kháng sinh: Nhóm actinomycin: dactinomycin Các antracyclin v chất liên quan: doxorubicin (adriamycin); daunorubicin; idarubicin Các kháng sinh độc tế bo khác: bleomycin c Hoá chất chống ung th khác: Hợp chất platin hữu cơ: cisplatin, carboplatin Các methylhydrazin: procarbazin Các chất khác: asparaginase; estramustin, tretinoin Điều trị nội tiết: Dùng nội tiết tố kháng nội tiết tố bao gồm: Hormon v chất liên quan nh ethinylestradiol, megestrol, medroxyprogesteron, buserelin Các thuốc đối kháng hormon v chất liên quan: tamoxifen, formestan Điều trị miễn dịch: Mục đích kích thích miễn dịch, tăng khả đề kháng thể để diệt tÕ bμo ung th−, bao gåm: − C¸c cytokin vμ chất điều ho miễn dịch Các yếu tố kích thích tăng trởng cụm bạch cầu: filgrastim Các interferon: tù nhiªn (interferon alpha vμ beta) … interferon alpha 2a, 2b, n1, interferon beta 1a, 1b − C¸c interleukin: aldesleukin, interleukin Điều trị tia xạ: Sử dụng tia phóng xạ để diệt tế bo ung th Cùng với phẫu thuật l phơng pháp điều trị ung th phổ biến v hiệu Việc chọn lựa phơng pháp điều trị phụ thuộc vo vị trí, kích thớc khối u, giai đoạn bệnh nh tổng trạng bệnh nhân Trong 162 http://tieulun.hopto.org phơng pháp ny hoá trị v xạ trị gây tổn thơng đến mô lnh; phẫu thuật triệt để đà có di Các kháng sinh chèng ung th− nguån gèc sinh häc C¸c kh¸ng sinh có nguồn gốc sinh học đợc sử dụng điều trị bệnh ung th chia thnh phân nhóm chÝnh theo cÊu tróc ho¸ häc nh− sau: Nhãm c¸c actinomycin Nhóm bleomycin Nhóm chứa vòng antracyclin Bảng 12.1 C¸c kh¸ng sinh chèng ung th− nguån gèc sinh häc Kháng sinh Năm phát Chủng vi sinh vật Actinomycin F1, C… 1952 Str chrysomallus Actinomycin D 1952 Str antibioticus Actinomycetin 1941 Str albus Bleomycin 1956 Str verticillus Daunorubicin 1963 Str peuceuticus; Str coeruleorubidus Doxorubicin (adriamycin) 1968 Str peuceutius var caesius Carminomycin Actinomadura carmirtana 3.1 Nhãm c¸c Actinomycin Sar L -Pro Sar L-MeVal D-e-lle O L -Pro L-MeVal D-e-lle L-Thr O L-Thr O O N O CH O CH3 H×nh 12.1 CÊu tróc actinomycin D 163 http://tieulun.hopto.org Actinomycin D hay dactinomycin l chất kháng sinh có khả kìm hÃm phát triển tế bo ung th C Hackman tìm thấy vo năm 1952 đợc chiÕt xt tõ chđng x¹ khn Streptomyces antibioticus Nhãm nμy có actinomycin C, C1, K, F nhng có actinomycin D đợc dùng phổ biến trị liệu 3.2 Nhóm bleomycin Bleomycin đợc Hamao Umezawa (1914 1983) tìm vo năm 1956 từ chủng xạ khuẩn Streptomyces verticillus Trong môi trờng nuôi cấy chủng xạ khuẩn ny sinh tổng hợp hỗn hợp nhiều bleomycin khác Ngời ta đà tìm bleomycin tự nhiên v 100 dẫn xuất bleomycin bán tổng hợp nhng có hỗn hợp chứa bleomycin A2 không chứa ion kim loại chiếm 55 70% v bleomycin B2 (25 30%) l dạng đợc sử dụng nhiều để điều trị bệnh ung th vẩy nến, tinh hon v ung th bạch cầu O NH2 H H NH R O NH2 N O N N O H Me H HO O H2N Me HN NH O N H H N O Me HO Me S N S N O ,xH 2SO4 OH NH O HO + O OH O A2: R = -NH[CH 2]3SMe2 B2: R = -NH[CH 2]4NH C OH OH NH NH O OH CONH2 Hình 12.2 Cấu trúc hoá học vài bleomycin 3.3 Nhóm chứa vòng antracyclin Gồm có daunorubicin (rubomycin), adriamycin (doxorubicin) v carminomycin Kháng sinh cđa nhãm nμy lμ daunorubicin cã ®éc tÝnh cao nh−ng lại có tác dụng kìm hÃm cách hiệu số dạng ung th động vật nên thời kỳ đầu đợc sử dụng để điều trị ung th− Sau nμy ng−êi ta t×m adriamycin tõ biÕn chủng S peuceticus có hoạt tính cao v phổ điều trị ung th rộng Hiện adriamycin l kháng sinh trị ung th đợc sử dụng phổ biến 164 http://tieulun.hopto.org O OH R1 OH O O R1 OH R2 CH3 OH NH2 R2 Daunorubicin COCH3 CH3 Adriamycin CO CH2OH CH3 Carminomycin COCH3 H H×nh 12.3 Cấu trúc hoá học vài kháng sinh antracyclin Sinh tổng hợp Daunorubicin 4.1 Đại cơng Daunorubicin đợc tìm lần vo năm 1963 môi trờng nuôi cấy chủng xạ khuẩn S peuceticus hay chủng S coeruleorubidus Daunorubicin vμ adriamycin lμ kh¸ng sinh cã phổ kháng khuẩn vừa phải vi khuẩn Gram dơng nhng hoạt tính yếu vi khuẩn Gram âm v độc Tuy nhiên chúng có khả kìm h·m sù ph¸t triĨn cđa tÕ bμo ung th− theo chế tác động trực tiếp lên cấu trúc phân tử xoắn kép lm biến đổi cấu trúc sinh học phân tử ADN, dẫn tới kìm hÃm trình chép ADN v trình phiên mà sang mARN Trong y học, kháng sinh ny đợc sử dụng dới dạng định độc lập hay phối hợp để điều trị nhiều dạng ung th khác nhau, có hiệu l bệnh ung th bạch cÇu cÊp tÝnh, ung th− vó vμ ung th− phỉi Tuy nhiên kháng sinh ny có nhiều phản ứng phụ nh: độc tính cao, kìm hÃm phát triĨn cđa tủ x−¬ng, nÕu tÝch tơ nhiỊu c¬ thể gây ngộ độc tim 4.2 Cấu trúc ho¸ häc vμ tÝnh chÊt Daunorubicin lμ mét glycosid bao gồm thnh phần: tetracyclic aglycon, daunomycinon v đờng amin lμ daunosamin Daunorubicin hydroclorid lμ bét tinh thÓ mμu ®á cam, dƠ hót Èm, tan n−íc vμ methanol, tan Ýt ethanol, kh«ng tan aceton Tetracyclic aglycon Daunomycinon Daunosamin 165 http://tieulun.hopto.org Daunorubicin hydroclorid cã d¹ng bét pha tiêm, daunorubicin citrat có dạng vi hạt lipid dïng pha lo·ng trun tÜnh m¹ch Do rÊt kÝch øng với mô nên daunorubicin đợc dùng dạng tiêm tĩnh mạch Bảo quản tránh ánh sáng Dạng vi hạt lipid phải bảo quản - 8OC v tránh đóng băng 4.3 Điều kiện lên men Chủng xạ khuÈn sinh daunorubicin S coeruleorubidus lμ vi sinh vËt hiÕu khí, nhiệt độ nuôi cấy thích hợp từ 26 - 27OC Môi trờng nhân giống (% w/v) Pepton 0,6 Nấm men khô 0,3 Ca(NO3)2.H2O 4,0 Nớc máy vđ pH 7,2 Môi trờng lên men (% w/v) Bột đậu tơng 4,0 Dịch bà rợu 0,5 Tinh bột 4,0 Dầu đậu nnh 0,5 NaCl 1,0 Nớc máy vđ pH 7,2 Cấp khí với lu lợng 0,5 VVM; thời gian lên men: 60 - 80 Daunorubicin v dẫn suất khác đợc hình thnh trình lên men l chất độc mạnh v đợc xem nh tác nhân gây đột biến Vì trình tách v tinh chế yêu cầu độ an ton nghiêm ngặt (thờng tiến hnh dây chuyền kín) 4.4 Quy trình chiết xuất Daunorubicin l sản phẩm nội bo Kết thúc lên men dịch đợc acid hoá acid oxalic d 50OC để thuỷ phân glycosid liên kết với daunorubicin Giữ thời gian 60 90 phút, sau lọc loại sinh khối Dịch lọc đợc chỉnh pH = 4,5 råi hÊp phơ daunorubicin trªn nhùa Amberlite IRC-50 Rưa cét triệt để theo trình tự dung môi nớc, methanol 50% n−íc vμ b»ng hƯ dung m«i methanol - n−íc (9:1) Ph¶n hÊp phơ daunorubicin 166 http://tieulun.hopto.org b»ng hƯ 1% NaCl methanol - nớc (9:1) Dịch phản hấp phụ đợc cô đặc 1/5 thể tích; chỉnh pH = 8,5 råi chiÕt b»ng cloroform (tû lƯ b»ng kho¶ng nửa so với dung môi) Phân đoạn cloroform đợc cô chân không xuống khoảng 1/100 bổ sung vo 10V hexan để kết tinh thu đợc daunorubicin thô Tự lợng giá Kể tên v phân loại kháng sinh chống ung th đợc sản xuất đờng sinh học Nêu tên chủng vi sinh vật sinh tổng hợp daunorubicin v điều kiện lên men tạo daunorubicin 167 http://tieulun.hopto.org Chơng 13 sản xuất số kháng sinh có nguồn gốc từ vi khuẩn Mục tiêu Sau học xong chơng ny sinh viên phải trình by đợc: Tên kháng sinh đợc sản xuất từ vi khuẩn công nghiệp Quy trình lên men vμ chiÕt xuÊt Polymycin Trong danh s¸ch c¸c kh¸ng sinh đà mô tả có đến 140 chất có nguồn gèc tõ vi khuÈn, nh−ng chØ cã mét sè rÊt Ýt chÊt cã øng dông y häc nh−: Polymyxin, gramicidin, bacitracin , Ngoi có nisin đợc dùng chăn nuôi v công nghiệp thực phẩm Các chất khác không đợc ứng dụng có độc tính cao thể Về cấu trúc hoá học, kháng sinh vi khuẩn tạo l polypeptid Nghiên cứu đờng sinh tổng hợp kháng sinh polypeptid l mô hình để tổng hợp peptid nãi chung cã ho¹t tÝnh sinh häc lμ mét vÊn ®Ị cã ý nghÜa lý thut rÊt lín Sau ®©y giíi thiƯu mét vμi kh¸ng sinh quan träng vi khuẩn tạo Sinh tổng hợp Polymyxin 1.1 Đại cơng Polymyxin l tên gọi nhóm kháng sinh cã cÊu tróc polypeptid vi khuÈn Bacillus polymyxa vμ Bacillus circulans tạo Năm 1947, ba nhóm nh khoa häc gåm nhãm Ainsworth, nhãm Benedict vμ nhãm Stansly đà phân lập đợc từ chủng vi khuẩn Bacillus polymyxa hỗn hợp gồm polymyxin A, B, C, D v E Các nghiên cứu sau ny cho thấy polymyxin B, D vμ E l¹i chia B1 - B2, D1 – D2 v μ E1 - E2 Danh s¸ch polymyxin đợc tìm thấy từ chủng vi khuẩn ngμy cμng nhiÒu nh− polymyxin M, polymyxin F1, F2, F3… Do độc tính cao thận nên chất l polymyxin B v polymyxin E đợc dùng dới dạng muối sulfat để điều trị bệnh nhiễm trùng vi khuẩn Gram (-) Đến năm 1950, Koyama v cộng đà chiết đợc từ môi tr−êng nu«i cÊy chđng vi khn Bacillus colistinus chÊt colistin (hay colimyxin) bao gåm 168 http://tieulun.hopto.org chÊt colistin A, B v C có hoạt tính kháng khuẩn mạnh gấp lần polymyxin m độc tính lại thấp Các phân tích cấu trúc hoá học sau ny cho thÊy colistin A chÝnh lμ polymyxin E1 1.2 CÊu tróc hoá học v tính chất Các polymyxin đà đợc nghiên cứu kỹ, riêng polymyxin B, đà tổng hợp đợc Về cấu tạo chúng l polypeptit vòng khác thnh phần v số lợng acid amin Phân tử polymyxin M cã chøa D-leucin, gèc treonin vμ gèc acid α, γ diaminobutyric (DAB) Ngoμi cßn chøa gèc acid -6-metyloctanoic γ NH2 R DAB Thr DAB D X Thr DAB γ NH2 γ NH2 X Y Z Y DAB Z γ NH2 Tªn R DAB Polymyxin B1 (+)-6-methyloctanoyl Phe Leu DAB Polymyxin B2 6-methylheptanoyl Phe Leu DAB Polymyxin D1 (+)-6-methyloctanoyl Leu Thr D-Ser Polymyxin D2 6-methylheptanoyl Leu Thr D-Ser γ NH2 DAB R DAB Thr DAB D Leu Leu DAB DAB DAB γ NH2 Thr γ NH2 Tªn Polymyxin E1 hay Colistin A Polymyxin E2 γ NH2 R (+)-6-methyloctanoyl 6-methylheptanoyl Polymyxin M H×nh 13.1 CÊu tróc ho¸ häc cđa mét sè polymyxin theo Merck Index 1996 DAB: L-α, γ - diaminobutyric acid R: acid bÐo, X, Y, Z: c¸c acid amin 169 http://tieulun.hopto.org C¸c polymyxin cã tác dụng diệt khuẩn, thuốc gắn vo phospholipid lm thay ®ỉi tÝnh thÊm vμ thay ®ỉi cÊu tróc mμng tÕ bo vi khuẩn Hoạt tính kháng khuẩn polymyxin B giới hạn số chủng vi khuẩn Gram (-) nh− E coli, Aerobacter aerogenes, Salmonella, Proteus… vμ đặc biệt trực khuẩn mủ xanh Ps aeruginosa Trong y học polymyxin B đợc dùng chỗ, đơn độc hay phối hợp với số hợp chất khác nh neomycin sulfat, oxytetracyclin, hydrocortison điều trị nhiễm khuẩn mắt, tai mịi häng vμ mét sè nhiƠm khn kh¸c Polymyxin E hay colistin đợc dùng y học dới dạng muối sulfat để điều trị chỗ nhiễm khuẩn đờng tiết niệu hay đờng tiêu hoá Dạng muối colistin natri mesilat đợc dùng dạng tiêm để điều trị nhiễm khuẩn huyết, viªm mμng n·o, nhiƠm khn thËn… vμ chØ sư dơng không dùng đợc thuốc khác độc tính cao 1.3 Điều kiện lên men Để sinh tổng hợp polymyxin ngời ta nuôi cấy B polymyxa môi trờng thạch có thnh phần (%): Cao ngô 0,5 Cao nấm men 0,5 Glucose 2,0 Agar 2,0 pH 6,8 ÷ 7,2 Khư trïng 110°C/20 Nu«i ë 28°C thêi gian 24 Môi trờng nhân giống gồm (%): Cao ngô 1,0 Bột đậu tơng 1,0 Glucose 2,0 Sulfat amoni 0,3 pH 6,8 ÷ 7,2 Khư trïng 115°C/20 CÊy gièng vo v nuôi 18- 20 giờ/28C Môi trờng lên men tạo kháng sinh có thnh phần (%): Cao ngô 1,0 Bột đậu tơng 2,0 Glucose 3,0 v số muối: MgSO4 7H2O; KH2PO4; NaCl Khư trïng m«i tr−êng vμ cấy giống vo với lợng ữ2,5% Tiến hnh lên men điều kiện: nhiệt độ 28 - 30C Thông khí với lu lợng 1VVM Thời gian lên men 30 - 36 giê 170 http://tieulun.hopto.org 1.4 ChiÕt xuÊt polymyxin tõ môi trờng lên men Trong công nghiệp để chiết polymyxin đà sử dụng phơng pháp trao đổi ion Bản chất ho¸ häc cđa kh¸ng sinh lμ polypeptid C¸c acid amin phân tử polymyxin có chứa nhóm amin tự do, có khả trao đổi với nhóm carboxyl phân tử nhựa loại carboxycationit Nh KB-2, KB-HP-2, Amberlit, IRC-50 Quá trình chiết tiến hnh nh sau: Dịch lên men xong đợc acid hoá đến pH 3,5 ữ 4,0 để giải phóng kháng sinh (có thể sử dụng acid oxalic để loại ion calci) Lọc loại sinh khèi DÞch läc trung hoμ b»ng NaOH Cã thĨ chiÕt polymyxin từ dịch lọc ny dung môi hữu n-butanol Sau kết tủa aceton Dịch lọc đà trung ho đợc lọc qua thuỷ tinh đến suốt bơm qua cột trao đổi ion dạng Na+(R-COO-Na+) Cột đà bÃo ho kháng sinh rửa nớc cất hay nớc đà khử khoáng Phản hấp phụ kháng sinh acid hydrocloric hay sulfuric 10% Dịch phản hấp phụ tẩy mu than hoạt, lọc loại than Dịch lọc đem loại cation kim loại sulfocationit ví dơ: KU-2-20 hay SBS - Trung hoμ dÞch b»ng cách cho chảy qua cột anionit dạng OH Dịch kháng sinh đà trung ho đợc bốc chân không nhiệt độ 35C, áp suất 10 15 mmHg Sau phun sấy để thu lấy kháng sinh Sinh tổng hợp Bacitracin 2.1 Đại cơng Bacitracin l kh¸ng sinh polypeptid c¸c chđng vi khn B licheniformis tạo (Johnson, Anker et al 1945) Sau Newton (1949) v Abraham (1950) đà chiết đợc từ môi trờng nuôi cấy B subtilis hỗn hợp kháng sinh gọi lμ eifaivin Eifaivin cã b¶n chÊt polypetid gièng víi bacitracin Thực tế công nghiệp để sản xuất bacitracin đà sư dơng B licheniformis 2.2 CÊu tróc ho¸ häc B»ng phơng pháp sắc ký ngời ta đà xác định bacitracin l hỗn hợp gồm 10 kháng sinh khác §ã lμ bacitracin A, A1, B, C, D, E, F1, F2, F3, v G bacitracin A chiếm khoảng 37% Độc tính kháng sinh khác Bacitracin C độc bacitracin A v B, bacitracin F độc Newton v Abraham (l953) đà xác định đợc cấu trúc phân tử bacitracin A gồm 10 gốc acid amin kết hợp với vòng thiazol Trong ®ã cã gèc Lisoleucin, c¸c acid amin kh¸c lμ: L-leucin; L-cystein, L-histidin, L-lysin, Lasparaginic, D- phenylalanin, D-ornitin, D-asparaginic vμ D-glutamic 171 http://tieulun.hopto.org H×nh 13.2 CÊu tróc hãa häc cđa ph©n tư bacitracin A ChÕ phÈm bacitracin chøa chđ u bacitracin A l bột trắng xám, vị đắng gắt, tan n−íc vμ ethanol Kh«ng tan ether, chloroform, aceton Bền dung dịch acid, không bền dung dịch kiềm Hoạt tính kháng sinh thấp dần từ bacitracin A đến bacitracin F Bảng 13.1 Hoạt tính kháng sinh bacitracin Bacitracin Hoạt lực tơng tơng đối bacitracin trªn Corynebacterium xerosis A B 0,075 C 0,500 D 0,014 E 0,008 F1 0,055 F2 0,028 F3 0,014 G 0,140 Bacitracin có tác dụng kìm khuẩn hay diệt khuẩn nhờ khả ức chế tổng hợp vỏ tế bo vi khuẩn Nó có hoạt tính cao vi khuẩn Gram (+) hoạt phổ giống với penicillin, tác dụng vi khuẩn Gram (-) Trớc bacitracin đợc dùng để tiêm nhng độc tính cao thận nên dùng chỗ để điều trị vết thơng ngoi da, số bệnh mắt Thờng đợc sử dụng dới dạng phức hợp bacitracin kẽm hay dới dạng hỗn hợp với neomycin polymyxin B Trong nông nghiệp, phức hợp bacitracin kẽm đợc dùng để lm chất kích thích tăng trởng 172 http://tieulun.hopto.org 2.3 Điều kiện lên men 2.3.1 Chủng giống B licheniformis lμ nh÷ng trùc khn cã bμo tư, sèng hiÕu khÝ, nhiệt độ nuôi cấy thích hợp l 37OC Trong công nghiệp để sản xuất bacitracin đà sử dụng chủng cã sè hiÖu ATCC 9945, 10716, 11945, 11946 vμ 14580 2.3.2 Môi trờng dinh dỡng Tỷ lệ hydrat carbon v nitơ quan trọng thnh phần môi trờng nuôi cấy B licheniformis để sinh tổng bợp bacitracin Nếu tỉ lệ ny thích hợp tạo bacitracin v tỉ lệ không thích hợp tạo licheniformin có hoạt tính kháng khuẩn thấp Hình 13.2 Trực khuẩn B licheniformis sinh bacitracin Môi trờng thạch nghiêng giữ giống (w/v): Trypton 5,0 D-glucose 1,0 Dịch chiết nấm men 2,5 Agar 15,0 Môi trờng nhân giống (w/v): Pepton 10,0 Glucose 5,0 Cao thÞt 5,0 NaCl 2,5 MnCl2 0,167 pH 7,0 Môi trờng lên men (w/v): Citric acid 1,0 Glucose 0,5 KH2PO4 0,5 K2HPO4 0,5 MgSO4 7H2O 0,2 MnSO4 4H2O 0,01 173 http://tieulun.hopto.org FeSO4 7H2O 0,01 Dầu phá bọt theo nhu cầu pH 7,0 Tiến hnh lên men 37OC B licheniformis l chủng hiếu khí nên cần cấp khí mạnh với lu lợng 1VVM (nhất l đầu) Máy khuấy tốc độ 110 vòng/phút Phá bọt dầu cọ dầu lạc Thời gian lên men khoảng 45-50 Bacitracin đợc chiết xuất dung môi hữu (n-butanol hay ethanol) theo quy trình sau: Dịch lên men đợc ly tâm để loại nớc, acid hoá sinh khối để chiết kháng sinh khỏi tế bo vi khuẩn Lọc loại tế bo Dịch lọc đem chiết kháng sinh ethanol n-butanol Cô kết tinh lÊy tinh thĨ bacitracin D¹ng mi kÏm cđa bacitracin bền vững nên ngời ta tạo muối từ chiết kháng sinh khỏi môi trờng lên men Phơng pháp ny hay áp dụng để lấy sản phẩm dùng chăn nuôi Kết thúc lên men thêm dung dịch ZnSO4 0,01% để tạo phức kẽm bacitracin bền vững Dịch thu đợc đợc cô chân không nhiệt độ 40OC đến hm lợng chất đặc l 40%, sau phun sấy thu đợc bột bacitracin thô dùng chăn nuôi Bảo quản chỗ khô mát, nhiệt độ 25OC dịch lên men (a) ly tâm (b) tạo phức ZnSO4 sinh khối cô < 40oC hàm lợng chất đặc 40% acid hóa sấy phun pH = 2,5 - 3,0 Chiết Sản phẩm thô cho chăn nuôi ethanol cô kết tinh bacitracin Hình 13.3 Quy trình chiết xuất bacitracin y học (a) chăn nuôi (b) 174 http://tieulun.hopto.org Tự lợng giá Tìm mối liên hệ chung cấu trúc polymycin v bacitracin Nªu tªn chđng vi sinh vËt sinh tỉng hợp polymycin v điều kiện lên men tạo kháng sinh Trình by quy trình lên men v chiết xuất bacitracin 175 http://tieulun.hopto.org Ti liệu tham khảo Kiều Hữu ảnh - Giáo trình vi sinh vật học công nghiệp NXB Khoa häc vμ Kü thuËt 1999 Bé m«n Công nghiệp Dợc Kỹ thuật sản xuất dợc phẩm, tập Trờng Đại học Dợc H nội 2001 Từ Minh Koóng - Cơ sở công nghệ sinh học v sản xuất dợc phẩm NXB Y học 2004 Nguyễn Văn Cách Công nghệ lên men chất kh¸ng sinh NXB Khoa häc vμ Kü thuËt 2004 Edward Alcamo - Fundamentals of microbiology (Third Edition) The Benjamin/Cummings Publishing Company Inc., 1991 K.P Gaponov - Process and equipments of microbiology’s production Light and food industry Moskva 1981 (b¶n tiÕng Nga) John E S Biotechnology Third edition Cambridge University Press; 1996 Lantini D., Parenti F - Antibiotics Springer-Verlag New York Inc 1982 (b¶n tiÕng Nga) Thomas D B., Michael T M., John M M., Jack P – Biology of Microorganisms Seventh edition Prencice Hall, Englewood Cliffs, New Jersey 07632 10 Wolfgang Fritsche - C¬ së hoá sinh vi sinh vật học công nghiệp NXB Khoa häc vμ Kü thuËt 1983 176 http://tieulun.hopto.org ... Chơng Sản xuất Protein đơn bo 5.1 Sự cần thiết sản xuất protein đơn bo 5.2 Sản xuất sinh khối nấm men 5.3 Sản xuất tảo đơn bo 5.4 Sản xuất nấm sợi 5.5 Sản xuất nấm ăn 64 Chơng Sản xuất sản phẩm. .. gọi công nghệ lên men 37 http://tieulun.hopto.org chất rắn l công nghệ gia đình, công nghệ lên men truyền thống Chính công nghệ ny đà bổ sung đợc nhiều sản phẩm quí hiếm, đặc biệt l thực phẩm. .. ngnh công nghệ mang tính bác học Những công ty công nghệ sinh học có đặc điểm m thờng không gặp công ty khác Có thể tóm tắt nh sau: Công nghệ điều chỉnh v gồm nhiều ngnh, việc phát triển sản phẩm