Nghiên cứu tác dụng trên ký sinh trùng sốt rét và độc tính trên thực nghiệm của thuốc sốt rét phối hợp dihydroartemisinin - piperaquin do Việt Nam sản xuất
Bộ giáo dục và đào tạo Bộ y tế Viện Dợc liệu Nguyễn thị Minh Thu Nghiên cứu tác dụng trên ký sinh trùng sốt rét v độc tính trên thực nghiệm của thuốc sốt rét phối hợp dihydroartemisinin piperaquin do Việt Nam sản xuất Chuyên ngành: Dợc lý Mã số: 62.73.05.01 Tóm tắt Luận án tiến sĩ Dợc học Hà Nội - 2009 Công trình đợc hoàn thành tại: Viện Sốt rét - Ký sinh trùng - Côn trùng Trung ơng, Viện Dợc liệu, Đại học Y Hà Nội, và Học viện Quân y. Ngời hớng dẫn khoa học: TS. Trơng Văn Nh PGS. TS. Nguyễn Trần Thị Giáng Hơng Phản biện 1: GS. TSKH. Bùi Đại Bệnh viện Trung ơng Quân đội 108 Phản biện 2: PGS. TSKH. Đỗ Trung Đàm Viện Dợc liệu Phản biện 3: PGS. TS. Phạm Văn Thân Trờng Đại học Y Hà Nội Luận án đợc bảo vệ trớc hội đồng chấm luận án cấp Nhà nớc họp tại Viện Dợc liệu Vào hồi 8 giờ 30 phút ngày 15 tháng 4 năm 2009 Có thể tìm hiểu luận án tại: Th viện Viện Dợc liệu Th viện Quốc gia Việt Nam Th viện Viện sốt rét - Ký sinh trùng - Côn trùng Trung ơng Các công trình công bố liên quan đến luận án 1. Nguyễn Thị Minh Thu, Trơng Văn Nh, Nguyễn Thợng Dong, Nguyễn Kim Phợng, Nguyễn Văn Hùng, Đỗ Thị Phơng (2006), Nghiên cứu ảnh hởng của thuốc sốt rét phối hợp piperaquin-dihydroartemisinin do Việt Nam sản xuất trên phản xạ có điều kiện ở chuột cống trắng, Tạp chí Dợc học, số 364, 8/2006, tr. 31-34. 2. Nguyễn Thị Minh Thu, Trơng Văn Nh, Lê Khánh Thuận, Nguyễn Văn Hùng, Bùi Thị Sáu (2006), Nghiên cứu ảnh hởng của thuốc sốt rét phối hợp piperaquin-dihydroartemisinin đến phản xạ tìm thức ăn trong mê lộ của chuột nhắt trắng, Tạp chí Dợc học, số 367, 11/2006, tr. 19-23. 3. Nguyễn Thị Minh Thu, Trơng Văn Nh, Lê Khánh Thuận, Nguyễn Trần Giáng Hơng, Trần Thanh Tùng (2007), Nghiên cứu ảnh hởng của thuốc sốt rét phối hợp piperaquin-dihydroartemisinin đến huyết áp và tim cô lập của động vật thực nghiệm, Tạp chí Dợc học, số 374, 6/2007, tr. 22-26. 4. Nguyễn Thị Minh Thu, Trơng Văn Nh, Trần Văn Hợp, Nguyễn Trọng Chăm, Nguyễn Trần Giáng Hơng (2007), Nghiên cứu ảnh hởng của thuốc sốt rét phối hợp piperaquin - dihydroartemisinin đến sự biến đổi hình thái gan và thận thỏ, Tạp chí phòng chống bệnh sốt rét và các bệnh ký sinh trùng, số 4, tr. 43-51. 5. Nguyễn Thị Minh Thu, Trơng Văn Nh, Vũ Văn lạp, Đinh Xuân Hơng, Võ Nh Phơng (2007), Nghiên cứu ảnh hởng của thuốc sốt rét phối hợp dihydroartemisinin - piperaquin đến điện tim thỏ, Tạp chí phòng chống bệnh sốt rét và các bệnh ký sinh trùng, số 6, tr. 28-34. 6. Nguyễn Thị Minh Thu, Trơng Văn Nh, Nguyễn Trần Giáng Hơng (2007), Nghiên cứu ảnh hởng của thuốc sốt rét phối hợp dihydroartemisinin - piperaquin đến quá trình sinh sản của chuột nhắt trắng, Tạp chí Dợc học, số 380, 12/2007, tr. 12-17. 7. Nguyễn Thị Minh Thu, Trơng Văn Nh, Nguyễn Kim Phợng, Đỗ Thị Phơng (2008), Nghiên cứu ảnh hởng của thuốc sốt rét phối hợp piperaquin - dihydroartemisinin đến tim thỏ cô lập, Tạp chí Dợc học, số 382, 2/2008, tr. 32-35 & 40. 8. Nguyễn Thị Minh Thu, Nông Thị Tiến, Nguyễn Mai Hơng, Trơng Văn Nh (2008), Nghiên cứu tác dụng trên ký sinh trùng sốt rét của thuốc phối hợp dihydroartemisinin - piperaquin, Tạp chí Dợc học, số 385, 5/2008, tr. 22-27. 9. Nguyễn Thị Minh Thu, Nguyễn Kim Phợng, Trơng Văn Nh, Đỗ Thị Phơng, Nguyễn Thị Phợng (2008), Nghiên cứu ảnh hởng của thuốc sốt rét phối hợp dihydroartemisinin - piperaquin đến sự phát triển hệ sinh dục của chuột cống trắng, Tạp chí Dợc học, số 387, 7/2008, tr. 19-22. 10. Nguyễn Thị Minh Thu, Trơng Văn Nh, Nguyễn Trần Giáng Hơng, Lê Minh Đạo, Bùi Thị Sáu (2008), Nghiên cứu ảnh hởng của thuốc sốt rét phối hợp dihydroartemisinin - piperaquin đến thể trạng và một số chỉ số sinh hoá, huyết học ở thỏ, Hội nghị khoa học toàn quốc lần thứ IV: Hoá sinh và sinh học phân tử phục vụ nông, sinh, y học và công nghiệp thực phẩm, NXB Khoa học và kỹ thuật, tr. 545-549. 11. Nguyễn Thị Minh Thu, Trơng Văn Nh, Trần Thị Thanh Hơng (2008), Nghiên cứu khả năng gây đột biến nhiễm sắc thể của thuốc sốt rét phối hợp dihydroartemisinin - piperaquin, Tạp chí Dợc liệu, số 5, tr. 235-239. 24 dục của chuột cống trắng ở hai liều 100 mg/kg/ngày x 28 ngày và 300 mg/kg/ngày x 12 ngày đầu và 200 mg/kg/ngày x 16 ngày tiếp theo. 3.3. Hoạt động thần kinh trung ơng của ĐVTN Thuốc phối hợp DHA-PQP không ảnh hởng đến hoạt động thần kinh trung ơng của chuột nhắt trắng ở liều 120 mg/kg/ngày x 5 ngày, 1 đợt và 2 đợt và chuột cống trắng ở liều 100 và 150 mg/kg/ngày, uống liên tục trong suốt quá trình nghiên cứu. Thuốc có tác dụng ức chế hệ thần kinh trung ơng của chuột nhắt trắng ở liều 240 mg/kg/ngày x 5 ngày, 1 đợt. 3.4. Huyết áp và tim cô lập của ĐVTN Trên chó, thuốc phối hợp DHA-PQP không gây ảnh hởng đến huyết áp và nhịp tim chó ở hai liều 64 và 120 mg/kg. DHA-PQP không ảnh hởng đến hoạt động của tim ếch cô lập ở các nồng độ 16 và 32 mg/100mL, nhng gây ngừng tim ếch cô lập (kỳ tâm trơng) ở nồng độ 53,5 mg/100mL. DHA-PQP không ảnh hởng đến hoạt động của tim thỏ cô lập ở nồng độ 0,001%. Với nồng độ 0,002% (truyền liên tục 25 phút), DHA-PQP gây giảm nhịp tim, lu lợng dịch qua tim và biên độ co bóp cơ tim thỏ cô lập. Thuốc gây ngừng tim thỏ cô lập (kỳ tâm trơng) ở nồng độ 0,003%. d. KIếN NGHị 1. Hoàn chỉnh thử lâm sàng trên bệnh nhân sốt rét. 2. Sau khi có đủ dữ liệu tiền lâm sàng và lâm sàng, sản xuất viên nén phối hợp DHA-PQP từ các nguyên liệu trong nớc để đáp ứng nhu cầu sử dụng thuốc phối hợp cho Dự án Quốc gia Phòng chống sốt rét và xuất khẩu. 1 a. giới thiệu luận án 1. Đặt vấn đề Bệnh sốt rét (SR) đợc y tế cộng đồng quan tâm hàng đầu và là một trong những nguyên nhân chính gây đói nghèo tại các nớc đang phát triển. Hàng năm, thế giới có khoảng 300 - 500 triệu ngời mắc SR và 2 triệu ca tử vong, trong đó có khoảng 1 triệu trẻ em dới 5 tuổi ở châu Phi và Nam Sahara chết do SR. Hơn 100 nớc trên thế giới có lu hành SR, hơn 2400 triệu ngời, xấp xỉ 40% dân số thế giới có nguy cơ bị SR (Tổ chức Y tế thế giới, WHO, 2000). Một trong những thách thức lớn nhất với phòng chống SR hiện nay là ký sinh trùng (KST) SR kháng thuốc. Nhiều thuốc đã bị kháng, nh: chloroquin, amodiaquin, sulfadoxin - pyrimethamin và quinin, thuốc chọn lọc để điều trị SR nặng và SR ác tính ở Thái Lan, Campuchia, Myanmar và ngay cả ở Việt Nam. Do đó, WHO kêu gọi các nớc tập trung nghiên cứu các thuốc SR mới. Các dẫn xuất của artemisinin nh: dihydroartemisinin (DHA), artemether, arteether, artesunat, natri artenilat đều thể hiện hiệu lực diệt KST mạnh, cắt sốt nhanh và an toàn. Tuy nhiên, nhợc điểm chính của nhóm thuốc này là với liệu trình điều trị 3-5 ngày thờng có tỷ lệ tái phát cao > 25%. Vì vậy, WHO đã khuyến cáo dùng phối hợp dẫn xuất ART với một thuốc SR khác có thời gian bán thải dài hơn. Thuốc phối hợp gồm: 40 mg DHA và 320 mg piperaquin phosphat (PQP), Artekin (Trung Quốc sản xuất), đã đợc phát triển. Các thử nghiệm lâm sàng ở Campuchia và Thái Lan trên bệnh nhân nhiễm P. falciparum cha biến chứng cho thấy, có hiệu quả cao trong điều trị SR với thời gian sạch KST nhanh (trong vòng 72 giờ) và tỷ lệ điều trị khỏi đạt tới 95 - 96%. 2 Năm 2004, Viện Hoá học lần đầu tiên đã sản xuất thành công PQ. Đó là cơ sở để sản xuất thuốc SR phối hợp DHA-PQP từ nguyên liệu trong nớc, nhằm chủ động nguồn nguyên liệu. Để đánh giá tính an toàn của một thuốc SR phối hợp có khả năng chống kháng, với nguyên liệu lần đầu tiên đợc sản xuất tại Việt Nam, cùng với ý nghĩa góp phần bổ sung vào hồ sơ về tính an toàn của thuốc, đề tài Nghiên cứu tác dụng trên ký sinh trùng sốt rét và độc tính trên thực nghiệm của thuốc sốt rét phối hợp dihydroartemisinin - piperaquin do Việt Nam sản xuất đợc tiến hành với các mục tiêu sau đây. 2. Mục tiêu 2.1. Xác định hiệu lực (in vitro và in vivo trên chuột nhiễm KST SR) của thuốc phối hợp DHA-PQP do Việt Nam sản xuất. 2.2. Xác định độc tính cấp và độc tính bán trờng diễn của thuốc phối hợp DHA-PQP trên động vật thực nghiệm. 2.3. Đánh giá ảnh hởng của thuốc phối hợp DHA-PQP (do Việt Nam sản xuất) đến một số chức năng sinh sản, thần kinh trung ơng và tim mạch của động vật thực nghiệm. 3. Nội dung nghiên cứu - Đánh giá hiệu lực của DHA-PQP trên Plasmodium falciparum và P. berghei chủng nhạy và kháng chloroquin (CQ). - Xác định độc tính cấp của DHA-PQP trên chuột nhắt trắng. - Xác định độc tính bán trờng diễn: đánh giá ảnh hởng của DHA-PQP đến một số chỉ số sinh hoá, huyết học, chức năng gan, thận, điện tim của động vật thực nghiệm (ĐVTN). - Đánh giá ảnh hởng đến di truyền: đột biến nhiễm sắc thể (NST), quá trình sinh sản của động vật. 23 2. Độc tính cấp và bán trờng diễn của DHA-PQP trên ĐVTN: 2.1. Độc tính cấp của DHA-PQP trên chuột nhắt trắng: Thuốc phối hợp DHA-PQP có độc tính thấp, theo đờng uống liều LD 0 = 1400 mg/kg, LD 100 = 2800 mg/kg và LD 50 = 2063,38 mg/kg (1933,62 2191,31 mg/kg) ở P = 0,05. 2.2. Độc tính bán trờng diễn của DHA-PQP trên thỏ: ở hai liều đờng uống 64 mg và 100 mg/kg/ngày ì 28 ngày liên tiếp, thuốc phối hợp DHA-PQP không gây ảnh hởng đến thể trạng và sức lớn của thỏ, không ảnh hởng có ý nghĩa thống kê đến chức năng gan (hàm lợng AST, ALT, protein và bilirubin toàn phần và vi thể mô gan), chức năng thận (hàm lợng creatinin và vi thể mô thận), chức năng tạo máu (hàm lợng hemoglobin, số lợng hồng cầu, bạch cầu, công thức bạch cầu, số lợng tiểu cầu, hematocrit, thể tích trung bình hồng cầu) và điện tim (nhịp tim, các sóng điện tim) của thỏ thực nghiệm. 3. ảnh hởng của DHA-PQP đến một số chức năng sinh sản, thần kinh trung ơng và tim mạch của ĐVTN 3.1. Đột biến NST và đột biến gen ở chuột nhắt trắng: Thuốc phối hợp DHA-PQP có khả năng gây đột biến cấu trúc NST tế bào tuỷ xơng ở chuột nhắt trắng với liều đờng uống 360 mg/kg/ngày ì 5 ngày (gấp 30 lần liều dùng trên ngời, tức liều tơng đơng gấp 3 lần liều dùng điều trị trên ngời). DHA-PQP không gây đột biến gen ở chuột thực nghiệm với liều 120 mg/kg/ngày ì 5 ngày. ở cả ba thế hệ P, F1 và F2, thuốc không ảnh hởng đến quá trình sinh sản, sự phát triển của phôi thai và chuột con, không gây dị tật bẩm sinh. 3.2. Sự phát triển hệ sinh dục chuột cống trắng: DHA-PQP không gây ảnh hởng đến sự phát triển hệ sinh 22 10, 15, 20, 25 truyền thuốc và khi ngừng truyền thuốc tại 0, 5, 10, 15, 20, 25. Kết quả cho thấy, ở nồng độ 0,001%, thuốc phối hợp DHA- PQP không ảnh hởng đến nhịp tim thỏ, gây tăng nhẹ biên độ co bóp cơ tim và giảm lu lợng dịch chảy qua tim tại các thời điểm truyền thuốc và sau khi ngừng truyền thuốc so với thời điểm ban đầu, nhng sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê (P (i-0) > 0,05). ở nồng độ 0,002%, thuốc phối hợp DHA-PQP gây giảm nhịp tim, giảm lu lợng dịch qua tim và giảm biên độ cơ tim thỏ. Trong 20 phút đầu truyền thuốc, nhịp tim và lu lợng dịch nuôi qua tim thay đổi không có ý nghĩa thống kê so với ban đầu (P > 0,05), nhng từ phút 25 và sau khi ngừng truyền thuốc các chỉ số này giảm có ý thống kê so với trớc khi truyền (P (i-0) < 0,05 và < 0,01). Đặc biệt, biên độ co bóp cơ tim thỏ giảm mạnh từ phút thứ 10 trở đi, các giá trị P (i-0) < 0,05, < 0,01 và < 0,001. ở nồng độ 0,003%, DHA-PQP cũng làm chậm nhịp tim, giảm biên độ co bóp cơ tim rõ rệt và nhanh chóng gây ngừng tim thỏ cô lập ở kỳ tâm trơng. C. kết luận 1. Hiệu lực trên KST SR in vitro và in vivo: - Thuốc phối hợp DHA-PQP do Việt Nam sản xuất có hiệu lực in vitro cao với P. falciparum đơn dòng T996 (nhạy CQ) và phân lập K1 (kháng CQ), với IC 50 là 4,1 và 2,5 nmol/L và MIC là 8,8 và 4,4 nmol/L. - Trên chuột nhắt trắng nhiễm P. berghei chủng kháng CQ (K70), thuốc phối hợp DHA-PQP, với tổng liều 584 mg (64,89 mg DHA và 519,11 mg PQP) /kg/3 ngày, có tác dụng điều trị khỏi 90% chuột nhiễm P. berghei. 3 - Đánh giá ảnh hởng của DHA-PQP đến một số chức năng hoạt động của hệ thần kinh trung ơng ĐVTN. - Đánh giá ảnh hởng của DHA-PQP đến huyết áp và tim cô lập của ĐVTN. 4. đóng góp mới của luận án - Đã nghiên cứu hiệu lực và độc tính trên thực nghiệm của thuốc sốt rét phối hợp DHA-PQP, với nguyên liệu đợc sản xuất tại Việt Nam. - Chứng minh trên thực nghiệm, thuốc phối hợp DHA-PQP do Việt Nam sản xuất có hiệu quả cao trên KST SR và an toàn, là cơ sở để sản xuất và sử dụng thuốc trên bệnh nhân sốt rét từ nguồn nguyên liệu chủ động trong nớc, không phải nhập khẩu. - Đã phát hiện khả năng gây đột biến nhiễm sắc thể tế bào tuỷ xơng của chuột nhắt trắng ở liều gấp 30 lần liều dùng trên ngời (360 mg/kg/ngày ì 5 ngày). - Đã xác định: ở liều 100 mg/kg/ngày ì 28 ngày và 300 mg/kg/ngày ì 12 ngày đầu + 200 mg/kg/ngày ì 16 ngày sau, DHA- PQP an toàn với sự phát triển cơ quan sinh dục của chuột cống trắng. - Đã phát hiện, thuốc phối hợp DHA-PQP ở nồng độ 53,5 mg/100 mL và 0,003% (truyền liên tục 25 phút) gây ngừng tim ếch và tim thỏ cô lập ở kỳ tâm trơng. 5. bố cục của luận án Luận án gồm 4 chơng, 140 trang, 47 bảng, 31 hình, 1 phụ lục, và 172 tài liệu tham khảo. Đặt vấn đề 2 trang, tổng quan 31 trang, đối tợng, phơng tiện và phơng pháp nghiên cứu 24 trang, kết quả nghiên cứu 51 trang, bàn luận 29 trang, kết luận và đề nghị 3 trang; các công trình đã công bố có liên quan đến luận án 3 trang, tài liệu tham khảo 22 trang, phụ lục 8 trang. 4 B. nội dung của luận án Chơng 1. Tổng quan Tổng kết tài liệu của các tác giả trên thế giới và trong nớc về bệnh sốt rét và tình hình sốt rét trên thế giới và Việt Nam (điểm vài nét), sơ lợc về tình hình KST SR kháng thuốc, cơ chế kháng, lịch sử phát triển thuốc SR và vaccin SR; về dợc lý và độc tính của dẫn xuất artemisinin (trong đó có DHA), PQP và thuốc phối hợp có chứa hai thành phần DHA-PQP và khả năng sản xuất DHA-PQP từ nguyên liệu chủ động trong nớc. Chơng 2. Đối tợng và phơng pháp nghiên cứu 2.1. Đối tợng nghiên cứu: - Bột DHA và PQP (Viện Hoá học sản xuất), đạt tiêu chuẩn cơ sở (phiếu kiểm nghiệm số 212/KĐ và 610-TCH, theo thứ tự). - Bột PQP (ký hiệu là PQPW) và CQ: của WHO cung cấp. - Viên nén phối hợp gồm 40 mg DHA và 320 mg PQP, XNDPTƯ I sản xuất, lô NC 010905 (tiêu chuẩn cơ sở 04 Z 1 - 14 - 04). - Thuốc đợc tạo hỗn dịch với dung môi gôm arabic 1%, liều lợng thuốc tính theo phơng pháp ngoại suy liều có hiệu quả tơng đơng giữa ngời và ĐVTN. - KST SR: Plasmodium falciparum chủng nhạy CQ (T996) và phân lập kháng CQ (K1), chủng P. berghei kháng CQ (K70). - ĐVTN: chuột nhắt trắng Mus musculus L. (chủng Swiss), 4-5 tuần tuổi, chuột cống trắng Rattus norvegicus B. còn non, 5-6 tuần tuổi, thỏ trởng thành Oryctolagus cunniculus L., 2 tháng tuổi, chó trởng thành 10-12 kg, ếch 200 30 g, đạt tiêu chuẩn thí nghiệm. 2.2. Phơng pháp nghiên cứu: 2.2.1. Nghiên cứu hiệu lực của DHA, PQP, PQPW và thuốc phối hợp DHA-PQP trên KST SR: 21 hởng của các hỗn dịch có nồng độ 16, 32 và 53,5 mg/100mL đến hoạt động của tim ếch cô lập. Kết quả đợc thể hiện ở bảng 3.38. Bảng 3.38. ảnh hởng của DHA-PQP đến tần số (lần / phút) và biên độ (cm) của tim ếch cô lập Các chỉ số nghiên cứu Nhịp tim (lần / phút) Biên độ (cm) Nhóm nghiên cứu Trớc nhỏ thuốc Sau nhỏ thuốc Trớc nhỏ thuốc Sau nhỏ thuốc 16 mg/100mL (n = 16) 21,33,8 19,73,9 1,70,5 1,90,5 P (sau-trớc) > 0,05 > 0,05 32 mg/100mL (n = 19) 24,94,0 24,23,8 1,30,5 1,60,6 P (sau-trớc) > 0,05 > 0,05 ở nồng độ 16 và 32 mg/100mL, sau khi nhỏ thuốc, tần số tim ếch giảm nhẹ, biên độ của tim ếch có tăng lên so với trớc khi nhỏ thuốc, nhng sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê (P > 0,05). ở nồng độ thuốc 53,5 mg/100mL, nhịp tim giảm rất rõ rệt, biên độ của tim ếch lúc đầu có tăng lên nhng sau đó giảm đi rất nhanh và tim ếch ngừng hoạt động ở kỳ tâm trơng. Chứng tỏ, DHA- PQP không ảnh hởng đến hoạt động của tim ếch cô lập ở nồng độ 16 và 32 mg/100mL. 3.8.3. ảnh hởng của thuốc phối hợp đến tim thỏ cô lập: Truyền liên tục hỗn dịch thuốc DHA-PQP qua hệ thống nuôi tim thỏ cô lập ở các nồng độ 0,001%, 0,002% và 0,003% trong 25 phút. Cứ 5 phút 1 lần, ghi các giá trị nhịp tim, lu lợng dịch thuốc qua tim và biên độ co bóp cơ tim. Các thời điểm theo dõi là: 0, 5, 20 với lô 100 mg/kg. Tuy nhiên, sự khác biệt này không có ý nghĩa thống kê giữa các lô uống thuốc so với lô chứng (P > 0,05). Thuốc phối hợp DHA-PQP ở hai liều 100 và 150 mg/kg/ngày đều làm giảm số lần lẩn tránh kích thích, tăng thời gian chịu kích thích và giảm thời gian lu giữ phản xạ của chuột ở các lô uống thuốc so với lô chứng, nhng sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê (P > 0,05). ở ngày 4, số lần lẩn tránh của lô uống DHA-PQP 150 mg/kg/ngày giảm có ý nghĩa thống kê so với lô chứng (P = 0,03); ở ngày 5, số lần lẩn tránh ở cả hai lô 100 và 150 mg/kg giảm có ý nghĩa thống kê so với lô chứng (P < 0,05) và thời gian tiềm tàng của lô (3) lớn hơn có ý nghĩa thống kê so với lô chứng (P = 0,0132), tuy nhiên ở những ngày sau sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê (P > 0,05). Các kết quả trên cho thấy, nhìn chung ở hai liều đã nghiên cứu, DHA-PQP không ảnh hởng đến hoạt động thần kinh trung ơng của chuột cống trắng. 3.8. ảnh hởng của DHA-PQP đến huyết áp và tim cô lập ĐVTN 3.8.1. ảnh hởng của DHA-PQP đến huyết áp chó: Theo dõi huyết áp và sự thay đổi tần số tim chó liên tục trong 6 giờ sau khi uống thuốc. Ghi huyết áp (động mạch đùi) và nhịp tim tại các thời điểm: trớc uống thuốc, 30 phút, 60 phút, 90 phút, 180 phút, 4 giờ, 5 giờ và 6 giờ sau khi uống thuốc qua máy Power lab 4/20 ADI Instruments. Kết quả cho thấy, thuốc phối hợp DHA-PQP ở cả hai liều 64 mg/kg (tơng đơng gấp 2 lần liều điều trị trên ngời) và 120 mg/kg đều không gây ảnh hởng có ý nghĩa thống kê đến huyết áp và nhịp tim chó tại các thời điểm sau khi uống thuốc so với trớc khi uống và giữa các lô uống thuốc so với lô chứng (P > 0,05). 3.8.2. ảnh hởng của thuốc phối hợp đến tim ếch cô lập: Từ hỗn dịch gốc DHA-PQP 160 mg/100mL, lần lợt thử ảnh 5 Thử nghiệm in vitro theo phơng pháp 48 giờ của Phuc Nguyen Dinh, thử nghiệm in vivo theo phơng pháp của Viện Sốt rét - KST - CT trung ơng và WHO. 2.2.2. Nghiên cứu độc tính cấp và bán trờng diễn của DHA-PQP: - Độc tính cấp: tiến hành trên chuột nhắt trắng, bằng đ ờng uống, theo phơng pháp cổ điển. Kết quả tính theo phơng pháp hồi quy tuyến tính trên chơng trình Probit. - Độc tính bán trờng diễn: tiến hành trên thỏ, dùng đờng uống, theo hớng dẫn của Bộ Y tế và OECD. 2.2.3. Nghiên cứu các độc tính đặc biệt của DHA-PQP trên ĐVTN: - ảnh hởng đến đột biến nhiễm sắc thể: tiến hành trên chuột nhắt trắng, nhiễm sắc thể tuỷ xơng và tinh hoàn đợc làm theo phơng pháp của Ford và Evans. - ảnh hởng đến quá trình sinh sản và phát triển của chuột nhắt trắng: dùng kỹ thuật liều chết trội của Bateman. - ảnh hởng đến sự phát triển các cơ quan sinh dục ở chuột cống trắng: dùng phơng pháp thử nghiệm chất hớng sinh dục của Segaloff. - ảnh hởng đến một số chức năng hoạt động thần kinh trung ơng của ĐVTN: phản xạ tìm thức ăn trong mê lộ của chuột nhắt trắng và phản xạ có điều kiện ở chuột cống trắng tiến hành theo phơng pháp của Bộ Y tế. - ảnh hởng đến huyết áp và tim cô lập của ĐVTN: ảnh hởng đến huyết áp chó theo phơng pháp của Đại học Y Hà Nội, đến tim ếch cô lập theo phơng pháp Strawb và tim thỏ cô lập theo phơng pháp của Langendorff. 2.2.4. Xử lý số liệu: - Xác định các giá trị IC 50 theo phần mềm probit của 6 Wernsdorfer, nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) theo tiêu chuẩn của Beal và Thaithong, tính mật độ KST theo WHO, liều độc (LD 50 ) tính trên chơng trình Probit của Michel Raymond. - Các kết quả nghiên cứu độc tính đợc biểu thị bằng trị số trung bình +/- độ lệch chuẩn (M SD). - Số liệu nghiên cứu đột biến nhiễm sắc thể đợc xử lý thống kê bằng chơng trình EPI-INFO, sử dụng test 2 . - Xử lý thống kê các số liệu nghiên cứu khác bằng chơng trình Excel (Microsoft XP), với cỡ mẫu nhỏ (< 30), sử dụng t-test Student và Fishers exact test để so sánh các số liệu trớc, trong, sau thử nghiệm và giữa lô dùng thuốc với lô chứng. Chơng 3. kết quả nghiên cứu 3.1. Hiệu lực trên KST SR in vitro và in vivo: 3.1.1. Hiệu lực in vitro: Đáp ứng in vitro của các chủng P. falciparum nhạy và kháng CQ (T996 và K1) với thuốc SR đợc thể hiện ở bảng 3.1. Bảng 3.1. Hiệu lực in vitro của các chủng P. falciparum với DHA, PQP, PQPW và phối hợp DHA-PQP IC 50 (nmol/L) MIC (nmol/L) Chủng KST DHA PQP PQPW DHA- PQP DHA PQP PQPW DHA- PQP T996 3,9 41,8 38,7 4,1 8,75 80 80 8,8 K1 2,4 46,2 42 2,5 4,37 80 80 4,4 Các giá trị IC 50 của PQP trên hai chủng T996 và K1 cao hơn của PQPW, nhng sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê, P > 0,05. DHA đơn thuần và thuốc phối hợp DHA-PQP có hiệu lực in vitro cao với P. falciparum, với IC 50 và MIC trên chủng nhạy CQ cao hơn so 19 Số ngày tập, số lần tập để phản xạ hình thành và bền vững và số lần tập để dập tắt phản xạ ở các lô uống DHA-PQP và lô chứng khác nhau không có ý nghĩa thống kê (P > 0,05). Thời gian chuột chạy tới đích ở các lô 2 và 4 tăng lên không có ý nghĩa thống kê so với lô chứng (P > 0,05). Còn ở lô 3, thời gian tới đích tăng lên có ý nghĩa thống kê so với lô chứng (P < 0,01). Chứng tỏ, thuốc phối hợp DHA-PQP có xu hớng ức chế hệ thần kinh trung ơng chuột nhắt trắng ở liều 240 mg/kg/ngày x 5 ngày, 1 đợt. 3.7.2. Phản xạ có điều kiện ở chuột cống trắng: Số ngày để tập phản xạ và thời gian lu giữ phản xạ đợc thể hiện ở bảng 3.32 và 3.34. Bảng 3.32. ảnh hởng của DHA-PQP đến thời gian hình thành phản xạ (ngày) Lô Chứng (1) (n = 13) 100 mg/kg (2) (n = 11) 150 mg/kg (3) (n = 11) Số ngày 6 3,9 7,9 4,2 7,8 4,7 Giá trị P P (1-2) > 0,05 P (2-3) > 0,05 P (1-3) > 0,05 Thời gian hình thành phản xạ của chuột ở các lô uống thuốc liều 100 và 150 mg/kg/ngày (uống liên tục trong suốt quá trình nghiên cứu) kéo dài hơn so với lô chứng, nhng sự khác biệt này không có ý nghĩa thống kê (P > 0,05). Bảng 3.34. ảnh hởng của DHA-PQP đến thời gian lu phản xạ Lô Chứng (1) (n = 13) 100 mg/kg (2) (n = 11) 150 mg/kg (3) (n = 11) Số ngày 2,5 1,9 2,2 1,8 1,7 1,1 Giá trị P P (1-2) > 0,05 P (2-3) > 0,05 P (1-3) > 0,05 ở cả hai lô uống thuốc, thời gian lu phản xạ đều giảm đi so với lô chứng, ở lô 150 mg/kg, số ngày để phản xạ tắt nhanh hơn so 18 thờng về hình thái đại thể các cơ quan. Trọng lợng của các cơ quan sinh dục (quy về 100 g súc vật) giữa các lô uống thuốc khác biệt không có ý nghĩa thống kê so với lô chứng. Kết quả trên cho thấy, DHA-PQP có hiện tợng tích luỹ khi dùng kéo dài và ở hai liều đã nghiên cứu DHA-PQP không ảnh hởng đến sự phát triển hệ sinh dục của chuột cống trắng. 3.7. ảnh hởng của DHA-PQP đến hoạt động thần kinh trung ơng của ĐVTN 3.7.1. Phản xạ tìm thức ăn trong mê lộ của chuột nhắt trắng: Các kết quả nghiên cứu đợc trình bày ở bảng 3.31. Bảng 3.31. ảnh hởng của thuốc phối hợp DHA-PQP đến phản xạ (PX) tìm thức ăn trong mê lộ của chuột nhắt trắng Các chỉ số nghiên cứu Lô nghiên cứu (n = 10) Số ngày tập để hình thành PX Số lần tập để hình thành PX Thời gian tới đích (giây) Số lần tập để tắt PX (1): Chứng 22,87,6 68,322,9 33,28,8 3,41,2 (2): DHA-PQP 120 mg/kg/ngày x 5 ngày (1 đợt) 24,28,5 72,525,4 39,210,1 3,80,9 (3): DHA-PQP 240 mg/kg/ngày x 5 ngày (1 đợt) 25,47,9 76,323,8 47,88,9 4,11,7 (4): DHA-PQP 120 mg/kg/ngày x 5 ngày (2 đợt) 21,14,6 63,313,8 35,15,5 4,01,1 P (2-1),(4-1) * P (3-1) ** > 0,05 > 0,05 * > 0,05 ** < 0,01 > 0,05 7 với trên chủng kháng CQ. Điều này là do giữa DHA và CQ có tơng quan nghịch, trong khi đó PQP và CQ có hiện tợng kháng chéo nên ở chủng nhạy CQ, IC 50 và MIC thấp hơn so với ở chủng kháng CQ. 3.1.2. Hiệu lực in vivo: ở nhóm chứng âm (chuột uống gôm arabic 1%), mật độ KST tăng dần, đến ngày 17 bắt đầu có chuột chết và 100% chuột chết vào ngày 28. Nhóm chứng dơng (điều trị bằng CQ tổng liều 490 mg/kg/7 ngày) không có tác dụng ức chế KST, diễn biến sự phát triển KST tơng đơng với chứng âm, KST tăng cao và chuột chết 100%. DHA đơn thuần chỉ có tác dụng ức chế KST phát triển, mật độ KST giảm thấp trong tuần đầu điều trị, sau đó tái phát 100% ở 3 tuần tiếp theo và chuột chết 100%. Nhóm đợc điều trị bằng PQP đơn thuần, với liều 510 mg/kg/3 ngày, chuột sạch KST hoàn toàn vào ngày 4, tái phát lại 20% với mật độ KST thấp và chuột sống 100% tại ngày 28. Còn ở nhóm chuột đợc điều trị bằng thuốc phối hợp DHA- PQP, tổng liều 584 mg/kg/3 ngày (64,89 mg/kg DHA và 519,11 mg/kg PQP), các chuột sạch KST hoàn toàn vào ngày 3, tái phát 10% ở ngày 14 với mật độ KST rất thấp (0,007% hồng cầu nhiễm) và 100 % chuột sống sót đến N28. Kết quả đợc thể hiện ở bảng 3.2. Bảng 3.2. Hiệu lực in vivo của thuốc SR với P. berghei kháng CQ Lô thử nghiệm (n = 10) % chuột chết Tỷ lệ tái phát (%) % chuột sống đến N28 Gôm arabic 1 % 100 - 0 CQ 490 mg/kg/7 ngày 100 - 0 DHA 74 mg/kg/3 ngày 100 100 0 PQP 510 mg/kg/3 ngày 0 20 100 DHA-PQP 584 mg/kg/3 ngày 0 10 100 8 DHA ở liều 74 mg/kg/3 ngày gây tái phát 100% số chuột, PQP (510 mg/kg/3 ngày) và thuốc phối hợp DHA-PQP (584 mg/kg/3 ngày) cho tỷ lệ điều trị khỏi tơng ứng là 80% và 90%. Liều lợng của DHA và PQP trong thuốc phối hợp tơng tự nh khi điều trị riêng rẽ từng thuốc, thậm chí liều DHA còn hơi thấp hơn so với DHA đơn thuần, cho thấy, khi dùng phối hợp DHA và PQP, hiệu quả điều trị đã tăng lên rõ rệt so với khi dùng riêng rẽ từng thành phần. Các kết quả trên cũng chứng tỏ, DHA-PQP do Việt Nam sản xuất có hiệu lực cao trên KST SR. 3.2. Độc tính cấp đờng uống của thuốc phối hợp DHA-PQP: Tiến hành trên chuột nhắt trắng, với liều đờng uống từ 1400 - 2800 mg/kg. Sau khi uống thuốc khoảng 30 phút, các chuột giảm hoạt động, nằm im, không ăn uống. Những chuột uống DHA-PQP liều cao có hiện tợng xù lông, co giật mạnh trớc khi chết, hoảng hốt và đặc biệt bị kích thích bởi tiếng động. Hầu hết chuột chết trong vòng 24 giờ đầu tiên. Một số chuột chết muộn, ở ngày thứ 3 sau khi uống thuốc. Toàn bộ số chuột chết ở các lô đợc mổ để quan sát đại thể các cơ quan tim, gan, thận, phổi, bàng quang, ruột: không phát hiện thấy bất thờng về hình thái đại thể hoặc xung huyết ở các cơ quan trên. Số chuột còn sống sót sau khi dùng thuốc đợc theo dõi tiếp cho đến hết ngày thứ 7 với các biểu hiện về hoạt động, ăn uống và bài tiết ở các ngày sau bình thờng. Liều cao nhất không gây chết chuột là LD 0 = 1400 mg/kg và liều thấp nhất gây chết 100% số chuột là LD 100 = 2800 mg/kg. LD 50 (DHA-PQP) = 2063,38 (1933,62 - 2191,31) mg/kg ở P = 0,05. Liều gây chết 50% số súc vật thí nghiệm của DHA-PQP trên chuột nhắt trắng (bằng đờng uống) là LD 50 = 2063,38 mg/kg, với giới hạn dới là 1933,62 mg/kg và giới hạn trên là 2191,31 mg/kg. 17 3.5. ảnh hởng của DHA-PQP đến quá trình sinh sản và phát triển của chuột nhắt trắng: Thử nghiệm đợc tiến hành trên 3 thế hệ chuột nhắt trắng: P (thế hệ cha mẹ), F1 và F2; với các lô thử thuốc gồm: chuột cái uống thuốc ghép với chuột đực không uống thuốc, cả chuột cái và đực uống thuốc, và chuột cái không uống thuốc ghép với chuột đực uống thuốc, đợc so với lô chứng. Kết quả cho thấy, ở cả 3 thế hệ, tỷ lệ thụ thai, số thai của mỗi chuột mẹ, số chuột con ở mỗi lứa đẻ, trọng lợng trung bình của chuột con và số ngày cần thiết để chuột con sinh ra đạt trọng lợng 20g ở các lô uống thuốc so với lô chứng khác nhau không có ý nghĩa thống kê (các giá trị P > 0,05). Không phát hiện thấy thai chết sớm, thai chết muộn, thai bị dị tật hay dị tật bẩm sinh ở các chuột con đợc sinh ra. Chứng tỏ, thuốc phối hợp DHA-PQP ở liều 120 mg (13,33 mg DHA và 106,67 mg PQP) /kg/ngày ì 5 ngày liên tiếp (tơng đơng liều dùng điều trị trên ngời) không gây đột biến gen ở chuột nhắt trắng bằng kỹ thuật liều gây chết trội. 3.6. ảnh hởng của DHA-PQP trên sự phát triển cơ quan sinh dục của chuột cống trắng: ở liều cao, 400 mg (44,44 mg DHA và 355,56 mg PQP) /kg/ngày, toàn bộ 12 chuột cái và 10 chuột đực lần lợt chết sau khi có 7 - 13 ngày liên tiếp uống DHA-PQP. Do đó, liều lợng thuốc ở lô tiếp theo giảm đi còn 300 mg (33,33 mg DHA và 266,67 mg PQP) /kg/ngày ì 12 ngày đầu + 200 mg (22,22 mg DHA và 177,78 mg PQP) /kg/ngày ì 16 ngày sau và lô 100 mg/kg/ngày ì 28 ngày. Sau 28 ngày uống thuốc liên tục, phân lập các tổ chức tơi, quan sát đại thể các cơ quan sinh dục chuột cống cái (buồng trứng, tử cung và vòi trứng) và chuột cống đực (tinh hoàn, tuyến tiền liệt, túi tinh và cơ nâng hậu môn) ở cả hai lô uống thuốc, nhận thấy không có bất [...]... DHA-PQP làm tăng tần 3.3 Độc tính bán trờng diễn của thuốc phối hợp DHA-PQP suất rối loạn cấu trúc NST tuỷ xơng của lô dùng thuốc so với lô 3.3.1 ảnh hởng đến thể trạng thỏ: Sau 14 và 28 ngày uống thuốc liên tục, thỏ ở tất cả các lô vẫn chứng (bảng 3.23, hình 3.14 và 3.15) Bảng 3.23 Rối loạn cấu trúc NST tế bào tuỷ xơng chuột nhắt trắng qua các ngày nghiên cứu đợc thể hiện ở bảng 3.4 Các chỉ số nghiên. .. uống thuốc liên tục, nhịp tim và các chỉ số sóng >0,05 >0,05 điện tim thỏ (sóng P, khoảng PQ, phức bộ QRS, sóng T, khoảng QT) ở ngày N14 và N29 của các lô uống thuốc phối hợp DHA-PQP liều 64 và 100 mg/kg/ngày ì 28 ngày thay đổi không có ý nghĩa thống kê so với N0 (trớc uống thuốc) và so với lô chứng tại cùng thời điểm P ( 1-3 ),( 2-3 ) Hàm lợng AST trong huyết thanh thỏ tại N14 và N29 ở các nghiên cứu, ... 0,05 N29) tế bào gan và cầu thận có gặp ở cả hai lô dùng thuốc và lô chứng >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 4,96 P ( 1-2 ), trừ hiện tợng xung huyết nhẹ tĩnh mạch trung tâm và xoang mạch ở 9,72 3: DHA-PQP 100 P(N 0- 14,59 2: DHA-PQP 64 P(N0N14) Lô > 0,05 Chứng tỏ DHA-PQP không gây độc và không ảnh hởng đến chức năng gan và thận thỏ ở hai liều 64 và 100 mg/kg/ngày ì 28 ngày 3.3.6 ảnh hởng của DHA-PQP đến điện tim... quả trên chứng tỏ, thỏ ở các lô đều đợc nuôi dỡng, chăm sóc tốt và thuốc phối hợp DHA-PQP ở hai liều 64 mg (7,11 mg DHA và 56,89 mg PQP, tơng đơng liều dùng điều trị trên ngời) và 100 mg (11,11 mg DHA và 88,89 mg PQP) /kg/ngày ì 28 ngày Hình 3.14 Mảnh không tâm ở tế Hình 3.15 Trao đổi NStử ở tế bào bào tuỷ xơng chuột uống thuốc tuỷ xơng chuột uống DHA-PQP không ảnh hởng tới thể trạng và sức lớn của. .. > 0,05) Các kết quả trên chứng tỏ, DHA-PQP ở hai liều 64 và 100 mg/kg/ngày ì 28 ngày liên tục không ảnh hởng đến chức năng tạo máu của thỏ thực nghiệm 3.3.5 ảnh hởng của DHA-PQP đến hình thái vi thể gan và thận thỏ: Quan sát đại thể các cơ quan của 50% số thỏ đợc mổ ở N29 và 50% số thỏ còn lại đợc mổ sau khi ngừng thuốc 15 ngày cho thấy, không có bất thờng về hình thái đại thể của các cơ quan: tim,... thể hiện ở bảng 3.4 Các chỉ số nghiên cứu Lô nghiên cứu Số tế bào đợc đánh % rối loạn cấu trúc Kiểu NStử giá 1: uống DHA- 962 2,352,94 % tế bào Kiểu NST có rối loạn cụm NST Bảng 3.4 ảnh hởng của phối hợp DHA-PQP đến trọng lợng thỏ (kg, M SD) Lô 0,910,43 0,220,51 0 < 0,02 P ( 1-2 ) N14 N29 < 0,02 > 0,05 ở lô uống thuốc DHA-PQP liều 360 mg/kg/ngày ì 5 ngày, P (N 0- P (N0N14) 1: chứng 986 N0 1,051,43 0,050,20... N29 (P > 0,05) Riêng ở lô uống DHA-PQP 100 mg/kg, hàm lợng hemoglobin, số 3.3.3 ảnh hởng của thuốc DHA-PQP đến chức năng thận thỏ: lợng hồng cầu và % bạch cầu mono cao hơn có ý nghĩa thống kê so Đánh giá ảnh hởng của DHA-PQP đến chức năng thận thông qua định lợng hàm lợng creatinin huyết thanh và nghiên cứu sự biến đổi hình thái vi thể mô thận trớc và sau khi dùng thuốc Kết với lô chứng ở N14, nhng... DHA-PQP 64 P(N0N14) Lô P ( 1-2 ),( 2-3 ) P ( 1-3 ) ** * > 0,05 * ** 0,05) ở cầu, bạch cầu, tỷ lệ % bạch cầu trung tính và. .. DHA-PQP 100 4775 4930 4761 mg/kg (n = 14) 573,8 521,8 675,0 mg/kg (n = 14) P ( 1-2 ),( 2-3 ) * > 0,05 > 0,05 > 0,05 3: DHA-PQP 100 P ( 1-3 ) ** * ** Lô N0 N14 N29 P (N 0- P (N0N14) > 0,05 > 0,05 > 0,05 < 0,05 Số lợng hồng cầu thỏ ở các lô uống thuốc tại ngày N14 và 1: chứng (n = 12) 2: DHA-PQP 64 mg/kg (n = 14) P ( 1-2 ),( 1-3 ),( 2-3 ) 2,42 2,58 3,00 0,67 > 0,05 0,91 3,13 2,96 0,76 1,26 2,84 3,62 0,68 1,04... trung tính và lympho, lợng lô uống DHA-PQP 100 mg/kg, hàm lợng protein tăng có ý nghĩa hematocrit, số lợng tiểu cầu và thể tích trung bình hồng cầu của các thống kê ở N14 và N29 so với ngày N0, và so với lô chứng ở N14 (P lô uống thuốc DHA-PQP ở N14 và N29 thay đổi không có ý nghĩa < 0,05 và P < 0,01); nhng sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê ở thống kê so với N0 và với lô chứng tại cùng thời điểm . của thuốc, đề tài Nghiên cứu tác dụng trên ký sinh trùng sốt rét và độc tính trên thực nghiệm của thuốc sốt rét phối hợp dihydroartemisinin - piperaquin do Việt Nam sản xuất đợc tiến hành. án - Đã nghiên cứu hiệu lực và độc tính trên thực nghiệm của thuốc sốt rét phối hợp DHA-PQP, với nguyên liệu đợc sản xuất tại Việt Nam. - Chứng minh trên thực nghiệm, thuốc phối hợp DHA-PQP. vitro và in vivo trên chuột nhiễm KST SR) của thuốc phối hợp DHA-PQP do Việt Nam sản xuất. 2.2. Xác định độc tính cấp và độc tính bán trờng diễn của thuốc phối hợp DHA-PQP trên động vật thực nghiệm.