NGHIÊN cứu tác DỤNG điều CHỈNH rối LOẠN LIPID máu và GIẢM xơ vữa MẠCH máu của BBT TRÊN THỰC NGHIỆM

1 NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG ĐIỀU CHỈNH RỐI LOẠN LIPID MÁU VÀ GIẢM XƠ VỮA MẠCH MÁU CỦA BBT TRÊN THỰC NGHIỆM Vũ Thị Thuận (1), Trương Việt Bình (1), Mai Phương Thanh (2), Nguyễn Trọng Thông (2), Phạm Thị Vân Anh (2) (1): Học Viện Y Dược học Cổ truyền Việt Nam (2): Trường Đại Học Y Hà Nội I. ĐẶT VẤN ĐỀ Hội chứng rối loạn lipid máu (RLLPM) được coi là một nguy cơ quan trọng cho sự hình thành, phát triển của bệnh xơ vữa động mạch (XVĐM). Hiện nay, các thuốc của y học hiện đại điều trị có hiệu quả tốt, nhưng lại gây ra nhiều tác dụng không mong muốn và còn nhiều chống chỉ định [7]. Vì thế một trong những xu hướng hiện nay trong điều trị hội chứng RLLPM là sử dụng cây con thuốc có nguồn gốc tự nhiên, vừa mang lại hiệu quả điều trị vừa hạn chế được các tác dụng không mong muốn cho người bệnh [5]. Bán hạ bạch truật thiên ma thang (gọi tắt là BBT) là bài thuốc cổ phương được sử dụng nhiều năm nay để điều trị chứng đàm thấp có kết quả tốt tại một số bệnh viện song chưa có những nghiên cứu và đánh giá một cách khoa học trên thực nghiệm. Chúng tôi tiến hành đề tài nghiên cứu này với 2 mục tiêu: 1. Đánh giá tác dụng điều chỉnh RLLPM của bài thuốc BBT trên mô hình gây tăng cholesterol máu ngoại sinh và nội sinh; 2. Đánh giá tác dụng chống XVĐM của bài thuốc BBT trên mô hình gây tăng cholesterol máu ngoại sinh II. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Đối tượng nghiên cứu: - Thuốc nghiên cứu: Chế phẩm thuốc thử BBT dạng cao lỏng sản xuất tại Khoa Dược, Học Viện Y Dược học Cổ truyền Việt Nam Bảng 1. Công thức bài thuốc nghiên cứu STT Tên vị thuốc Tên khoa học Liều lượng 1 Bán hạ bắc Pinellia ternata 06g 2 Cam thảo Glycymhiza uralensis 02g 3 Bạch linh Poria cocos 04g 4 Trần bì Citrus deliciosa Tenore 04g 5 Bạch truật Atractylodes macrocephala 12g 6 Thiên ma Gastrodia Elata Blume 04g 7 Sinh khương Zingiber oppcinale Rose 1 lát 8 Đại táo Zizyphus sativa Mill 2 quả - Động vật nghiên cứu: + Thỏ chủng Newzealand white, cả hai giống, khoẻ mạnh, lông trắng, trọng lượng 1,8 – 2,5 kg do Trung tâm Nghiên cứu Dê và Thỏ Sơn Tây cung cấp. 2 + Chuột nhắt trắng chủng Swiss, khoẻ mạnh, cả hai giống trọng lượng trung bình 20 ± 2g do Viện Vệ sinh dịch tễ trung ương cung cấp. Động vật thực nghiệm được nuôi 3 ngày trước khi nghiên cứu và trong suốt thời gian nghiên cứu bằng thức ăn chuẩn riêng cho từng loại. 2.2. Máy móc và hóa chất nghiên cứu - Hóa chất phục vụ nghiên cứu + Cholesterol tinh khiết (Merck – Đức) + Dầu lạc (Công ty Cái Lân – Việt Nam) + Atorvastatin viên nén 20 mg (Ấn Độ) + Kit định lượng các enzym và chất chuyển hoá trong máu: cholesterol toàn phần, TG, LDL-C, HDL-C của hãng Hospitex Diagnostics (Italy) và hãng DIALAB GmbH (Áo). + Các hoá chất xét nghiệm và làm tiêu bản mô bệnh học - Máy móc phục vụ nghiên cứu + Máy Screen master của hãng Hospitex Diagnostics (Italy) + Kính hiển vi điện tử Nhật 2.3. Phương pháp nghiên cứu * Tác dụng điều chỉnh RLLPM và giảm XVĐM trên mô hình gây tăng cholesterol máu ngoại sinh và gây XVĐM Áp dụng mô hình theo Nassiri và cộng sự (2009) [4]. Thỏ được chia thành 5 lô, mỗi lô 10 con với tỉ lệ đực/cái như nhau ở mỗi lô, các lô được uống thuốc trong 8 tuần như sau: Lô 1 (lô chứng sinh học): uống nước cất. Lô 2 (lô mô hình): uống hỗn hợp dầu cholesterol liều 0,5g/kg, 1mL/kg + uống nước cất. Lô 3 (lô uống atorvastatin): uống hỗn hợp dầu cholesterol liều 0,5g/kg, 1mL/kg + uống atorvastatin 5 mg/kg. Lô 4 (lô uống BBT liều thấp): uống hỗn hợp dầu cholesterol liều 0,5 g/kg + uống thuốc thử liều BBT liều 3g/kg. Lô 5 (lô uống BBT liều cao): uống hỗn hợp dầu cholesterol liều 0,5 g/kg + uống thuốc thử BBT liều 6g/kg Tiến hành cân kiểm tra trọng lượng thỏ ở tất cả các lô tại thời điểm trước, sau thí nghiệm hàng tuần. Vào ngày đầu tiên, sau 4 tuần, 8 tuần của thí nghiệm, thỏ trong các lô cho nhịn ăn qua đêm. Lấy máu ngoại vi và tiến hành định lượng cholesterol toàn phần (TC), TG, HDL-C, 3 LDL-C. Tại thời điểm sau 8 tuần uống thuốc, giết ngẫu nhiên 30% số động vật ở tất cả các lô để xét nghiệm đại thể, vi thể của động mạch chủ (ĐMC) đoạn ngay trước khi đổ vào động mạch vành và tình trạng nhiễm mỡ của gan thỏ. * Tác dụng điều chỉnh RLLPM trên mô hình gây tăng lipid máu nội sinh Sử dụng và điều chỉnh mô hình gây tăng lipid máu nội sinh bằng Poloxamer 407 (P-407) theo Millar và cộng sự [3]. Chuột nhắt trắng được chia làm 6 lô, mỗi lô 12 con. Lô I (lô chứng sinh học): Tiêm nước muối sinh lý màng bụng với thể tích 0,1 mL/10g thể trọng chuột, sau đó uống nước cất. Lô II (lô mô hình – P-407): Tiêm màng bụng dung dịch P-407 5% liều 250 mg/kg (0,1 mL/10g), ngay sau đó uống nước cất. Lô III (lô uống atorvastatin): Tiêm màng bụng dung dịch P-407 5% liều 250 mg/kg (0,1 mL/10g), ngay sau đó uống atorvastatin liều 10 mg/kg. Lô IV (lô uống BBT liều tương đương lâm sàng): Tiêm màng bụng dung dịch P-407 5% liều 250 mg/kg (0,1 mL/10g), ngay sau đó uống BBT liều 10 g/kg. Lô V (lô uống BBT liều gấp 2 lần liều lâm sàng): Tiêm màng bụng dung dịch P-407 5% liều 250 mg/kg (0,1 mL/10g), ngay sau đó uống BBT liều 20 g/kg. Lô VI (lô uống BBT liều gấp 5 lần liều lâm sàng): Tiêm màng bụng dung dịch P-407 5% liều 250 mg/kg (0,1 mL/10g), ngay sau đó uống BBT liều 50 g/kg. Chuột được uống nước cất và thuốc thử 5 ngày liên tục: 4 ngày trước khi tiêm màng bụng dung dịch P-407 5% liều 250 mg/kg và 1 ngày sau tiêm. Ngày cuối cùng sau 24 giờ kể từ khi được tiêm P-407, tất cả các chuột bị nhịn đói qua đêm, lấy máu động mạch cảnh làm xét nghiệm định lượng TG, TC, LDL-C, HDL-C 2.4. Xử lý số liệu: Số liệu được nhập và xử lý bằng phương pháp và thuật toán thống kê y sinh học trên phần mềm SPSS 16. Số liệu được biểu diễn dưới dạng X ± SD. Kiểm định các giá trị bằng t-test Student hoặc test trước-sau (Avant – Apres). Sự khác biệt có ý nghĩa thống kê khi p < 0,05. Chú thích: *: Khác biệt so với chứng sinh học với p < 0,05 ***: Khác biệt so với chứng sinh học với p < 0,001 III. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 1. Tác dụng điều chỉnh RLLPM và giảm XVĐM trên mô hình gây tăng cholesterol máu ngoại sinh và gây XVĐM Bảng 2. Mô hình rối loạn lipid máu bằng hỗn hợp dầu cholesterol 4 Chỉ số lipid Chứng sinh học (n = 10) ( X ± SD, mg/dL) Mô hình (n = 10) ( X ± SD, mg/dL) Trước Sau 4 tuần Sau 8 tuần Trước Sau 4 tuần Sau 8 tuần TG 128,95 ± 10,22 122,98 ± 13,47 137,49 ± 32,32 131,52 ± 27,66 182,76 ± 52,37* 242,54 ± 74,14* TC 82,22 ± 11,22 81,06 ± 12,07 81,06 ± 8,73 84,53 ± 11,28 386,39 ± 26,40*** 400,86 ± 36,08*** HDL-c 29,31 ± 4,05 30,38 ± 3,37 29,54 ± 2,97 29,85 ± 3,38 161,92 ± 39,40*** 193,19 ± 22,33*** LDL-c 27,12 ± 11,58 26,08 ± 11,22 24,02 ± 6,91 28,38 ± 12,65 187,91 ± 42,04*** 159,16 ± 22,29*** Kết quả cho thấy uống hỗn hợp dầu cholesterol sau 4 tuần và 8 tuần có tác dụng gây rối loạn lipid máu rõ rệt trên thỏ. * Tác dụng điều chỉnh RLLPM trên mô hình gây tăng cholesterol máu ngoại sinh ở thỏ Biểu đồ 1. Tác dụng của BBT lên nồng độ lipid máu ở mô hình ngoại sinh sau 4 tuần Từ biểu đồ 1 cho thấy tình trạng RLLPM hầu như chưa có tiến triển sau 4 tuần uống thuốc liên tục ở cả lô uống atorvastatin và 2 lô uống BBT. 5 Biểu đồ 2. Tác dụng của BBT lên nồng độ lipid máu ở mô hình ngoại sinh sau 8 tuần Từ số liệu ở biểu đồ 2 cho thấy: Nồng độ TC và LDL-c ở lô uống atorvastatin giảm có ý nghĩa thống kê so với lô mô hình với p < 0,001, ở 2 lô uống BBT giảm có ý nghĩa thống kê với p < 0,05. Nồng độ TG đã có xu hướng giảm, nồng độ HDL-c cũng đã có xu hướng tăng, tuy nhiên chưa có sự khác biệt rõ rệt ở lô uống atorvastatin và 2 lô uống BBT so với lô mô hình. Không có sự khác biệt giữa nồng độ TG, TC, HDL-C, LDL-C ở 2 lô uống BBT so với lô uống atorvastatin 5 mg/kg. Không có sự khác biệt giữa nồng độ TG, TC, HDL-C, LDL-C ở lô uống BBT liều thấp (3g/kg) và liều cao (6g/kg) * Tác dụng giảm XVĐM trên mô hình gây tăng cholesterol máu ngoại sinh Bảng 3. Hình ảnh đại thể và vi thể của động mạch chủ Lô Động mạch chủ Gan Đại thể Vi thể Đại thể Vi thể Lô chứng Lòng mạch nhẵn, không có mảng xơ vữa Bình thường Màu hồng, bề mặt nhẵn Tế bào gan bình thường Lô mô hình + Xung quanh tim, phổi, mạch máu có nhiều mỡ + Lòng ĐMC có nhiều mảng xơ vữa dọc theo chiều dài ĐM ĐMC mảng vữa mỡ dày mức độ vừa đến nặng, có hoại tử, vôi hóa Gan nhiễm mỡ nặng, bạc màu Gan nhiễm mỡ nặng Lô uống atorvastatin + Có ít mỡ xung quanh tim + Lòng ĐMC có mảng xơ vữa, quai nhiều hơn thân ĐMC mảng vữa mỡ dày mức độ vừa Gan nhiễm mỡ mức độ vừa Gan nhiễm mỡ vừa đến nặng Lô uống BBT 3g/kg + Có mỡ xung quanh tim, quai ĐMC ĐMC mảng vữa mỡ dày mức độ Gan nhiễm mỡ vừa, bạc Gan nhiễm mỡ nặng 6 + Lòng ĐMC có nhiều mảng xơ vữa ở thân và quai nhẹ đến vừa màu Lô uống BBT 6g/kg + Có mỡ xung quanh tim, quai ĐMC + Lòng ĐMC có nhiều mảng xơ vữa, quai nhiều hơn thân. ĐMC mảng vữa mỡ mỏng Gan nhiễm mỡ vừa, bạc màu Gan nhiễm mỡ nặng Từ kết quả ở bảng 3 cho thấy: tình trạng XVĐM và gan nhiễm mỡ nặng ở tất cả các lô thỏ uống hỗn hợp dầu cholesterol. Mức độ XVĐM ở các lô uống atorvastatin, BBT liều thấp và BBT liều cao có xu hướng giảm hơn so với lô mô hình, đặc biệt ở lô uống BBT liều cao. Tình trạng nhiễm mỡ của gan chưa có tiến triển tốt sau 8 tuần ở cả 3 lô uống thuốc. 2. Tác dụng điều chỉnh RLLPM trên mô hình gây tăng cholesterol máu nội sinh Bảng 3. Mô hình rối loạn lipid máu bằng Poloxamer 407 (P-407) Chỉ số lipid Chứng sinh học (n = 12) ( X ± SD, mmol/L) Mô hình (n = 12) ( X ± SD, mmol/L) TG 1,4 ± 0,2 7,2 ± 1,3*** TC 2,8 ± 0,3 7,7 ± 0,5*** HDL-C 0,4 ± 0,1 1,5 ± 0,3*** LDL-C 1,8 ± 0,3 2,9 ± 1,0*** Kết quả cho thấy tiêm màng bụng dung dịch P-407 5% liều 250 mg/kg (0,1 mL/10g) có tác dụng gây RLLPM rõ rệt trên chuột nhắt. Biểu đồ 3. Tác dụng của BBT lên nồng độ lipid máu ở mô hình nội sinh Từ số liệu ở biểu đồ 3 cho thấy: Atorvastatin liều 10 mg/kg làm giảm rõ rệt nồng độ TC và LDL-C so với lô mô hình, sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (p < 0,001). BBT liều 10 g/kg và liều 20 g/kg chưa làm thay đổi nhiều tất cả các trị số so với lô mô hình. BBT liều 50 g/kg làm 7 giảm có ý nghĩa thống kê nồng độ TC so với lô mô hình (p < 0,05), nồng độ LDL-c có xu hướng giảm nhưng sự khác biệt chưa có ý nghĩa thống kê. Không có sự khác biệt về cả 4 chỉ số TC, TG, LDL-c, HDL-c giữa lô uống atorvastatin liều 10 mg/kg và 3 lô uống BBT. VI. BÀN LUẬN Tác dụng điều chỉnh rối loạn lipid máu và giảm XVĐM trên mô hình ngoại sinh Trên mô hình ngoại sinh, tác dụng của các thuốc bắt đầu xuất hiện rõ hơn sau 8 tuần uống thuốc liên tục, đặc biệt là atorvastatin với mức giảm nồng độ TC và LDL-c rất rõ rệt so với lô mô hình với p < 0,001. Điều này phù hợp với cơ chế tác dụng của atorvastatin là ức chế cạnh tranh với HMG-CoA-reductase, làm giảm tổng hợp cholesterol. Tương tự atorvastatin, BBT chủ yếu ảnh hưởng đến nồng độ TC và LDL-c, mức độ giảm của 2 chỉ số này là có ý nghĩa thống kê so với lô mô hình với p < 0,05. Hình ảnh vi thể ĐMC cho thấy hiệu quả rõ ràng hơn của BBT đối với RLLPM, đặc biệt ở lô uống BBT liều cao với hình ảnh mảng vữa mỡ mỏng hơn so với các lô nghiên cứu khác. Đã có nhiều tài liệu nói đến vai trò có lợi trên những bệnh nhân béo phì những thành phần của BBT, đặc biệt là bán hạ, bạch linh, bạch truật [1][2][6]. Tác dụng điều chỉnh RLLPM trên mô hình nội sinh Trên mô hình nội sinh, atorvastatin biểu hiện tác dụng làm giảm rõ rệt nồng độ TC (giảm 16,89%) và nồng độ LDL-c (giảm tới 41,38%) so với lô mô hình với p < 0,001. Ở các lô uống BBT mới chỉ quan sát thấy mức độ giảm nồng độ TC có ý nghĩa thống kê so với lô mô hình ở lô uống BBT liều 50 g/kg (liều gấp 5 lần liều lâm sàng). Kết quả này có thể do tác dụng của BBT xuất hiện muộn hơn atorvastatin, cần kéo dài thêm thời gian nghiên cứu để đánh giá đầy đủ hơn tác dụng của BBT. V. KẾT LUẬN: 1. Tác dụng điều chỉnh RLLPM - BBT liều 3 g/kg/ngày và 6 g/kg/ngày sau 8 tuần uống liên tục trên thỏ, có tác dụng điều chỉnh RLLPM: làm giảm nồng độ TC và LDL-c rõ rệt. - BBT liều 50 g/kg uống 5 ngày trên chuột nhắt trắng có tác dụng hạn chế sự RLLPM gây ra do tiêm màng bụng Poloxamer 407, biểu hiện bằng sự giảm nồng độ TC rõ rệt. 2. Tác dụng hạn chế hình thành mảng xơ vữa và tình trạng nhiễm mỡ gan BBT liều 6 g/kg/ngày có tác dụng làm giảm sự hình thành mảng XVĐM trên động mạch chủ của thỏ và hạn chế một phần tình trạng nhiễm mỡ gan. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Dr. Philomena George and O.S.Nimmi (2011), “Cent percent safe centum plants for antiobesity”, International Journal of Innovative Technology & Creative Engineering, 1(3) 8 2. Jiang Linjie,et al (2011), “The Preventive Effects of Atractylodes Macrocephala Koidz on the Regulation of Serum Lipid Levels and Protection of Liver in Rat”, Journal of Mathematical Medicine, 2011-04 3. John S. Millar, Debra A. Cromley, Mary G. McCoy, Daniel J. Rader, and Jeffrey T. Billheimer (2005), “Determining hepatic triglyceride production in mice: comparison of poloxamer 407 with Triton WR-1339”, Journal of Lipid Research, 46: 2023 – 2028. 4. Marjan NASSIRI-ASL et al (2009), “Effects of Urtica dioica extract on lipid profile in hypercholesterolemic rats”, Journal of Chinese Integrative Medicine, 7 (5): 428 – 433 5. Peter R. Seidl (2002), “Pharmaceuticals from natural products: current trends”, Annals of the Brazilian Academy of Sciences, 74(1): 145 – 150 6. Yoo-Jeong KIM, Young-Oh SHIN, Young-Wan HA, Sanghyun LEE, Jae-Keun OH, and Yeong Shik KIM (2006), “Anti-obesity Effect of Pinellia ternata Extract in Zucker Rats”, Biol. Pharm. Bull, 29(6): 1278—1281 7. Nguyễn Trọng Thông (2010), “Thuốc điều chỉnh rối loạn lipoprotein máu”, Dược lý học tập 2, Nhà xuất bản y học Hà Nội, tr. 176 – 185 TÓM TẮT Nghiên cứu tác dụng điều chỉnh rối loạn lipid máu và giảm xơ vữa mạch máu của BBT trên thực nghiệm “Bán hạ bạch truật thiên ma thang” (BBT) được biết đến là bài thuốc có hiệu quả trong điều trị chứng đàm thấp, một trong những nguyên nhân gây béo phì theo y học cổ truyền. Mục tiêu: đánh giá tác dụng điều chỉnh RLLPM của BBT trên mô hình gây tăng lipid máu nội sinh và ngoại sinh và đánh giá tác dụng chống XVĐM của BBT trên mô hình gây tăng lipid máu ngoại sinh Phương pháp nghiên cứu: - Mô hình: sử dụng hỗn hợp dầu cholesterol theo đường uống gây tăng lipid máu ngoại sinh và Poloxamer 470 gây tăng lipid máu nội sinh - Động vật nghiên cứu: thỏ chủng Newzealand white và chuột nhắt trắng chủng Swiss - Thuốc nghiên cứu: + Mô hình ngoại sinh: atorvastatin 5mg/kg trọng lượng thỏ, BBT 3g/kg trọng lượng thỏ và BBT 6g/kg trọng lượng thỏ, uống thuốc liên tục trong 8 tuần + Mô hình nội sinh: P-470 tiêm màng bụng liều 250mg/kg trọng lượng chuột; atorvastatin 10mg/kg trọng lượng chuột, BBT 10g/kg, 20g/kg và 50g/kg trọng lượng chuột, uống thuốc liên tục trong 5 ngày Kết quả nghiên cứu: trên mô hình ngoại sinh: BBT có tác dụng điều chỉnh RLLPM, thể hiện bằng mức giảm nồng độ TC và LDL-c và có tác dụng giảm sự hình thành XVĐM (p < 0,05) 9 Kết luận: BBT có tác dụng điều chỉnh RLLPM SUMMARY Studying the effect of BBT on the regulation of serum lipid levels and the formation of atherosclerosis on experimental animals “Bán hạ bạch truật thiên ma thang” (BBT) is known as the effect in removing the dampness-phlegm, one of the causes of obesity in traditional medicine. Object: to investigate the effect of BBT on the regulation of serum lipid levels on the experimental models of exogenous hyperlipidemia and endogenous hyperlipidemia and to investigate the effect of BBT in preventing the formation of atherosclerosis induced exogenous hyperlipidemia model on rabbits. Methods: - Model: oil-cholesterol mixture orally induced exogenous hyperlipidemia and Poloxamer 470 induced endogenous hyperlipidemia - Animal used: Newzealand white rabbit and Swiss mice - Dose: + Exogenous hyperlipidemia: atorvastatin 5mg/kg body weight, BBT 3g/kg and 6g/kg body weight, oral route, during 8 weeks + Endogenous hyperlipidemia: P-470 250mg/kg body weight, i.p route; atorvastatin 10mg/kg body weight, BBT 10 g/kg, 20g/kg and 50g/kg body weight, oral route, during 5 days Results: Exogenous hyperlipidemia: BBT has the potential effect on adjustment in dyslipidemia by decreasing TC and LDL-c levels and preventing the formation of atherosclerosis (p < 0,05) Conclusion: BBT was found to be potential effective agents on adjustment in dyslipidemia