ẢNH HƯỞNG CỦA CÁC ĐIỀU KIỆN LÊN MEN LÊN KHẢ NĂNG SINH CORDYCEPIN TỪ Cordyceps militaris Nguyễn Thị Thanh Mai 1, Trần Bảo Trâm 1, Ngô Thị Hoa 1, Trần Thị Hoài Hương 2, Trương Thị Chiên 1 1 Trung tâm Si[.]
ẢNH HƯỞNG CỦA CÁC ĐIỀU KIỆN LÊN MEN LÊN KHẢ NĂNG SINH CORDYCEPIN TỪ Cordyceps militaris Nguyễn Thị Thanh Mai 1, Trần Bảo Trâm 1, Ngô Thị Hoa 1, Trần Thị Hoài Hương 2, Trương Thị Chiên Trung tâm Sinh học Thực nghiệm Viện Ứng dụng Cơng nghệ TĨM TẮT Cordyceps militaris loại nấm dược liệu chứa nhiều hoạt chất sinh học quý cordycepin, adenosine, manitol, sterols exopolysaccharide Mục tiêu báo mong muốn tối ưu hóa điều kiện lên men C militaris H1 môi trường lỏng nhằm tạo hàm lượng cordycepin cao Ảnh hưởng điều kiện lên men lên khả sinh hoạt chất cordycepin chủng Cordyceps militaris H1 sử dụng phương pháp lên men chìm tiến hành với mơi trường MT1; nguồn cacbon glucose: 40 g/L; nguồn nitơ: pepton % Nấm C mliltaris H1 lên men với tỷ lệ tiếp giống %(v/v); nhiệt độ lên men thích hợp 25oC; pH môi trường ban đầu 6,0; thời gian nuôi cấy 15 ngày tốc độ lắc 150 vòng/phút cho hàm lượng sinh khối C mliltaris H1 khô cao đạt 16.7 g/L hàm lượng cordycepin đạt 475.2 mg/L Từ khóa: cordycepin, Cordyceps militaris, đơng trùng hạ thảo, lên men chìm MỞ ĐẦU Cordyceps militaris (C militaris) loài nấm ký sinh ấu trùng lồi trùng thuộc chi Thitarodes biết đến chứa nhiều hoạt chất sinh học quý cordycepin, adenosine, manitol, sterols exopolysaccharide với tác dụng hỗ trợ, điều trị, kìm hãm phát triển tế bào ung thư máu, ung thư phổi, ung thư vú, rối loạn chức gan, chống lão hố (Kim et al.,2006) Ngồi ra, nấm Đơng trùng Hạ thảo cịn có tác dụng kìm hãm oxy hoá lipid, lipoprotein lipoprotein tỷ trọng thấp (Klaunig, Kamendulis,2004) Một hoạt chất có giá trị C militaris phải kể đến cordycepin Cordycepin lần tách từ C militaris vào năm 1950 Cunningham đồng tác giả Đây hợp chất có hoạt tính sinh học trích ly từ thể sợi nấm, có tác dụng chất kháng ung thư (Itoh et al.,1994) Yoshikawa đồng tác giả (2007) chứng minh cordycepin có hoạt tính kháng ung thư hiệu thơng qua việc ức chế q trình methyl hóa acidnucleic polyadenin hóa, tiền chất cordycepin adenosine có hoạt tính kháng ung thư (Yoshikawa et al.,2007) Ngồi cordycepin phát huy tác dụng gây độc tế bào thơng qua methyl hóa acid nucleic, ức chế phát triển Clostridium paraputrificum Clostridium perfringens (Lu LX et al.,2012) Trong vài năm gần đây, công nghệ nuôi cấy bề mặt môi trường lỏng sử dụng để tăng hàm lượng cordycepin mở rộng phát triển nuôi trồng C militaris Masuda đồng tác giả (2006) nghiên cứu điều kiện sản xuất cordycepin nuôi cấy bề mặt dùng C militaris NBRC 9787 Kết cho thấy thể tích mơi trường có ảnh hưởng trực tiếp đến suất nuôi trồng C militaris (Masuda et al.,2006) Thêm vào đó, nghiên cứu việc sản xuất cordycepin tăng cường đáng kể bổ sung hợp chất adenine glycine So với phương pháp ni cấy bề mặt truyền thống ni cấy theo mẻ làm tăng đáng kể hàm lượng cordycepin (Masuda et al.,2011) Để nuôi cấy, nhân giống nấm Đông trùng Hạ thảo có nhiều phương pháp sử dụng như: lên men chất rắn, lên men chìm lên men bề mặt Điểm mấu chốt phương pháp thu nhận tối đa lượng cordycepin từ nấm Đây hoạt chất quan trọng để đánh giá chất lượng sản phẩm khó để sản xuất quy mô lớn Hiện nay, phương pháp lên men chất rắn sử dụng để ni cấy thu nhận nấm Đơng trùng hạ thảo Phương pháp thu nhận lượng sinh khối nấm lớn nhiên thời gian nuôi cấy dài (60 ngày) phụ thuộc nhiều vào điều kiện thời tiết… Phương pháp nuôi cấy dịch thể (lên men chìm) quan tâm nhiều cơng nghệ sử dụng thuận tiện, tiết kiệm chi phí, giảm thời gian, dễ dàng thực quy mô lớn đặc biệt không chịu tác động yếu tố ngoại cảnh Với mục tiêu giảm chi phí thời gian nuôi cấy, tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng điều kiện lên men lên khả sinh hoạt chất cordycepin chủng C militaris H1 phương pháp lên men chìm NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP Nguyên vật liệu Đối tượng nghiên cứu: Chủng C militaris cung cấp Viện Bảo vệ Thực vật mang mã hiệu C militaris H1 Hóa chất, nguyên vật liệu: Các hóa chất sử dụng nghiên cứu vi sinh vật, dung mơi dùng cho phân tích HPLC hóa chất tiêu chuẩn hãng Merck (Đức), Sigma (Mỹ) cung cấp Thiết bị dụng cụ: Tủ cấy vơ trùng- Labconco (Anh), cân phân tích- Mettler (Đức), máy lắc ổn nhiệt- Shaking incubator (Hàn Quốc), máy li tâm- Mikro 220R (Đức) bioreactor, Sartorius Biostat A Plus ( Đức) Phương pháp nghiên cứu Phương pháp lưu giữ nhân giống: C militaris H1 tinh môi trường PDA (glucose 40 g/L, dịch chiết khoai tây 300 ml, agar 20 g/L) sau giữ giống ống nghiệm chứa môi trường PDA thạch nghiêng nhiệt độ °C để tiến hành thí nghiệm Các bình giống ban đầu ni cấy lắc 120 vịng/phút 25 °C ngày mơi trường nuôi cấy dịch thể MT1 bao gồm glucose 15 g/L; pepton g/L; KH2PO4 0,5 g/L; K2HPO4.3H2O 0,5 g/L MgSO4.7H2O 0,5 g/L Phương pháp lên men chìm: Mơi trường nuôi dịch thể sử dụng lên men chìm C militaris mơi trường MT1 Mơi trường nhân vào bình tam giác 250 ml bioreactor với thể tích khác tùy thuộc vào u cầu thí nghiệm Sau đó, mơi trường khử trùng 30 phút 121 ºC Tiến hành đánh giá ảnh hưởng điều kiện lên men tỷ lệ tiếp giống, nhiệt độ, pH, thời gian nuôi cấy, tốc độ lắc để xác định sinh khối khô hàm lượng cordycepin thu mẫu thí nghiệm Hệ thống thí nghiệm Các điều kiện thí nghiệm lên men nấm C militaris H1 Thí nghiệm Tỷ lệ tiếp giống Nhiệt độ pH Thời gian lên Tốc độ lắc (%) (°C) men (ngày) (vòng/phút) 15 60 20 10 90 25 15 120 30 20 150 10 37 25 180 12 30 210 Xác định trọng lượng sinh khối tế bào (DW): phương pháp li tâm kết hợp sấy đến trọng lượng không đổi, thu nhận sinh khối nấm dịch ni cấy li tâm, sau lọc qua giấy lọc rửa nước cất Sinh khối thu nhận sấy 60 ºC đến trọng lượng không đổi Sản phẩm bảo quản 20 ºC để tiến hành phân tích cordycepin Xác định hàm lượng cordycepin phương pháp sắc kí lỏng hiệu cao (HPLC) (Huang et al.,2009) Chuẩn bị mẫu thử: Mẫu dung dịch nuôi cấy tiến hành phá vỡ tế bào máy nghiền tế bào, tiếp tục rung siêu âm methanol cuối lọc trực tiếp qua màng cellulose acetat 0,45 µm để thu dung dịch mẫu dùng cho phân tích Q trình phân tích thực hệ thống HPLC (hãng Shimadzu, Nhật Bản) gồm: bơm LC 20AD, Detector SPD 20A, Bộ tiêm mẫu tự động SIL-20A HT Sử dụng cột C18 hãng Agilent, kích thước cột 250 x33 x4.6 mm, kích thước hạt µm Pha động gồm hai dung mơi nước (A) methanol (B) với tỷ lệ rửa giải 85/15 (A/B, v/v), tốc độ rửa giải ml/phút, nhiệt độ lò cột 30 ºC Detector UV đặt quan sát bước sóng 260 nm Thể tích tiêm mẫu vào cột 10 µl Xử lý số liệu: Mỗi mẫu nghiên cứu tiến hành phân tích lặp lại lần lấy kết trung bình (trung bình ± SD) Quá trình xử lý số liệu thực phần mềm Excel KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Ảnh hưởng tỷ lệ tiếp giống lên sinh trưởng C militaris H1 Tỷ lệ giống coi yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến hàm lượng cordycepin có nghiên cứu cho thấy có nhiều thay đổi sử dụng tỷ lệ tiếp giống khác (Jiapeng et al.,2014, Kang et al.,2012) Trong nghiên cứu này, ảnh hưởng nồng độ tiếp giống đánh giá dựa khả tạo cordycepin nấm Các nồng độ tiếp giống từ 2% – 12 %(v/v) đưa để khảo sát Kết trình bày hình Cordycepin mg/L Cordycepin Sinh khối (g/L)Sinh khối 400 20 15 200 10 0 10 12 Tỷ lệ giống % Hình Ảnh hưởng tỷ lệ giống lên sinh trưởng nấm C militaris H1 Ở tỷ lệ tiếp giống 8% hàm lượng cordycepin đạt tối đa (425,5 mg/L) Khi tỷ lệ tiếp giống ban đầu tăng từ % - % hàm lượng cordycepin tăng từ 115 mg/L – 425,5 mg/L tỷ lệ giống tăng lên 10 %, 12 % hàm lượng cordycepin lại giảm Điều lý giải tỷ lệ tiếp giống ban đầu khả tạo hoạt chất cordycepin có liên quan đến lượng oxy hồ tan mơi trường ni cấy Kết hồn tồn phù hợp với cơng bố trước %- 10 % tỷ lệ tiếp giống thích hợp cho phát triển nấm Cordyceps (Jiapeng et al.,2014, Kang et al.,2012) Vì chọn tỷ lệ tiếp giống ban đầu %(v/v) với hàm lượng cordycepin đạt 425,5 mg/L Ảnh hưởng nhiệt độ lên sinh trưởng nấm C militaris H1 Nghiên cứu ảnh hưởng nhiệt độ lên sinh trưởng phát triển chủng nấm C.militaris H1, nấm nuôi môi trường MT1 dải nhiệt độ 15 ºC, 20 ºC, 25 ºC, 30 ºC 37 ºC Kết thể hình CordyceNphiniệt độ 0C Sinh khối 500 16 450 14 400 12 Cordycepin (mg/L)350 Sinh khối (g/L)10 300 250 200 150 100 50 15 20 25 30 37 Hình Ảnh hưởng nhiệt độ lên sinh trưởng nấm C militaris H1 Kết hình cho thấy, nhiệt độ tăng trình sinh trưởng, phát triển nấm tăng theo Trong 25 ºC nhiệt độ tốt cho sinh trưởng phát triển chủng Ở nhiệt độ 15 ºC, 20 ºC chủng H1 có phát triển lượng sinh khối thu không tốt nhiệt độ 25 ºC, nhiệt độ cao 30 ºC 37 ºC chủng C militaris H1 phát triển, điều phù hợp với nghiên cứu Hung đồng tác giả, nhóm tác giả nghiên cứu cơng bố nhiệt độ cao ức chế tạo thành cordycepin chủng nấm (Huang et al.,2009) Ở nhiệt độ nuôi cấy 25 ºC hàm lượng sinh khối khô cao đạt 15,2 g/L hàm lượng cordycepin đạt 455,4 mg/L nhiệt độ 37 ºC C militaris H1 gần không phát triển, hàm lượng sinh khối đạt 2,7 g/L hàm lượng cordycepin mức thấp đạt 34,2 mg/L Từ đó, chúng tơi chọn nhiệt độ thích hợp cho sinh trưởng C militaris H1 25 ºC Ảnh hưởng pH lên sinh trưởng nấm C militaris H1 pH ảnh hưởng đến việc tạo chất trao đổi bậc từ nhiều loại nấm thuộc nhóm Ascomycetes Basidiomycetes (Shih et al.,2007) Để nghiên cứu ảnh hưởng pH đến trình sinh tổng hợp cordycepin, điều chỉnh pH dịch nuôi cấy từ 4,0 đến 8,0 theo dõi trình sinh trưởng nấm Kết cho thấy trình tổng hợp cordycepin chịu ảnh hưởng đáng kể pH mơi trường ni cấy q trình lên men (hình 3) CordyceppHin Sinh khối 500 18 450 16 400 14 Cordycepin (mg/L) Sinh khối (g/L)35012 300 10 250 200 150 100 50 Hình Ảnh hưởng pH lên sinh trưởng nấm C militaris H1 Nghiên cứu sinh trưởng hệ sợi nấm C militaris H1 môi trường dịch thể giá trị pH khác nhau, kết cho thấy, giá trị pH sau 15 ngày nuôi cấy, hệ sợi nấm C militaris H1 sinh trưởng tốt cho sinh khối nấm cao đạt 15,9 g/L Tại giá trị pH 4, 5, sinh khối sợi tương ứng 6,13 g/L; 6,79 g/L; 6,24 g/L 4,21 g/L Hàm lượng cordycepin pH thu cao đạt 459,6 ± 15,3 mg/L, pH hàm lượng cordycepin thu thấp đạt 64,03 ± 2,25 mg/l Khi pH tăng lên hàm lượng cordycepin có chiều hướng giảm dần Nghiên cứu cho thấy hàm lượng cordycepin tối đa đạt pH 5,5 với hàm lượng 213 mg/L từ chủng nấm C.militaris 3936 (Tuli et al.,2014) Nghiên cứu đánh giá ảnh hưởng pH lên sinh trưởng nấm C.militaris H1 cho thấy mơi trường ban đầu có pH thích hợp cho sinh trưởng, phát triển khả tạo cordycepin cao Ảnh hưởng thời gian/chu kì nuôi cấy lên sinh trưởng nấm C militaris H1 Theo dõi phát triển nấm thời gian – 30 ngày bình tam giác 250 ml Kết qủa cho thấy mật độ tế bào nấm C militaris H1 tăng nhanh sau đến 10 ngày ni cấy, sau giảm dần Sinh khối sợi nấm tăng lên từ ngày đầu đến ngày thứ 10 trì đến ngày 15 Hàm lượng sinh khối nấm tăng cao 15 ngày đạt 15,92±2,48 g/L, đến 30 ngày hàm lượng sinh khối khơ có chiều hướng giảm dần cịn 8,05±2,2 g/L (a) – ngày (b) -10 ngày (c) – 30 ngày Hình Sinh trưởng nấm C.militaris H1 môi trường dịch thể theo thời gian Khả tổng hợp cordycepin từ ngày đến ngày 10 tăng không nhiều tăng vọt ngày thứ 15 Sau hàm lượng cordycepin không giảm với sinh khối sợi mà có xu hướng tăng lên đến ngày thứ 30 trình lên men Hàm lượng cordycepin cao đạt 497,5±3,2 mg/L ngày 30, hàm lượng cordycepin ngày 15 đạt 460,5±2,67 mg/L Để tạo sản phẩm có hàm lượng cordycepin cao tiết kiệm thời gian, đảm bảo chi phí tốt cho sản phẩm, lựa chọn thời gian nuôi cấy 15 ngày, hàm lượng cordycepin đạt 460,5±2,67 mg/L (hình 5) CTohrờdiygciaenpinnuôi cấy S(ninghàyk)hối 600 18 Cordycepin (mg/L) 500 16 14 400 12 Sinh khối (g/L) 300 10 200 100 10 15 20 25 30 Hình Ảnh hưởng thời gian ni cấy lên sinh trưởng nấm C militaris H1 Ảnh hưởng tốc độ lắc lên sinh trưởng nấm C militaris H1 Nghiên cứu ảnh hưởng tốc độ lắc đến sinh trưởng C militaris H1, tiến hành nuôi cấy nấm môi trường MT1 với tốc độ từ 60- 210 vòng/phút Kết hình cho thấy sinh trưởng, phát triển tạo thành cordycepin nấm phụ thuộc nhiều vào thơng khí Đây yếu tố quan trọng cho tăng trưởng tế bào sản sinh chất chuyển hóa ni cấy vi sinh vật hiếu khí Tốc độ lắc (Cvoòrndgy/cpehpúitn) Sinh khối 500 18 450 16 Cordycepin (mg/L) 400 14 350 12 300 10 250 200 150 100 50 60 90 120 150 180 210 Hình Ảnh hưởng tốc độ lắc lên sinh trưởng nấm C militaris H1 Kết hình cho thấy tốc độ lắc 150 vịng/phút cho q trình sinh trưởng nấm C militaris H1 tốt tốc độ lắc nấm sinh trưởng tốt với sinh khối đạt 16,7 g/L hàm lượng cordycepin cao đạt 475,2 mg/L Ở tốc độ lắc thấp 60, 90 vịng/phút q trình sinh trưởng nấm xảy bình thường, nhiên hạt nấm tạo thành to tạo màng bề mặt bình làm cho sinh khối tạo (6,54 g/L) hàm lượng cordycepin đạt thấp (204,1 mg/L) Ở tốc độ lắc 180, 210 vòng/phút dịch lên men khó tạo hạt, q trình lên men khơng đồng Kết phù hợp với nghiên cứu trước cho oxy đóng vai trị quan trọng việc tăng trưởng tế bào sản sinh chất chuyển hoá sinh học (Shih et al.,2007) KẾT LUẬN Trong nghiên cứu chọn điều kiện cho trình lên men nấm C mliltaris H1 với tỷ lệ tiếp giống %, nhiệt độ sinh trưởng 25 ºC, pH 6, thời gian ni cấy 15 ngày, tốc độ lắc 150 vịng/phút cho hàm lượng sinh khối khô cao đạt khô đạt 16,7 g/L hàm lượng cordycepin 475,2 mg/L Lời cảm ơn: Đề tài hỗ trợ kinh phí từ Bộ Khoa học Công nghệ theo hợp đồng số 04/2016/HĐ-ĐTCB ngày 05/01/2016 TÀI LIỆU THAM KHẢO Kim GY, Ko WS, Lee JY, Lee JO, Ryu CH, Choi BT, Park YM, Jeong YK, Lee KJ, Choi KS (2006) Water extract of Cordyceps militaris enhances maturation of murine bone marrow-derived dendritic cells in vitro Biol Pharm Bull 29(2): 354-360 Klaunig JE, Kamendulis LM (2004) The role of oxidative stress in carcinogenesis Annu Rev Pharmacol Toxicol 44(239-267 ItohH, T Shioda T, Matsura T, Koyama SY, Nakanishi T, Kajiyama G, Kawasaki T (1994) Iron ion induces mitochondrial DNA damage in HTC rat hepatoma cell culture-role of antioxidants in mitochondrial DNA protection from oxidative stresses Arch Biochem Biophys 313(1): 120-125 Yoshikawa N, Nakamura K, Yamaguchi Y, Kagota S, Shinozuka K, Kunitomo M (2007) Reinforcement of antitumor effect of Cordyceps sinensis by 2′-deoxycoformycin, an adenosine deaminase inhibitor In Vivo 21(2): 291-295 Lu LX, Xu Q, Liu ZH, Sun Y, Djing Z , Li YQ (2012) Optimization of production of intracellular polysaccharides from Cordyceps ophiolossoides L2 in submerged culture and its antioxidant activities intro Chin J Chem Eng 20(2): 294-301 Masuda M, Urabe E, Sakurai A, Sakakibara M (2006) Production of cordycepin by surface culture using the medicinal mushroom Cordyceps militaris Enzyme Microb Technol 39(4): 641-646 Masuda M, Das SK, Fujihara S, Hatashita M, Sakurai A (2011) Production of cordycepin by a repeated batch culture of a Cordyceps militaris mutant obtained by proton beam irradiation J Biosci Bioeng 111(1): 55-60 Huang L, Li Q, Chen Y, Wang X ,Zhou X (2009) Determination and analysis of cordycepin and adenosine in the products of Cordyceps spp Afr J Microbiol Res 3(12): 957-961 Jiapeng T, Yiting L, Li Z (2014) Optimization of fermentation conditions and purification of cordycepin from Cordyceps militaris Prep Biochem Biotechnol 44(1): 90-106 10 Kang C, Wen T, Kang J, Qian Y, Lei B (2012) Effects of additives and different culture conditions on cordycepin production by the medicinal fungus Cordyceps militaris Mycosystema 31(3): 389-397 11 Shih IL, Tsai KL, Hsieh C (2007) Effects of culture conditions on the mycelial growth and bioactive metabolite production in submerged culture of Cordyceps militaris Biochem Eng J 33(3): 193-201 12 Tuli HS, Sandhu SS, Sharma A (2014) Pharmacological and therapeutic potential of Cordyceps with special reference to Cordycepin Biotech 4(1): 1-12 EFFECTS OF FERMENTATATION CONDITIONS ON CORDYCEPIN PRODUCTION FROM Cordyceps militaris Nguyen Thi Thanh Mai 1, Tran Bao Tram 1, Ngo Thi Hoa 1, Tran Thi Hoai Huong 2, Truong Thi Chien Center for Experimental Biology National Center for Technological Progress SUMMARY Cordyceps militaris is a medicinal mushroom containing numerous of precious biological active substances such as cordycepin, adenosine, manitol, sterols and exopolysaccharide The aim of this work was to optimize maximum cordycepin production conditions in fermented broth of C militaris H1 The effect of fermentation conditions on cordycepin production of Cordyceps militaris H1 using submerged fermentation that carried out with MT1 medium containing glucose 40 g/L; 8% peptone The optimum fermentation conditions for strain H1 were found to be an inoculum concentration of 8% (v/v); temperature of oC; initial pH of 6.0; time of fermentation of 15 days and shaking at 150 rpm Strain H1 obtained the highest biomass of 16.7 g/L and cordycepin of 475.2 mg/L Keywords: cordycepin, Cordyceps militaris, fermentation, submerged culture