BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ NGUYỄN CHÍ DŨNG NGHIÊN CỨU ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH KHÁNG PHÂN BÀO TRÊN DÒNG TẾ BÀO UNG THƯ MCF 7, JURKAT T[.]
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ - NGUYỄN CHÍ DŨNG NGHIÊN CỨU ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH KHÁNG PHÂN BÀO TRÊN DÒNG TẾ BÀO UNG THƯ MCF-7, JURKAT T CỦA CAO CHIẾT VÀ HOẠT CHẤT TỪ SINH KHỐI, QUẢ THỂ NHÂN NUÔI CỦA CHỦNG NẤM Cordyceps neovolkiana DL0004 VÀ Isaria cicadae F0004 LUẬN ÁN TIẾN SỸ CÔNG NGHỆ SINH HỌC Hồ Chí Minh – Năm 2022 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ - NGUYỄN CHÍ DŨNG NGHIÊN CỨU ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH KHÁNG PHÂN BÀO TRÊN DỊNG TẾ BÀO UNG THƯ MCF-7, JURKAT T CỦA CAO CHIẾT VÀ HOẠT CHẤT TỪ SINH KHỐI, QUẢ THỂ NHÂN NUÔI CỦA CHỦNG NẤM Cordyceps neovolkiana DL0004 VÀ Isaria cicadae F0004 Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 9420201 LUẬN ÁN TIẾN SỸ CÔNG NGHỆ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TSKH Ngô Kế Sương TS Đinh Minh Hiệp Thành phố Hồ Chí Minh – Năm 2022 LỜI CAM ĐOAN Tôi cam đoan luận án tiến sỹ ngành Công nghệ Sinh học, với đề tài “Nghiên cứu đánh giá hoạt tính kháng phân bào dịng tế bào ung thư MCF-7, Jurkat T cao chiết hoạt chất từ sinh khối, thể nhân nuôi chủng nấm Cordyceps neovolkiana DL0004 Isaria cicadae F0004” cơng trình khoa học Tôi thực hướng dẫn PGS.TSKH Ngô Kế Sương TS Đinh Minh Hiệp Những kết nghiên cứu luận án hoàn toàn trung thực xác NGHIÊN CỨU SINH Nguyễn Chí Dũng i LỜI CẢM ƠN Tơi chân thành kính trọng biết ơn người Thầy, Cô, Anh, Chị, đồng nghiệp, đồng mơn, gia đình bạn bè giúp đỡ Tôi nhiều học vấn sống ngày trước trình làm luận án tiến sỹ công nghệ sinh học Với tất chân thành, xin gửi lời cảm ơn chân thực đến: Phó Giáo sư, Tiến sỹ Khoa học Ngơ Kế Sương tận tình bảo, hướng dẫn kiến thức kinh nghiệm quý báu nghiên cứu, công việc sống Tiến sỹ Đinh Minh Hiệp động viên hướng dẫn kiến thức kinh nghiệm nghiên cứu giúp đỡ nhiệt tình lúc Tơi gặp khó khăn Tiến sỹ Nguyễn Thị Mỹ Nương, Tiến sỹ Dương Thúc Huy Tiến Sỹ Đặng Hồng Phú ln hỗ trợ tư vấn giúp đỡ vấn đề liên quan Luận án Thầy cô, nhà khoa học Viện Sinh học nhiệt đới Học viện khoa học công nghệ - Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ tận tụy dạy dỗ năm tham gia chương trình nghiên cứu sinh Học viện Tập thể bạn học viên, sinh viên, nghiên cứu sinh nhóm Cordyceps, đặc biệt Em Vũ Thị Ngân, Trần Tài, Huỳnh Thư, Nguyễn Tài Hoàng, Trần Minh Trang, Nguyễn Hoàng Đăng Khoa, Phạm Thị Mỹ Ninh, Hà Thị Ngọc, Nguyễn Nguyệt Hồng, Mai Kiều Tiên Hà Thị Bích Hằng ln đồng hành tơi suốt thời gian thực Luận án Cuối cùng, quan trọng, Tôi muốn gửi lời cảm ơn sâu sắc đến Gia đình, bạn bè ln hỗ trợ động viên để Tơi vượt qua khó khăn suốt trình học tập, nguồn động lực to lớn để tơi hồn thành tốt Luận án tiến sỹ Thành phố Hồ Chí Minh, ngày 01 tháng 09 năm 2022 NGHIÊN CỨU SINH Nguyễn Chí Dũng ii Trang LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT vi DANH MỤC CÁC BẢNG ix DANH MỤC CÁC HÌNH x MỞ ĐẦU CHƯƠNG TỔNG QUAN .3 1.1 Tổng quan về nấm Cordyceps 1.1.1 Giới thiệu về nấm Cordyceps 1.1.2 Tổng quan về Cordyceps neovolkiana Isaria cicadae 1.1.3 Giá trị kinh tế của nấm Cordyceps .9 1.2 Nghiên cứu nuôi cấy Cordyceps 10 1.3 Thành phần hoạt chất và hoạt tính sinh học của nấm Cordyceps .11 1.3.1 Thành phần hoạt chất của Cordyceps 11 1.3.2 Hoạt tính kháng phân bào của Cordyceps 16 CHƯƠNG VẬT LIỆU - PHƯƠNG PHÁP .24 2.1 Vật liệu nghiên cứu 24 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu .24 2.1.2 Hóa chất 25 2.1.3 Dụng cụ thiết bị 25 2.2 Phương pháp nghiên cứu .26 2.2.1 Phương pháp thu nhận cao chiết hợp chất 26 2.2.2 Phương pháp khảo sát hoạt tính gây độc tế bào cảm ứng apoptosis của cao chiết hợp chất 37 iii 2.3 Phương pháp xử lý số liệu .42 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 43 3.1 Chiết cao từ sinh khối thể C neovolkiana DL0004 I cicadae F0004 43 3.2 Hoạt tính gây độc tế bào của cao chiết với dòng tế bào ung thư MCF-7 Jurkat T .47 3.2.1 Hoạt tính gây độc của cao chiết C neovolkiana DL0004 đối với dòng tế bào MCF-7 Jurkat T 48 3.2.2 Hoạt tính gây độc của cao chiết I cicadae F0004 đối với dòng tế bào MCF-7 Jurkat T 51 3.2.3 Xác định cao chiết có khả gây độc tế bào cao 55 3.3 Nghiên cứu cảm ứng apoptosis tế bào MCF-7 Jurkat T với cao chiết tiềm 58 3.3.1 Nghiên cứu cao PE của sinh khối Cordyceps neovolkiana DL0004 cảm ứng apoptosis tế bào ung thư MCF-7 Jurkat T 58 3.3.2 Kết đánh giá khả cảm ứng apoptosis của cao EA từ thể I cicadae F0004 67 3.4 Phân chất, tinh sạch và định danh hợp chất của cao chiết có tiềm kháng phân bào 78 3.4.1 Phân chất cao PE của sinh khối C neovolkiana DL0004 [59], [83] 78 3.4.2 Phân chất cao EA của thể Isaria cicadae F0004 [59] 83 3.5 Kết đánh giá hoạt tính gây độc tế bào ung thư MCF-7 Jurkat T của chất .90 3.6 Kết khả cảm ứng apoptosis tế bào ung thư MCF-7 Jurkat T của ergone 92 3.6.1 Hình thái tế bào MCF-7 Jurkat T sau nhuộm với AO/EB 93 3.6.2 Phân tích Chu kỳ tế bào phương pháp flow cytomeretry .94 iv 3.6.3 Định lượng tế bào bị cảm ứng apoptosis phương pháp nhuộm Annexin V/PI .96 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 100 Kết luận 100 Kiến nghị 101 v DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Tiếng Anh Diễn giải AO Acridine orange cridin cam ATCC the American Type Culture Bảo tàng giống chuẩn Hoa kỳ Collection bFGF Basic Fibroblast Growth Factor Nhân tố sinh trưởng nguyên bào sợi Bu n-Butanol CAT Enzyme catalase CPT Camptothecin DMSO Dimethyl sulfoxid DPPH 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl EA Ethyl acetate EB Ethidium bromid EDTA Ethylene diamin etetraacetic acid Liều lượng hiệu ED50 Effective dose, 50% EP Ergosterol peroxid EPS Exopolysaccharid Polysaccharid ngoại bào EPSF Exopolysaccharid fragment Phân đoạn polysaccharid ngoại bào vi ER Estrogen Et Ethanol FBS Fetal bovine serum GPx Glutathione peroxidase HMBC Heteronuclear multiple bond Phổ HMBC Huyết thai bò correlation HSQC Heteronuclear single quantum Phổ HSQC coherence IC50 The half maximal inhibitory Nồng độ ức chế tối đa nửa concentration IFN Interferon-gamma LD50 Lethal dose, 50% LPS Lipopolysaccharid MCF-7 Michigan Cancer Foundation-7 Dòng tế bào MCF-7 MDA Malondialdehyde Meth A Meth A fibrosarsoma MIC The minimum Liều lượng gây chết nửa inhibitory Nồng độ ức chế tối thiểu concentration MMP2 Matrix metallopeptidase MTH Methuselah Gen Methuselah MTT MTT assay Xét nghiệm phương pháp MTT vii NAD Nicotinamid adenin dinucleotid NCI National Cancer Institute Viện ung thư Quốc gia Hoa kỳ NMR Nuclear magnetic resonance Phổ cộng hưởng tứ hạt nhân PARP Poly ADP-ribose polymerase PE Petroleum ether PHA Phytohaemagglutinin PI Propidium iodide Poly Polysaccharide PPCs Polysaccharide-peptides polysaccharid-peptid QT Fruit body thể ROS Reactive oxygen species gốc tự có oxy SK Mycelium Sinh khối SOD Superoxide dismutase SRB sulforhodamin B TCA Trichloroacetic acid TLC Thin-layer chromatography Sắc ký mỏng TNF Tumor necrosis factor yếu tố hoại tử khối u W Water extract cao nước WHO World Health Organization Tổ chức Y tế Thế giới Ête dầu hỏa viii Bảng so sánh kết phổ 1H NMR 13C đơn chất N5 (Aceton– d6) protocatechuic acid (Aceton – d6) IC5 (Aceton- d6) δH, J (Hz) Protocatechuic acid (Aceton) δC δH 123,1 7,53 (1H; d; 2,0) 117,4 δC 123,7 7,42 (1H, d) 117,7 145,5 145,8 150,6 150,8 6,89 (1H; d; 8,3) 115,6 6,76 (1H, d, 8,0) 115,5 7,47 (1H; dd; 8,3-2,1) 123,5 7,40 (1H, dd, 8,0, 123,6 2,0) 1–COOH 167,8 Hình cấu trúc hợp chất IC5 170,5 Hình phổ 13C chất IC5 6.6 nicotinic acid (IC6) HÌnh phổ 1H chất IC6 Bảng so sánh liệu phổ NMR của đơn chất IC6 (aceton – d6) nicotinic acid (DMSO - d6) No N6 δH, J (Hz) Nicotinic acid HMBC δC δH δC 9,07(1H) 149,9 H→C 9,11 (1H, d, 2.3) 3, ,6, 149,7 130,7 136,5 8,26 (1H, dt, 7,9 2,0) 2, 6, 135,9 8,28 (1H) 136,7 7,47 (1H, dd, 7.9 3, 124,2 7,52 (1H) 123,6 2, 4, 152,9 8,79 (1H) 152,9 4.8) 8,7 (1H, dd, 4.8 1.7) 167,6 Hình cấu trúc hợp chất IC6 165,91 HÌnh phổ 13C chất IC6 HÌnh phổ HSQC chất IC6 Hình phổ HMBC chất IC6 Hình xử lý tế bào MCF-7 với cao PE từ sinh khối C neovolkiana DL0004 sau 24 giờ 48 giờ Hình xử lý tế bào MCF-7 với ergone cô lập từ cao PE từ sinh khối C neovolkiana DL0004 sau 24 giờ 48 giờ Hình xử lý tế bào MCF-7 với cao EA từ thể I cicadae F0004 sau 24 giờ 48 giờ Hình xử lý tế bào Jurkat T với cao PE từ sinh khối C neovolkiana DL0004 sau 24 giờ 48 giờ Hình đối chứng âm xử lý tế bào Jurkat T với ergone cô lập từ cao PE của sinh khối C neovolkiana DL0004 sau 24 giờ Hình xử lý tế bào Jurkat T với cao EA từ thể I cicadae F0004 sau 24 giờ 48 giờ Hình nhuộm AO/EB sau 48 giờ với tế bào Jurkat T với mẫu lần lượt từ trái sang phải của đối chứng âm, CPT (đối chứng dương) và ergone cô lập từ cao PE của sinh khối C neovolkiana DL0004 Hình nhuộm AO/EB sau 48 giờ với tế bào MCF-7 với mẫu lần lượt từ trái sang phải của đối chứng âm, CPT (đối chứng dương) và ergone cô lập từ cao PE của sinh khối C neovolkiana DL0004 ... tiến sỹ ngành Công nghệ Sinh học, với đề t? ?i ? ?Nghiên cứu đánh giá ho? ?t t? ?nh kháng phân bào dòng t? ?? bào ung thư MCF-7, Jurkat T cao chi? ?t ho? ?t ch? ?t từ sinh khối, thể nhân nuôi chủng nấm Cordyceps... nguyên liệu cho ứng dụng thực t? ?? dược phẩm, luận án ? ?Nghiên cứu đánh giá ho? ?t t? ?nh kháng phân bào dòng t? ?? bào ung thư MCF-7, Jurkat T cao chi? ?t ho? ?t ch? ?t từ sinh khối, thể nhân nuôi chủng nấm Cordyceps... nội dung thực sau: t? ??o cao chi? ?t từ sinh khối thể nấm ni trồng; sàng lọc cao chi? ?t có độc t? ?nh t? ?? bào tiềm hai dòng t? ?? bào ung thư MCF-7 Jurkat T; xác nhận đặc t? ?nh kháng phân bào cao chi? ?t tiềm