Bản trình bày PowerPoint BÁO CÁO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA CHỦNG VI KHUẨN TÍA QUANG HỢP CÓ TIỀM NĂNG SỬ DỤNG LÀM PROBIOTIC TRONG NUÔI CÁ NƯỚC NGỌT HỌC VIỆN NÔNG N[.]
HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM BÁO CÁO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA CHỦNG VI KHUẨN TÍA QUANG HỢP CÓ TIỀM NĂNG SỬ DỤNG LÀM PROBIOTIC TRONG NUÔI CÁ NƯỚC NGỌT NỘI DUNG I MỞ ĐẦU II ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU III IV KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ I MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề Chất thải cá Ngành nuôi trồng thủy sản đặc biệt ni cá nước phát triển nhanh chóng Ơ nhiễm nước ao, hồ nuôi Dịch bệnh vi sinh vật gây bệnh phát triển Dư lượng thuốc kháng sinh tồn vật nuôi Người nuôi trồng sử dụng chế phẩm sinh học có chứa vi sinh vật làm probiotic như: Bacillus, Lactobacillus, Propiobacterium nhóm vi khuẩn tía quang hợp Trong nhóm VKTQH quan tâm Sử dụng mức thức ăn công nghiệp I MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề Vi khuẩn tía quang hợp Tế bào Gram âm, đơn bào Dạng cầu, xoắn, gậy, phẩy trạng thái chuỗi Kích thước từ 0,3-6 µm Sinh sản nhân đơi nảy chồi Rhodospirillum Rhodocyclus Rhodomicrobium Rhodobacter Rhodopseudomonas Rhodopila Hình 2.1 Hình dạng tế bào số đại diện VKTQH không lưu huỳnh (Pfennig, 1969) I MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề Sử dụng làm probiotic nuôi cá nước Xử lý nước ao nuôi (Merugu cs, 2010) Sử dụng làm nguồn protein đơn bào (Sasikala, 1995) Sử dụng làm probiotic nuôi tôm nước lợ Ứng dụng VKTQH Sản xuất acid béo không no đơn nối đôi đa nối đôi Làm thức ăn cho nuôi trồng thủy sản Trong nghiên cứu Vũ Thu Hà (2019) phân lập sàng lọc chủng VKTQH 19 có khả sinh trưởng mạnh, đối kháng với loại vi khuẩn gây bệnh cá nước ngọt, sinh enzyme ngoại bào, có khả chịu muối mật nồng độ 0,3%, khả chịu pH thấp có khả bám dính vào niêm mạc Để sử dụng chủng VKTQH 19 an toàn hiệu cho việc sản xuất sinh khối tiến hành nghiên cứu đề tài: “Nghiên cứu đặc điểm sinh học chủng vi khuẩn tía quang hợp có tiềm sử dụng làm probiotic nuôi cá nước ngọt” I MỞ ĐẦU 1.2 Mục đích yêu cầu 1.2.1 Mục đích Có đặc điểm sinh học xác định trình tự gen 16S-rRNA để làm sở cho việc định tên loài chủng VKTQH ký hiệu 19 có tiềm sử dụng làm probiotic nuôi cá nước 1.2.2 Yêu cầu - Xác định đặc điểm sinh học chủng VKTQH nghiên cứu bao gồm: Hình thái khuẩn lạc, tế bào Đường cong sinh trưởng Đặc điểm hệ sắc tố quang hợp Khả sử dụng muối cho sinh trưởng Khả sử dụng sulfide Ảnh hưởng pH đến khả tích lũy sinh khối - Định danh chủng VKTQH 19 thơng qua giải trình tự gen 16S-rRNA II ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng Chủng VKTQH ký hiệu 19 có tiềm sử dụng làm probiotic nuôi cá nước phân lập từ mẫu ao nuôi cá nước xã Ngự Lộc, huyện Hậu Lộc, tỉnh Thanh Hóa lưu giữ phịng Thí nghiệm trọng điểm Công nghệ gen, Viện Công nghệ sinh học – Viện Hàn lâm khoa học & Công nghệ Việt Nam 2.2 Nội dung nghiên cứu Nghiên cứu hình thái, khuẩn lạc tế bào chủng VKTQH nghiên cứu Nghiên cứu khả chịu sulfide, ảnh hưởng pH nồng độ muối đến khả sinh trưởng chủng VKTQH 19 Nghiên cứu đường cong sinh trưởng thời gian sinh trưởng tối ưu chủng VKTQH 19 Xác định trình tự gen 16S- rRNA chủng VKTQH để định danh chủng Nghiên cứu đặc điểm hệ sắc tố quang hợp II ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.3 Phương pháp nghiên cứu Phương pháp nuôi cấy Phương pháp nghiên cứu đặc điểm hình thái khuẩn lạc, tế bào Phương pháp đánh giá sinh trưởng VKTQH Phương pháp nghiên cứu hệ sắc tố VKTQH Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng pH ban đầu Phương pháp xác định khả sử dụng muối cho sinh trưởng Phương pháp xác định khả sử dụng Sulfide cho sinh trưởng Phương pháp xác định trình tự gen 16S rRNA III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Kết nghiên cứu đặc điểm sinh học 3.1.1 Hình thái khuẩn lạc, tế bào A B C Hình 3.1 Hình dạng khuẩn lạc, tế bào chủng 19 A, B: hình dạng khuẩn lạc; C: hình dạng tế bào kính hiển vi điện tử với độ phóng đại 20.000 lần III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Kết nghiên cứu đặc điểm sinh học Sinh trưởng theo ∆OD660 3.1.2 Đường cong sinh trưởng 3.0 2.5 2.0 1.5 Thời điểm thu sinh khối cao sau ngày nuôi cấy 1.0 0.5 0.0 Thời gian (ngày) Hình 3.2 Đường cong sinh trưởng chủng VKTQH 19 10 III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Kết nghiên cứu đặc điểm sinh học 3.1.3 Đặc điểm hệ sắc tố quang hợp Phổ hấp thụ dịch huyền phù tế bào chủng 19 có cực đại 815,5 nm 877 nm Chủng VKTQH nghiên cứu chứa Bchl a Hình 3.3 Phổ hấp phụ dịch huyền phù tế bào chủng 19 11 III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Kết nghiên cứu đặc điểm sinh học 3.1.4 Khả sử dụng muối NaCl cho sinh trưởng Sinh trưởng theo ∆OD660 3.0 2.5 Từ Hình 3.4 cho thấy nồng độ 2.0 muối cao, sinh trưởng 1.5 VKTQH (chủng 19) giảm bị 1.0 ức chế 0.5 0.0 0.5 1.5 2.5 3.5 4.5 Nồng độ NaCl (%) Hình 3.4 Mức độ tích lũy sinh khối chủng 19 nồng độ muối khác Chủng có khả sinh trưởng mạnh môi trường không chứa muối 12 III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Kết nghiên cứu đặc điểm sinh học Sinh trưởng theo ∆OD660 3.1.5 Ảnh hưởng pH ban đầu 3.0 2.5 2.0 Chủng VKTQH nghiên cứu sinh trưởng dải pH rộng chịu đựng mơi trường acid yếu 1.5 1.0 0.5 0.0 4.5 5.5 6.5 7.5 8.5 9.5 10 Độ pH Hình 3.5 Mức độ tích lũy sinh khối chủng 19 mơi trường có pH ban đầu khác 13 III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Sinh trưởng theo ∆OD660 3.1 Kết nghiên cứu đặc điểm sinh học 3.1.6 Ảnh hưởng nồng độ sulfide 2.8 2.4 2.0 1.6 1.2 0.8 0.4 0.0 0.4 0.8 1.2 1.6 2.4 2.8 3.2 3.6 4.4 4.8 5.2 Chủng vi khuẩn nghiên cứu có khả sinh trưởng mơi trường không chứa chứa Na2S nồng độ 3,2 mM Nồng độ Na2S (mM) Hình 3.6 Mức độ tích lũy sinh khối chủng 19 mơi trường có nồng độ Na2S ban đầu khác 14 III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Kết nghiên cứu đặc điểm sinh học Bảng 3.1 Một số đặc điểm hình thái, sinh lý sinh hóa hai chủng VKTQH tuyển chọn so sánh với loài gần gũi Chủng Đặc điểm 19 Màu sắc tế bào Màu nâu đỏ Rhodopseudomonas palustris (Bergey D.H et al., 1984) Màu đỏ đến nâu đỏ Hình que đến hình trứng Hình dạng tế bo Hỡnh que 1ì àm Sc t quang hp Bchl a Bchl a - 8,5 (7,0) 5,5 - 8,5 (6,9) Không Không - mM Không xác định pH (tối ưu) Yêu cầu NaCl cho sinh trưởng Na2S (mM) 0,6 - 0,9 ì1,2 2,0 àm 15 III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.2 Xác định trình tự gen 16S rRNA chủng vi khuẩn nghiên cứu 3.2.1 Khuếch đại gen 16S- rRNA chủng VKTQH lựa chọn M Hình 3.7 Điện di đồ DNA tổng số Hình 3.8 Hình ảnh điện di sản phẩm PCR 1: DNA tổng số chủng 19; M: thị M: thị phân tử DNA 1kb marker; ĐC: đối chứng âm; phân tử DNA 1kb marker 1: sản phẩm PCR với khuôn DNA tách từ chủng 19 16 III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.2 Xác định trình tự gen 16S rRNA chủng vi khuẩn nghiên cứu 3.2.2 Kết giải trình tự gen 16S- rRNA Bảng 3.2 So sánh kết giải trình tự gen Chủng 19 Trình tự gen 16S rRNA chủng vi khuẩn so sánh Tổng điểm Độ tương đồng (%) Mã số truy cập GenBank Rhodopseudomonas palustris ATCC 17003 2494 99 AB498816.1 Rhodopseudomonas palustris S55 2494 99 D84187.1 Rhodopseudomonas palustris TUT3620 2492 99,21 AB250613.1 Rhodopseudomonas palustris CQV97 2492 99,06 EU882154.1 Rhodopseudomonas.sp JA228 2488 99,13 FN995099.1 Rhodopseudomonas palustris CS-1 2484 99,13 JQ863308.1 17 III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.2 Xác định trình tự gen 16S rRNA chủng vi khuẩn nghiên cứu 3.2.3 Xây dựng phát sinh chủng loại số loài VKTQH 29 Rhodobacter veldkampii (NR 043405.1) Rhodobacter sphaeroides (MG576212.1) 92 Rhodobacter blasticus (NR 043735.1) 100 Rhodovulum strictum (NR 025845.1) Rhodovulum sulfidophilum (LC596064.1) 46 44 100 Rhodovulum adriaticum (NR 043404.1) Rhodocista pekingensis (NR 028855.1) Rhodospirillum centenum (NR 025830.1) Rhodoplanes elegans (NR 029125.1) Rhodopseudomonas 19 100 100 Từ phát sinh chủng loại ta thấy, chủng 19 tỉ lệ tương đồng cao so với lồi Rhodopseudomonas palustris có mã số đăng kí Ngân hàng gen AB498816.1 Vì vậy, chúng tơi cho chủng 19 thuộc lồi Rhodopseudomonas palustris Rhodopseudomonas palustris (AB498816.1) Hình 3.9 Cây phát sinh chủng loại số loài VKTQH 18 IV KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 Kết luận Khuẩn lạc chủng 19 có dạng hình trịn, mép căng, màu nâu đỏ, đường kính khoảng 1,5 – mm, dịch huyền phù tế bào có màu nâu đỏ Tế bào có dạng hình que, chiều dài 4µm, chiều rộng µm, sinh sản cách nảy chồi Sinh trưởng tối ưu sau ngày (96h) nuôi cấy Chứa Bchl a Sinh trưởng nồng độ muối từ – 1,5%, tối ưu nồng độ 0% Từ đặc điểm sinh học kết hợp với kết phân tích trình tự gen 16S rRNA xác định chủng 19 thuộc loài Rhodopseudomonas palustris Sinh trưởng dải pH rộng từ – 8, tối ưu pH 7, chịu đựng mơi trường có pH thấp 4,5 Có thể chịu nồng độ sulfide < 3,2 mM, sinh trưởng tối ưu nồng độ Na2S 0,4 mM 19 IV KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.2 Kiến nghị Nhằm cung cấp đủ nguồn nguyên liệu cho việc sử dụng làm Lựa chọn nguồn chất thích hợp probiotic nuôi cá nước cần nghiên cứu xây dựng quy trình sản xuất sinh khối chủng 19 quy mơ phịng thí nghiệm quy mơ pilot như: Ảnh hưởng điều kiện ngoại cảnh đến khả tích lũy sinh khối nhiệt độ, cường độ ánh sáng, oxy đến sinh trưởng chúng Cách thu sinh khối lượng lớn 20