Hiện nay, nấm bào ngƣ đang dần trở thành một trong những khẩu phần chính trong bữa ăn của ngƣời dân. Bên cạnh mùi vị thơm ngon, giàu dinh dƣỡng, rất dễ chế biến, nấm còn đƣợc xem nhƣ là một loại “rau sạch” và có giá trị dƣợc liệu. Sản lƣợng nấm bào ngƣ tăng lên rất nhanh trong vài thập kỷ qua. Theo thống kê của Chang và ctv (1999) chỉ trong vòng 36 năm trở lại đây tổng sản lƣợng nấm trồng tăng gấp 21 lần từ 350.000 năm 1965 tăng lên 7,5 triệu tấn, trong đó nấm bào ngƣ Pleurotus spp. tăng từ 169000 tấn năm 1986 lên 876000 tấn năm1997. Gần đây, Việt Nam cũng đang phát triển công nghệ trồng nấm trong nƣớc. Vì thế, ngoài việc khai thác nấm hoang dại đem về trồng, nƣớc ta còn nhập khẩu nhiều loại nấm bào ngƣ khác từ nƣớc ngoài nhƣ Trung Quốc, Đài Loan, Nhật Bản. Trong số đó, có một số loài đã đƣợc biết rất rõ về thành phần dinh dƣỡng, một số loài còn lại thành phần này vẫn chƣa đƣợc công bố chính thức, đặc biệt là thành phần amino acid. Vì thế, việc xác định thành phần amino acid trên nấm bào ngƣ đối với Việt Nam là điều cần thiết để có thể đánh giá giá trị sinh học, cũng nhƣ so sánh sự khác nhau giữa chúng. Từ xƣa đến nay, việc xác định amino acid đã đƣợc thực hiện trên rất nhiều công cụ khác nhau nhƣ: sắc ký giấy, sắc ký lớp mỏng. Phân tích amino acid trên các công cụ phân tích truyền thống này thì đòi hỏi nhiều thời gian và rất phức tạp. Ngày nay, với sự phát triển của kỹ thuật phân tích, việc xác định thành phần amino acid trong mẫu sinh hóa đã đƣợc đơn giản hơn rất nhiều, bởi hầu hết các công cụ đã đƣợc tự động hóa và đƣợc nối trực tiếp bộ phận xử lý số liệu. Hiện nay, trên thị trƣờng đang tồn tại rất nhiều kỹ thuật phân tích amino acid nhƣ: sắc ký lỏng cao áp, HPLC (high performance liquid chromatography), sắc ký trao đổi ion (ion exchange chromatography), điện di mao quản (capillary electrophoresis). Trong phạm vi cho phép, chúng tôi chỉ thực hiện “Phân tích amino acid bằng sắc ký lỏng cao áp” trên một số loài nấm đang có ở thị trƣờng Việt Nam. Từ đó, với kết quả thu đƣợc chúng tôi sẽ tiến hành so sánh với các đối tƣợng khác cũng nhƣ sự khác nhau giữa chúng và dữ liệu về thành phần amino acid của từng loài nấm bào ngƣ sẽ đƣợc lƣu lại để làm cơ sở cho những nghiên cứu sau này. 1.2. Mục đích So sánh sự thành phần amino acid giữa các loài nấm bào ngƣ đang có trên thị trƣờng Việt Nam. Khi đó, chúng tôi sẽ chọn ra một loài phù hợp để so sánh thành phần amino acid khi trồng trên các cơ chất khác nhau 1.3. Yêu cầu Tạo đựợc mẫu có độ tinh sạch cao. Tránh hiện tƣợng làm thay đổi tính chất mẫu nhƣ oxy hóa, halogen hóa, hay làm mẫu bị hủy hoàn toàn trong quá trình thủy phân. Sử dụng thiết bị HPLC (high performance liquid chromatography) của Trung tâm Phân Tích Hóa Lý để phân tích thành phần amino acid của các loài nấm kể trên 1.4. Nội dung thực hiện Thu thập và nhân giống các loài nấm đang có trên thị trƣờng. Nuôi trồng các loài nấm này trên môi trƣờng mùn cƣa có bổ sung một số vi lƣợng. Tiến hành thu quả thể Xác định thành phần amino acid trên các loài nấm bào ngƣ bằng sắc ký lỏng cao áp (HPLC).
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC ***000*** KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP NI TRỒNG VÀ XÁC ĐỊNH THÀNH PHẨN AMINO ACID CỦA MỘT SỐ LOÀI NẤM BÀO NGƢ (Pleurotus spp.) BẰNG KỸ THUẬT SẮC KÝ LỎNG CAO ÁP (High performance liquid chromatography - HPLC) Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Niên khóa: 2001-2005 Sinh viên thực hiện: Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/ BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC NƠNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC ***000*** KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP NUÔI TRỒNG VÀ XÁC ĐỊNH THÀNH PHẨN AMINO ACID CỦA MỘT SỐ LOÀI NẤM BÀO NGƢ (Pleurotus spp.) BẰNG KỸ THUẬT SẮC KÝ LỎNG CAO ÁP (High performance liquid chromatography - HPLC) Giáo viên hƣớng dẫn: Sinh viên thực hiện: TS LÊ ĐÌNH ĐƠN ĐỒN BẢO QUỐC Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/ LỜI CẢM TẠ CHÂN THÀNH CẢM ƠN: Ban Giám Hiệu Trƣờng Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh Bộ mơn Cơng Nghệ Sinh Học Bộ mơn Bảo vệ Thực vật Q thầy cô truyền đạt kiến thức cho suốt trình học trƣờng TRÂN TRỌNG BIẾT ƠN Thầy Lê Đình Đơn tận tình hƣớng dẫn, tạo điều kiện giúp đỡ chúng tơi hồn thành khóa luận Thầy Bùi Cách Tuyến, Thầy Bùi Minh Trí tạo điều kiện cho thực tập Trung Tâm Phân Tích Thí Nghiệm Hóa Sinh Cơ Trần Thị Dung, Thầy Lƣu Phúc Lợi, Thầy Nguyễn Văn Cƣờng, Anh Mai Huy Hồng giúp tơi có trang thiết bị nhƣ phịng thí nghiệm để hồn thành khóa luận Các anh chị Trung Tâm Phân Tích Thí Nghiệm Hóa Sinh, Đại Học Nơng Lâm TP Hồ Chí Minh nhiệt tình giúp đỡ tơi hịan thành khóa luận Anh Lê Viết Ngọc Viện hạt nhân Đà Lạt, anh Hoàng trƣờng Đại học Khoa Học Tự Nhiên Thành phố Hồ Chí Minh cung cấp giống nấm bào ngƣ cho tơi thực khóa luận Các thành viên lớp Công Nghệ Sinh Học 27 động viên, giúp đỡ tơi thời gian thực tập ii TĨM TẮT Đồn Bảo Quốc, Đại học Nơng Lâm Thành phố Hồ Chí Minh Phân tích amino acid nấm bào ngƣ Pleurotus spp sắc ký lỏng cao áp - high performance liqud chromatography (HPLC) thời gian từ 14/2/2005 đến 18/8/2005 Hội đồng hƣớng dẫn: TS Lê Đình Đơn Khóa luận đƣợc thực đối tƣợng nấm bào ngƣ Pleurotus spp Đây loại nấm phổ biến thị trƣờng Việt Nam Vì thế, thành phần dinh dƣỡng chúng, đặc biệt thành phần amino acid đƣợc quan tâm Để thực phân tích amino acid nấm, tiến hành trồng nấm Trung tâm Công Nghệ Sinh Học sử dụng thiết bị sắc ký lỏng cao áp (HPLC) Trung tâm Hóa Lý thuộc Trƣờng Đại Học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh Những kết đạt đƣợc: Ni trồng đƣợc dòng nấm Pleurotus spp chất mùn cƣa có bổ sung thêm cám gạo, số chất khác Phân tích định lƣợng đƣợc 17 amino acid loài nấm Pleurotus flabellatus Pleurotus pulmonarius Từ chúng tơi tiến hành so sánh thành phần amino acid chúng với số rau khác, với số nấm khác so sánh chúng MỤC LỤC CHƢƠNG TRANG Trang tựa Lời cảm ta i Tóm tắt ii Mục lục iii Danh sách chữ viết tắt vi Danh sách hình vii iii Danh sách bảng viii MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục đích 1.3 Yêu cầu 1.4 Nội dung thực 2 TỔNG QUAN 2.1 Nấm trồng 2.1.1 Khái niệm nấm 2.1.2 Sinh sản chu trình sống 2.2 Đặc điểm biến dƣỡng sinh lý 2.3 Nấm bào ngƣ 2.3.1 Giới thiệu 2.3.2 Một số lồi nấm bào ngƣ đƣợc ni trồng VIệt Nam 2.3.2.1 Nấm bào ngƣ Pleurotus florida 10 2.3.2.2 Nấm bào ngƣ Pleurotus sajorcaju 10 2.3.2.3 Nấm bào ngƣ Pleurotus pulmonarius 11 2.3.2.4 Nấm bào ngƣ Pleurotus abalonus 11 2.4 Phƣơng pháp sắc ký 12 2.4.1 Đặc điểm chung phƣơng pháp sắc ký 12 2.4.2 Cơ sở phƣơng pháp sắc ký 12 2.5 Một số phƣơng pháp sắc ký phân tich amino acid 13 2.5.1 Sắc ký giấy (Paper chromatography) 13 2.5.2 Sắc ký lớp mỏng ( Thin layer chromatography _TLC) 14 2.5.3 High Performance Liquid Chromatography (HPLC) 15 2.5.3.1 Pha tĩnh 15 2.5.3.2 Pha động 16 iv 2.5.3.3 Bộ dụng cụ HPLC 16 2.6 Các bƣớc phân tích amino acid 17 2.6.1 Quá trình thủy phân (Hydrolysis) 17 2.6.2 Quá trình tạo dẫn xuất (Derivatisation) 19 2.6.3 Phân tách HPLC 20 2.6.4 Phân tích tính tốn liệu 21 2.4.4.1 Định tính 21 2.4.4.2 Định lƣợng 21 2.7 Phân tích amino acid nấm bào ngƣ 23 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23 3.1.Thời gian địa điểm thực 23 3.1.1 Thời gian thực 23 3.1.2 Địa điểm 23 3.1 3.Vật liệu nghiên cứu 23 3.2 Hóa chất dụng cụ 23 3.2.1 Hóa chất 23 3.2.2 Dụng cụ thiết bị 24 3.3 Phƣơng pháp nhân giống trồng nấm 24 3.3.1 Môi trƣờng 24 3.3.2 Phƣơng pháp 24 3.2.2.1 Chuẩn bị môi trƣờng PGA 24 3.2.2.2 Chuẩn bị môi trƣờng hạt 24 3.3.2.3 Chuẩn bị môi trƣờng giá môi 25 3.2.2.4 Chuẩn bị môi trƣờng nuôi trồng 25 3.2.2.5 Tóm tắt quy trình 26 3.3.3 Phân tích amino acid 26 3.3.3.1.Thủy phân mẫu 26 3.3.3.2 Tạo dẫn xuất: 27 3.3.3.3 Phân tích HPLC 28 3.3.3.4 Phân tích tính tốn kết 28 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 29 v 4.1 Kết 29 4.1.1 Kết trồng nấm 29 4.1.1.1 Sự tăng trƣởng hệ sợi mơi trƣờng 29 4.1.1.2 Sự hình thành thể 30 4.1.2 Kết phân tích amino acid 32 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 35 5.1 Kết luận 35 5.2 Đề nghị 35 TÀI LIỆU THAM KHẢO 36 DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT vi ACN:Acetonitril HPLC: High performance liquid chromatography TLC: Thin layer chromatography PITC: phenylisothiocyanate PTC: phenylisocarbamyl TEA: Triethylamine DANH SÁCH CÁC HÌNH HÌNH TRANG Hình 2.1 Cấc trúc tế bào nấm Hình 2.2 Chu kỳ sống nấm đảm Hình 2.3 Pleurotus pulmonarius 11 vii Hình 2.4 Pleurotus abalonus 11 Hình 2.5 Pleurotus sp 11 Hình 2.6 Pleurotus floridanus 11 Hình 2.7 Mơ hình sắc ký giấy 14 Hình 2.8 Mơ hình sắc ký lớp mỏng 14 Hình 2.9 Bộ dụng cụ HPLC 16 Hình 2.10 Thủy phân protein HCl 18 Hình 2.11 Tạo dẫn xuất amino acid PITC 20 Hình 2.12 Kết phân tích amino acid Pleurotus sp sắc ký giấy trịn 22 Hình 4.1 Sinh trƣởng môi trƣờng hạt Pleurotus floridanus, Pleurotus flabellatus, Pleurotus flabellatus 31 Hình 4.2 Pleurotus abalonus giá mô 31 Hình 4.3 Bào tử Pleurotus abalonus 31 Hình 4.4 Bào tử đảm floridanus 31 Pleurotus Hình Bào tử đảm abalonus 31 Pleurotus Hình 4.6 Quả thể nấm Pleurotus floridanus 32 Hình 4.7 Quả thể nấm Pleurotus abalonus 32 Hình 4.8 Quả thể nấm Pleurotus flabellatus 32 Hình 4.9 Quả thể nấm Pleurotus pulmonarius 32 DANH SÁCH CÁC BẢNG BẢNG TRANG viii ... định thành phần amino acid loài nấm bào ngƣ sắc ký lỏng cao áp (HPLC) 3 Phần TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Nấm trồng 2.1.1 Khái niệm nấm Hiện nay, số loài nấm trồng đƣợc chiếm phần nhỏ số nấm ăn thiên... tích amino acid sắc ký lỏng cao áp? ?? số loài nấm có thị trƣờng Việt Nam Từ đó, với kết thu đƣợc tiến hành so sánh với đối tƣợng khác nhƣ khác chúng liệu thành phần amino acid loài nấm bào ngƣ đƣợc... Nấm bào ngƣ Pleurotus abalonus 11 2.4 Phƣơng pháp sắc ký 12 2.4.1 Đặc điểm chung phƣơng pháp sắc ký 12 2.4.2 Cơ sở phƣơng pháp sắc ký 12 2.5 Một số phƣơng pháp sắc ký