CHƯƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU Vũ Văn Trường K14 – Lớp 07 5 MỞ ĐẦU Bệnh ung thư được coi là một trong những chứng bệnh nan y nguy hiểm được phát hiện với số ca mắc bệnh ngày càng gia tăng trên thế giới K[.]
Vũ Văn Trường K14 – Lớp 07 - MỞ ĐẦU Bệnh ung thư coi chứng bệnh nan y nguy hiểm phát với số ca mắc bệnh ngày gia tăng giới Khơng giả thuyết cho rằng, ung thư bệnh phát sinh lối sống, lối sinh hoạt thiếu khoa học người Song phải ung thư bệnh đại? Với số lượng bệnh nhân phát mắc bệnh ung thư số ca tử vong ung thư tăng đột biến vài năm gầm đây, ung thư xem bệnh xã hội thời đại Ts.Roaslie David – trường đại học Manchester – Anh Ts.Michael Zimmermann – trường đại học Villanova nghiên cứu khẳng định: sống xã hội thời đại góp phần đẩy mạnh hình thành nhiều yếu tố gây ung thư Theo dự báo nhà khoa học Anh, kỷ 21, ung thư tiếp tục bệnh có tỉ lệ tử vong cao giới Khoa học chưa thể tìm cách điều trị dứt điểm trường hợp khối u ác tính, ung thư cẫn xem bệnh nan y khó chữa Theo thống kê Tổ chức ung thư Liên hợp quốc, tới năm 2030, số trường hợp mắc ung thư giới tăng gấp nhiều lần số số trường hợp tử vong ung thư nhiều gấp đôi số thống kê gới vào năm 2008 Theo ước tính này, số người bị tử vong ung thư lên tới khoảng 13,2 triệu người vào năm 2030 Hiệp hội nghiên cứu ung thư quốc tế - IARC cho biết, khoảng 21,4 triệu trường hợp mắc ung thư phát vào năm 2030 tập trung chủ yếu nước nghèo, nơi có mức sống thấp tỉ lệ mắc bệnh cao giới Lý giải cho việc số ca tử vong ung thư tăng lên tương lai, nhà khoa học cho rằng, điều kiện sống thay đổi, thói quen sinh hoạt, kèm theo thay đổi khí hậu tồn cầu dẫn tới khắc nghiệt thời tiết, môi trường bị ô nhiễm nặng nề Nồng độ Khoa Công nghệ Sinh học Viện Đại Học Mở Hà Nội Vũ Văn Trường K14 – Lớp 07 - phân tử phóng xạ tự môi trường tăng cao khiến cho nguy tiếp xúc với lượng phóng xạ gia tăng điều kiện thuận lợi cho xuất bệnh nhân ung thư Ung thư vấn nạn nghiêm trọng người nên việc điều trị ung thư quan trọng chương trình Phịng chống ung thư quốc gia Muốn nâng cao chất lượng điều trị, khơng hồn chỉnh kĩ thuật phương pháp, thiết bị, mà cịn phải có kinh nghiệm, kiến thức, chẩn đốn xác, xây dựng phác đồ điều trị cho bệnh nhân cách hợp lý Các phương pháp điều trị như: - Phương pháp điều trị chỗ: Phẫu thuật tia xạ, có khả điều trị triệt để bệnh giai đoạn sớm, tổn thương ung thư khu chỗ vùng - Các phương pháp điều trị tồn thân: Điều trị hóa chất, điều trị nội tiết, điều trị miễn dịch… - Ngoài phương pháp điều trị có nhiều nhà nghiên cứu ứng dụng enzyme điều trị ung thư ví dụ như: Chuyển gen mã hóa enzyme để chuyển hóa thuốc chuyên dụng thành chất gây chết tế bào ung thư, sử dụng kháng thể có gắn enzyme chuyển hóa thuốc chuyên dụng thành chất gây độc tế bào Legumain nhiều enzyme ứng dụng nhiều y học. Legumain biểu cao số loại khối u, chẳng hạn như tuyến tiền liệt, đại tràng và ung thư vú Ngoài ra, cịn biểu cao ung thư đại tràng Do chúng tơi tiến hành thực đề tài “Thiết kế vector biểu gen mã hóa legumain” Nhằm mục đích sản xuất legumain với lượng lớn để phục vụ cho y học Khoa Công nghệ Sinh học Viện Đại Học Mở Hà Nội Vũ Văn Trường K14 – Lớp 07 - CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu chung Enzyme 1.1.1 Định nghĩa Trong thể sống (các tế bào) ln xảy q trình trao đổi chất Sự trao đổi chất ngừng sống khơng tồn Q trình trao đổi chất tập hợp quy luật nhiều phản ứng hóa học khác Các phản ứng hóa học phức tạp có liên quan chặt chẽ với điều chỉnh lẫn enzyme hợp chất protein xúc tác cho phản ứng hóa học Chúng có khả xúc tác đặc hiệu phản ứng hóa học định đảm bảo cho phản ứng xảy theo chiều hướng định với tốc độ nhịp nhàng thể sống.[1] Chúng có hầu hết loại tế bào thể sống Chính tác nhân xúc tác có nguồn gốc sinh học nên enzyme gọi chất xúc tác sinh học (biocatalysators) nhằm để phân biệt với chất xúc tác hóa học.[2] 1.1.2 Lịch sử nghiên cứu Enzyme Do Enzyme học coi cột sống hóa sinh học nên phần lớn nghiên cứu hóa sinh từ trước đến liên quan nhiều đến enzyme Sự phất triển enzyme chia thành giai đoạn [2] - Giai đoạn 1: trước kỷ thứ XVII - Giai đoạn 2: từ kỷ XVII đến nửa đầu kỷ XX - Giai đoạn 3: từ kỷ XIX đến 30 năm đầu kỷ XX - Giai đoạn 4: từ ngững năm 30 kỷ XX đến 1.1.2.1 Giai đoạn Trước kỷ XVII người ta biết sử dụng trình enzyme đời sống song có tính chất kinh nghiệm thực tế thông qua hoạt động vi Khoa Công nghệ Sinh học Viện Đại Học Mở Hà Nội Vũ Văn Trường K14 – Lớp 07 - sinh vật Đó trình lên men rượu, muối dưa, làm tương nước chấm… Ở thời kỳ người ta chưa hiểu chất enzyme trình lên men…[2] 1.1.2.2 Giai đoạn Ở giai đoạn nhà bác học tiến hành tìm hiểu chất trình lên men Thời kỳ khái quát tượng lên men tượng phổ biến sống enzyme yếu tố gây nên chuyển hóa chất trình lên men Vào năm 1600 kỷ XVII, Jan Baptista Van Helmont (Hà Lan, 1577 – 1644) người tìm hiểu sâu chất trình lên men Van Helmont nhận thấy chất tiêu hóa chuyển hóa hóa học thức ăn giải thích chế với so sánh với q trình lên men rượu Danh từ ‘ferment’ Van helmont dùng để tác nhân gây chuyển biến chất trinh lên men rượu Vào nửa cuối kỷ thứ XVIII, nhà tự nhiên học người Pháp Réaumur nghiên cứu chất tiêu hóa Ơng nghiên cứu vật thí nghiệm chim quạ đen Đầu kỷ XIX, nhà nghiên cứu tách chất gây trình lên men Năm 1814 Kirchoff, viện sỹ Saint Petercburg phát amylase mầm đại mạch Năm 1833, hai nhà khoa học người Pháp Payen Pessoz chứng minh chất có hoạt động phân giải tinh bột thành đường tách dạng bột Tiếp người ta tìm tách nhiều Enzyme khác Enzyme phân giải protein dich tiêu hóa dày Pepsin Sau đó, lý thuyết xúc tác đời Năm 1835, nhà khoa học Berzelius (nhà hóa học Thụy Điển) có quan điểm cho tăng tốc độ phản ứng tượng xúc tác Đây quan điểm Song tiếc cho nhà khoa học Khoa Công nghệ Sinh học Viện Đại Học Mở Hà Nội Vũ Văn Trường K14 – Lớp 07 - coi chất xúc tác hoạt động “ lực sống” không theo điều khiển người Đây quan điểm tâm, siêu hình làm trì trệ phát triển khoa học ảnh hưởng sâu sắc đến phất triển nghành Enzyme học.[2] 1.1.2.3 Giai đoạn Giai đoạn từ kỷ XIX đến 30 năm đầu kỷ XX Ở giai đoạn số lượng lớn Enzyme dạng hòa tan tách chiết Trong thời kỳ này, có hai trường phái đấu tranh nhau: trường phái Pasteur – nhà bác học vĩ đại người Pháp trường phái Liebig – nhà bác học tiếng người Đức *Trường phái Pasteur: Năm 1856 Pasteur đề cập đến chất trình lên men Ông cho tách Enzyme khỏi tế bào Tác dụng tính chất Enzyme gắn liền với sống tế bào trình lên men rượu kết hoạt động sống tế bào nấm men kết tác dụng Enzyme Ơng tiến hành thí nghiệm nhận thấy dung dịch hữu cơ, ví dụ dung dịch glucose để bình khử trùng khơng xảy q trình lên men rượu Chính nhờ suy nghĩ ấy, Pasteur chia Enzyme thành hai loại: “ Enzyme có tổ chức” “Enzyme khơng có tổ chức” Theo ơng, “Enzyme có tổ chức” Enzyme tách khỏi tế bào, tách chúng tách dụng Các “ Enzyme khơng có tổ chức” Enzyme có dịch tiêu hóa (ví dụ Pepsin dày, amylase tuyến nước bọt, mầm thóc…) Quan điểm sai lầm Pasteur thống trị nghành Enzyme học thời gian dài Năm 1878 Kuhne đề nghị dùng danh từ “ferment” để gọi “Enzyme có tổ chức” Cịn “Enzyme” để gọi “Enzyme khơng có tổ chức” Danh từ Enzyme xuất phát từ Khoa Công nghệ Sinh học Viện Đại Học Mở Hà Nội Vũ Văn Trường K14 – Lớp 07 - * Trường phái Liebig Chống lại quan điểm Pasteur, Liebig (trước có Berzeliu) cho khơng có hoạt động tế bào vi sinh vật có q trình lên men Điều có nghĩa ơng coi Enzyme chất hóa học gây lên hiệu tương tự chất xúc tác, tác dụng ngồi tế bào, khơng phụ thuộc vào hoạt động sống vi sinh vật Nhưng năm 1871 Liebig thất bại thực nghiệm khơng chứng minh quan điểm Các thí nghiệm tiến hành cách lấy dịch chiết từ tế bào nấm men nghiền nát, khơng có tác dụng gây men rượu Cũng vào năm 1871 Mannatxein bác sỹ gười Nga dùng cát thạch anh nghiền tế bào nấm men thu dịch chiết không chứa tế bào có khả biến đổi đường thành rượu Nhưng quan sát không ý tới Chính vậy, quan điểm siêu hình Pasteur hạn chế nhiều phát triển nghành Enzyme học Đến năm 1897, H Buchner – nhà khoa học người Đức nhận dịch chiết nấm men cách phân hủy tế bào hoàn thiện Trong thí ngiệm này, tế bào nấm men nghiền nát hoàn toàn với bột thủy tinh, sau ép áp suất cao Dịch chiết thu khơng chứa tế bào có khả gây q trình lên men (chuyển hóa từ đường glucose thành rượu) Điều chứng tỏ trình lên men khơng phải kết hoạt động sống tế bào nấm men mà kết Enzyme vốn có tế bào Do đó, quan điểm sai lầm Enzyme hồn tồn bị xóa bỏ Cũng từ khơng có phân biệt nội dung thuật ngữ “ferment” “enzyme” Có thể nói cơng trình Buchner đánh dấu bước ngoặt quan trọng lịch sử phát triển Enzyme học Từ có nhiều Enzyme thể sống tìm Vì việc phân loại gọi tên Enzyme cách thống cần thiết Năm 1883, Duyclo nhà bác học người Pháp đề nguyên tắc phân loại Enzyme theo Khoa Công nghệ Sinh học Viện Đại Học Mở Hà Nội Vũ Văn Trường K14 – Lớp 07 - chất (substrate) chúng biến đổi thêm đuôi tận “ase” vào Tuy vậy, thực tế tồn nhiều ngoại lệ thuật ngữ, ví dụ tên gọi Enzyme pepsin, trypsin, catalase trước dùng Giai đoạn quan trọng thời kì cơng trình nhà bác học vĩ đại người Đức E Fisher Ông đặt móng cho khái niệm đại tính đặc hiệu Enzyme, tương tác không gian Enzyme chất Giả thuyết tiếng ông Enzyme chất kết hợp với “ổ khóa với chìa khóa” Rồi nghiên cứu Bach Palladin Enzyme oxy hóa khử tạo nên sở cho việc xây dựng học thuyết oxy hóa khử sinh học Trong thời gian người ta phát tính tác dụng thuận nghịch Enzyme (Đanilepsski, 1894), coenzyme phát (Harden Young, 1906) Họ người khám phá dịch chiết tế bào nấm men chứa hai loại chất cần thiết cho trình lên men “zymase” “coenzyme”.[2] 1.1.2.4 Giai đoạn Bản chất hóa học Enzyme xác định đắn từ sau kết tinh Enzyme Năm 1926 nhà khoa học người Mỹ trẻ tuổi Sumner (39 tuổi) thành công việc chứng minh protein kết tinh từ hạt đậu tương chất giống Enzyme xúc tác cho phản ứng thủy phân ure, Enzyme kết tinh Năm 1930 Mỹ Northrop tách pepsin dạng tinh thể, vào năm 1931 Northrop Kunitz tách trypsin dạng tinh thể Các cơng trình Sumner Northrop mở chương lịch sử phát triển Enzyme học đại Những kết đạt khẳng định cách dứt khoát chất Enzyme protein Phải nói chất hóa học phần lớn Enzyme protein định nghĩa có tính chất kinh điển Enzyme phải xem lại từ sau phát T.R Cech năm 1981 Cech phát Khoa Công nghệ Sinh học Viện Đại Học Mở Hà Nội Vũ Văn Trường K14 – Lớp 07 - RNA có hoạt tính xúc tác Enzyme gọi ribozyme Ribozyme xúc tác cho trình chuyển hóa tiền chất RNA thơng tin (pre – mRNA) thành m – RNA Do Enzyme khơng thiết phải protein, phát minh có ý nghĩa lớn Tác giả phát minh giải Nobel năm 1989 Từ kỷ XX, thời gian gần enzyme học phát triển mạnh Nhờ ứng dụng phương pháp mới, đại như: điện di, sắc ký, quang phổ, đồng vị phóng xạ… cho phép nghiên cứu cấu trúc chế tác dụng nhiều Enzyme điều hòa hoạt đông Enzyme tế bào Năm 1969 người ta tổng hợp Enzyme ribonuclease (Denkewalter Hirschmann, Gutte Merrifielad) Đây Enzyme gồm 124 amino acid, bền với nhiệt, đun nóng lên 80ºC với thời gian ngắn Trong chục năm cuối kỷ XX đấu kỷ XXI, người ta ý nghiên cứu việc ứng dụng Enzyme Người ta tận dụng nguyên liệu giàu Enzyme để tách Enzyme, dung chế phẩm Enzyme để chế biến nguyên liệu khác sử dụng vào mục đích khác Ở nhiều nước hình thành ngành công nghệ Enzyme, hàng năm sản xuất hàng trăm chế phẩm Enzyme để phục vụ cho nghành sản xuất khác cho y học.[2] 1.1.3 Phân loại Enzyme Mục đích phân loại enzyme để nhấn mạnh cách xác tổng quát, mối quan hệ điều giống loại enzyme 1.1.3.1 Các lớp enzyme Tiểu ban enzyme (The enzyme Commission EC) tổ chức Hội hóa sinh quốc tế (The internationl Union of Biochemistry, IUB) đưa cách phân loại thống dựa loại phản ứng chế phản ứng Theo cách phân loại enzyme chia làm sáu lớp lớn đánh số từ đến Các số thứ tự cố định cho lớp Sáu lớp enzyme theo phân loại quốc tế gồm có: Khoa Công nghệ Sinh học Viện Đại Học Mở Hà Nội Vũ Văn Trường K14 – Lớp 07 - Oxydoreductase: Các enzyme xúc tác cho phản ứng oxy hóa - khử Trong nhóm có tất enzyme có tên thơng thường biết dehydrogenase, oxydase, cytochromreductase peroxydase Trong phản ứng chúng xúc tác xảy ta vận chuyển hydrogen, chuyển electron, oxy hóa oxy phân tử, hydrogen peroxide chất oxy hóa khác Transferase: Các enzyme xúc tác cho phản ứng chuyển vị Các transferase chất gốc mà chúng vận chuyển tham gia vào q trình trao đổi chất khác Trong lớp transferase bên cạnh transaminase methyltransferase cịn có kinase khác (xúc tác chủ yếu cho vận chuyển gốc phosphate từ hợp chất cao tới chất khác, phần lớn enzyme trước gọi mutase vài loại synthetase, ví dụ enzyme tổng hợp DNA RNA) Hydrolase: Các enzyme xúc tác cho phản ứng thủy phân Trong lớp có enzyme phân giải este (ví dụ lipid), glucozid, amid, peptid, protein Lyase: Các enzyme xúc tác cho phản ứng phân cắt không cần nước, loại nước tạo thành nối đôi kết hợp phân tử nước vào nối đôi Thuộc vào lớp có enzyme gọi hydratase, aldolase, decarboxylase số desaminase Ligase: Các enzyme xúc tác cho phản ứng tổng hợp có sử dụng liên kết giàu lượng ATP v.v Isomerase: Các enzyme xúc tác cho phản ứng đồng phân hóa Tính chúng xúc tác cho phản ứng chuyển nhóm khác bên phân tử Trong lớp khơng có enzyme chuyển hóa đồng phân hình học đồng phân quang học (như alaninracemase) mà enzyme xúc tác cho phản ứng ví dụ chuyển hóa aldose thành cetose (glucosophosphate isomerase, trước gọi phosphohexoisomerase) biến đổi vị trí liên kết este bên phân tử (ví dụ phosphoglucomutase).[2] Khoa Cơng nghệ Sinh học Viện Đại Học Mở Hà Nội Vũ Văn Trường K14 – Lớp 07 - 1.1.3.2 Các phản ứng enzyme * Lớp enzyme oxydoreductase Lớp enzyme gồm 14 lớp phụ, xúc tác cho phản ứng oxy hóa khử Phản ứng oxy hóa tương ứng với tách điện tử khỏi chất, phản ứng khử phản ứng thu nhận điện tử thường kèm với Q trình tổng qt biểu thị sau: Akh Box + e AKh + Box ↔ Aox + e Bkh ↔ Aox + Bkh ↔ Trong AKh chất A dạng khử, Aox chất A dạng oxy hóa, e điện tử, Box chất B dạng oxy hóa, B Kh chất B dạng khử Các enzyme thuộc lớp enzyme thành phần có coenzyme NAD+, NADP+, FMN, FAD, - Dehydrogenase: xúc tác cho phản ứng tách H trực tiếp từ chất chuyển đến NAD+ NADP+, FMN, FAD - Oxydase: Xúc tác cho trình chuyển điện tử đến oxy hoạt hóa oxy làm cho có khả kết hợp với proton có mơi trường - Oxygenase: xúc tác cho phản ứng kết hợp trực tiếp oxy vào phân tử hợp chất hữu (thường chất có vịng thơm) Có thể phân biệt hai loại: oxygenase hydroxylase Oxygenase xúc tác cho phản ứng kết hợp tồn phân tử oxy cịn hydroxylase kết hợp nửa phân tử oxy (thường dạng OH) vào hợp chất hữu - Peroxydase: peroxydase điển hình catalase có coenzyme hem, xúc tác cho phản ứng oxy hóa chất hữu có H 2O2 * Lớp enzyme transferase Lớp gồm tám lớp phụ Các enzyme lớp protein phức Khoa Công nghệ Sinh học 10 Viện Đại Học Mở Hà Nội Vũ Văn Trường K14 – Lớp 07 - - Bảo quản 4C Phản ứng PCR phụ thuộc vào nhiều yếu tố khác như: nhiệt độ, thành phần phản ứng nồng độ DNA khuôn mồi 2.3.10 Phương pháp xác định trình tự nucleotide tự động hệ thống điện di mao quản Dựa vào kéo dài chuỗi DNA theo nguyên tắc bổ sung DNA polymerase có mặt ddNTP primer Phản ứng kéo dài làm ngừng cách bổ sung dideoxyribonucleosid triphosphate (ddNTP) Mỗi ddNTP sử dụng gắn với phân tử huỳnh quang nucleotide cho màu riêng biệt Cho tất bốn loại ddNTP đánh dấu vào ống Sau đoạn DNA có màu phân tách theo kích thước điện di ống điện di mao quản Các đoạn DNA khác phân tách gel mao quản xuất dạng đỉnh với màu kèm Các đỉnh phát cách sử dụng nguồn laser detector Đọc trình tự DNA cách xác định màu đỉnh chúng qua detector thông tin chuyển trực tiếp đến máy tính xác định trình tự DNA.[18] CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Khoa Công nghệ Sinh học 42 Viện Đại Học Mở Hà Nội Vũ Văn Trường K14 – Lớp 07 - 3.1 Kết thu nhận gen legumain vector pET-32c(+) có đầu dính bổ sung Để tiến hành thiết kế vector biểu pET-32c(+) mang gen mã hoá legumain, chúng tơi phịng Cơng nghệ tế bào động vật, Viện Công nghệ sinh học cung cấp vector tách dòng tái tổ hợp pBT-legumain, gen proteinase legumain vector xác định trình tự nucleotide, gen có tương đồng 100% với trình tự có mã số đăng ký AY409389, DQ895070 SY:DQ891884 Quá trình thiết kế vector biểu pET-32c(+) mang gen mã hoá legumain khởi đầu với việc vector tách dòng tái tổ hợp pBT-legumain xử lý với enzyme EcoRI HindIII, thu đoạn gen mã hóa legumain (900bp) Đồng thời vector pET-32c(+) cắt mở vòng với EcoRI HindIII Sau đó, sử dụng enzyme nối T4-ligase để nối đoạn gen mã hóa legumain với vector pET32c(+) tạo vector tái tổ hợp pET-32c(+)-legumain (Hình 3.1) EcoRI Legumain 900bp pBTlegumain HindIII pET32c+ 6800bp Legumain 900bp EcoRI pET32c + 5900bp HindIII Hình 3.1: Sơ đồ thiết kế vector biểu 3.1.1 Kết xử lý vector tách dòng pBT-legumain với enzyme EcoRI HindIII Khoa Công nghệ Sinh học 43 Viện Đại Học Mở Hà Nội Vũ Văn Trường K14 – Lớp 07 - Sau nhận plasmid tách dịng pBT có gắn đoạn gen mã hóa legumain vector biểu pET-32c(+) từ phịng Cơng nghệ tế bào động vậtViện Công nghệ sinh học, tiến hành biến nạp vào tế bào vi khuẩn E.coli DH5α để thu lượng lớn plasmid Các plasmid thu đem xử lý với enzyme giới hạn EcoRI HindIII nhằm thu nhận đoạn gen legumain có đầu dính enzyme giới hạn Kết thể hình 3.2 1000bp Legumain (900bp) 750bp Hình 3.2: Điện di pBT-legumain trước sau cắt EcoRI HindIII Giếng 1: Thang DNA chuẩn (Fermantas) Giếng 2: pBT-legumain gốc Giếng 3: pBT-legumain sau cắt với enzyme giới hạn Qua hình 3.2 ta thấy giếng có băng đậm sáng chiều dài pBT-legumain Có băng plasmid tồn hai dạng xoắn siêu xoắn, siêu xoắn tốc độ di chuyển nhanh Ở giếng có băng thêm băng so với giếng 3, điều sau sử dụng enzyme cắt xuất Khoa Công nghệ Sinh học 44 Viện Đại Học Mở Hà Nội Vũ Văn Trường K14 – Lớp 07 - đoạn gen Kích thước đoạn gen khoảng 900bp, đoạn gen mã hóa legumain Tuy nhiên để thu đoạn gen này, tiến hành tinh thu đoạn gen từ gel agarose 3.1.2 Kết tinh đoạn gen mã hóa legumain từ agarose Tồn sản phẩm cắt điện di agarose, cắt băng gel chứa đoạn gen legumain tiến hành tinh sử dụng kit hãng Fermantas Sản phẩm sau tinh điện di kiểm tra gel Kết điện di đoạn gen mã hóa legumain trình bày hình 3.3 1000bp Legumain (900bp) 750bp Hình 3.3: Kết điẹn di kiểm tra gen mã hóa legumain sau tinh từ gel agarose Đường chạy 1: Chỉ thị phân tử DNA (Fermentas) Đường chạy 2: gen legumain Khoa Công nghệ Sinh học 45 Viện Đại Học Mở Hà Nội Vũ Văn Trường K14 – Lớp 07 - Kết điện di trên agarose cho thấy đường chạy số có băng, có kích thước khoảng 900bp, có độ tinh cao đảm bảo cho thí nghiệm 3.1.3 Kết xử lý vector biểu pET-32c(+) với enzyme EcoRI HindIII Vector biểu pET-32c(+) đồng thời xử lý với enzyme giới hạn EcoRI HindIII tạo đầu dính bổ sung với gen legumain Kết thể hình 3.4 Hình 3.4: Kết cắt kiểm tra vector pET32c+ với enzyme giới hạn EcoRI HindIII Giếng pET-32c(+) gốc không xử lý với enzyme Giếng pET-32c(+) sau xử lý với enzyme giới hạn EcoRI HindIII Ở hình 3.4 giếng có hai băng sáng plasmid tồn hai dạng xoắn siêu xoắn, giếng thứ có băng sau sử lý enzyme EcoRI HindIII plasmid chuyển thành dạng thẳng Như vậy, cắt thành công vector biểu pET-32c(+) đảm bảo cho phản ứng Khoa Công nghệ Sinh học 46 Viện Đại Học Mở Hà Nội Vũ Văn Trường K14 – Lớp 07 - 3.2 Kết gắn đoạn gen mã hóa legumain vào vector biểu pET32c(+) Phản ứng gắn đoạn gen mã hóa legumain vào vector pET-32c(+) xử lý enzyme EcoRI HindIII thực nhờ T4-ligase bảng 3.1 Bảng 3.1: Thành phần phản ứng gắn gen mã hóa legumain vào pET-32c(+) Thành phần Thể tích (l) Buffer T4 T4 ligase Gen mã hóa legumain Vector pET-32c(+) Tổng thể tích 10 Hỗn hợp phản ứng ủ 16C qua đêm Dưới tác dụng enzyme nối đoạn gen mã hóa legumain dễ dàng gắn vào vector pET-32c(+) để tạo vector tái tổ hợp Tuy nhiên, tổng phản ứng gắn kết có nhiều trường hơp xảy ra, để chọn dòng vector biểu tái tổ hợp pET-32c(+)/legumain tiến hành biến nạp sản phẩm gắn kết chọn dòng 3.3 Kết chọn dòng vector tái tổ hợp pET-32c(+) mang gen legumain 3.3.1 Kết biến nạp sản phẩm gắn kết pET-32c(+) gen legumain Sản phẩm lai biến nạp vào tế bào khả biến E.coli chủng DH5 nhờ sốc nhiệt 42C 60 giây nuôi môi trường LB nhiệt độ 37C Nhờ máy tổng hợp vi khuẩn, plasmid tái tổ hợp tạo với số lượng lớn Đem cấy trải 100l đĩa Petri có bổ sung Ampiclilin (25 Khoa Cơng nghệ Sinh học 47 Viện Đại Học Mở Hà Nội Vũ Văn Trường K14 – Lớp 07 - mg/ml) nồng độ cuối 50 l/ml Sau nuôi qua đêm 37C đĩa Petri xuất nhiều khuẩn lạc màu trắng (Hình 3.5) Hình 3.5: Đĩa Petri chứa khuẩn lạc sau biến nạp Kết biến nạp thu nhiều khuẩn lạc trắng, nhiên để chọn khuẩn lạc chứa vector biểu tái tổ hợp mang gen legumain tiến hành PCR trực tiếp từ khuẩn lạc để chọn dòng 3.3.2 Kết PCR từ khuẩn lạc chọn dòng vector pET-32c(+)/legumain Chúng tiến hành chọn khuẩn lạc làm khuôn cho phản ứng PCR với cặp primer T7F/R Kết thu được điện di kiểm tra gel agarose (Hình 3.6) Khoa Cơng nghệ Sinh học 48 Viện Đại Học Mở Hà Nội Vũ Văn Trường K14 – Lớp 07 - 5 2000bp 1600bp 1500bp Hình 3.6 Kết PCR từ 10 khuẩn lạc trắng chọn dòng vector tái tổ hợp pET32c(+) mang gen legumain Giếng 1: Thang DNA chuẩn (Fermantas) Giếng 6: Sản phẩm PCR từ khuẩn lạc 1-5 Kết PCR chọn dòng trực tiếp từ khuẩn lạc (Hình 3.6) cho thấy tất sản phẩm PCR xuất băng sáng đậm có kích thước tổng kích thước gen legumain phần vector pET-32c(+) nằm vùng primer T7F T7R Chúng tơi nhận thấy khuẩn lạc chọn mang plasmid tái tổ hợp pET-32c(+) chứa gen legumain Chúng chọn khuẩn lạc khuẩn lạc số để nuôi cấy tách chiết plasmid tái tổ hợp Để kiểm tra gen gắn vào vector pET-32c(+) có chắn gen legumain hay khơng, gen gắn vào vector có chiều khớp khung đọc hay không, tiến hành giải trình tự plasmid với cặp primer T7F/R 3.6 Kết tách dịng xác định trình tự legumain Khoa Công nghệ Sinh học 49 Viện Đại Học Mở Hà Nội Vũ Văn Trường K14 – Lớp 07 - Sau tiến hành xác định trình tự vùng gen ngoại lai gắn vào vector pET32c(+) với cặp primer T7F/R, thu kết sau: 51 101 151 201 251 301 351 401 451 501 551 601 651 701 751 801 851 901 951 1001 1051 1101 1151 1201 1251 1301 1351 1401 1451 1501 atgagcgata actcaaagcg gtccgtgcaa cagggcaaac tgcgccgaaa acggtgaagt aaagagttcc ccatcatcat aagaaaccgc ctgggtaccg TCTGATCAAC ACTACACTGG GGCGATGCAG TGGCCCCCAG GAATACTGGT ACCATCCATT CATTGAAGCC TCAATGTTTA TGTTACTATG CAACTGGATG ACAAGCAGTA CAGTATGGAA TATGAAACGC TTGACCTCAC CTGATGAACA CCAGCGGCAT TCGTCTCCTT GAGAGAGCCC CTTCCGGACC ctgagatccg ccaccgctga aaattattca gacggggcga aatgatcgcc tgaccgttgc tatggcatcc ggcggcaacc tcgacgctaa catcattctt tgctgctaaa acgacgacga AGGCCCAATG AGAGGATGTT AAGCAGTGAA GATCACGTGT TTTTCCCAAT ACATGTACAA TGTGAGTCTG TGCAACTACT ATGAGAAGAG GAAGACTCGG CCACCTGGTA ACAAAACAAT AAAGCCAGTT CCCCAGCCCT CCAATGATCT CTGGATGCCA GCTGGCAGCG CGCTCACGGG CAAAGCTTgc gctgctaaca gcaataacta cctgactgac tcctcgtcga ccgattctgg aaaactgaac gtggtatccc aaagtgggtg cctggccggt ctggtctggt ttcgaacgcc caaggccatg GCACAGATGT ACCCCACAAA GGGCATAGGA TCATTTACTT GAAGATCTTC ACACAAAATG GGTCCATGAT GCTGCCAACC GTCCACGTAC ACGTGGAAGA AAATCGCACA CTCCACCATG CTCCCGTCCC GATGTGCCTC GGAGGAGTCC GGCACCTCAT TCCGAGGCTG GCACAGCTGC ggccgcactc aagcccgaaa g gacagttttg tttctgggca atgaaatcgc atcgatcaaa gactctgctg cactgtctaa tctggttctg gccacgcggt agcacatgga ggatatctgt CTATCAGGGA ATTTCCTTGC TCCGGCAAAG CACTGACCAT ATGTAAAGGA TACCGAAAGA GAACCACCTG CCAGAGAGTC CTGGGGGACT TCTGACTAAA CCAACACCAG AAAGTGATGC CCTACCTCCA TCACCATCAT AGGCAGCTCA TGAGAAGTCA AGGTGGAGCA TACCCAGAGG gagcaccacc ggaagctgag acacggatgt gagtggtgcg tgacgaatat accctggcac ctgttcaaaa aggtcagttg gccatatgca tctggtatga cagcccagat ggatccGAAT GTCCCGAAGG TGTGTTGAGA TCCTGAAGAG GGATCTACTG CCTGAATGAG TGGTGTTCTA CCGGATAACA GTCCTACGCC GGTACAGCGT GAGACCCTGC CCACGTCATG AGTTTCAGGG GTCACACACC GAAAAGGAAA CGGAGGAGAT GTGCGTAAGA GCTCCTGTCC CCCTGCTGCA accaccacca ttggctgctg 50 Viện Đại Học Mở Hà Nội *Ảnh Chromas kết sequence Khoa Công nghệ Sinh học Vũ Văn Trường Khoa Công nghệ Sinh học K14 – Lớp 07 - 51 Viện Đại Học Mở Hà Nội Vũ Văn Trường K14 – Lớp 07 - Sau xử lý trình tự, chúng tơi thu trình tự amino acid sau: 51 101 151 201 251 301 351 401 451 501 MSDKIIHLTD QGKLTVAKLN KEFLDANLAG LGTDDDDKAM GDAEAVKGIG TIHYMYKHKM CYYDEKRSTY QYGNKTISTM LMNTNDLEES ERAPLTGHSC PPLSNN* DSFDTDVLKA IDQNPGTAPK SGSGHMHHHH GYLWIRILIN SGKVLKSGPQ YRKMVFYIEA LGDWYSVNWM KVMQFQGMKR RQLTEEIQRH YPEALLHFRT DGAILVDFWA YGIRGIPTLL HHSSGLVPRG RPNGTDVYQG DHVFIYFTDH CESGSMMNHL EDSDVEDLTK KASSPVPLPP LDARHLIEKS QSLRPHSSTT EWCGPCKMIA LFKNGEVAAT SGMKETAAAK VPKDYTGEDV GSTGILVFPN PDNINVYATT ETLHKQYHLV VTHLDLTPSP VRKIVSLLAA TTTTEIRLLT PILDEIADEY KVGALSKGQL FERQHMDSPD TPQNFLAVLR EDLHVKDLNE AANPRESSYA KSHTNTSHVM DVPLTIMKRK SEAEVEQLLS KPERKLSWLL Từ trình tự amino acid thu chúng tơi khẳng định thiết kế thành công vector biểu mang gen mã hoá cho proteinase legumain, gen legumain chèn vào vector chiều khớp khung đọc đảm bảo cho trình phiên mã dịch mã sau Khoa Công nghệ Sinh học 52 Viện Đại Học Mở Hà Nội Vũ Văn Trường K14 – Lớp 07 - KẾT LUẬN Đã thiết kế thành công vector biểu đoạn gen mã hóa legumain Đoạn gen gắn vào vector pET-32c(+) vào vị trí nhận biết enzyme giới hạn EcoRI HindIII KIẾN NGHỊ Tiếp tục nghiên cứu biểu gen mã hóa legumain hệ biểu hợp lý Nghiên cứu để tối ưu hóa q trình biểu tinh chế legumain phục vụ cho nghiên cứu Khoa Công nghệ Sinh học 53 Viện Đại Học Mở Hà Nội Vũ Văn Trường K14 – Lớp 07 - TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT Nguyễn Hữu Chấn, 1983 Enzyme xúc tác Sinh học Nxb Y học, Hà Nội Phạm Thị Trân Châu, Trần Thị Áng, 2000 Hóa sinh học Nxb Giáo dục, Hà Nội Đỗ Ngọc Liên, Phạm Thị Trân Châu, 1972 Enzyme I, II Đại học Tổng hợp, Hà Nội Nguyễn Tiến Thắng, Nguyễn Đình Huyên, 1998 Giáo trình sinh hóa đại Nxb Giáo dục, Hà Nội Nguyễn Xuân Thắng, Đào Kim Chi, Phạm Quang Tùng, Nguyễn Văn Đồng, 2004 Hóa sinh học Nxb Y học, Hà Nội Lê Ngọc Tú, La Văn Chứ, Phạm Trân Châu, Nguyễn Lân Dũng, 1982 Enzyme vi sinh vật Nxb KH&KT, Hà Nội Lê Ngọc Tú (chủ biên), Lê Văn Chứ, Đặng Thị Thu, Phạm Quốc Thăng Nguyễn Thị Thịnh, Bùi Đức Hợi, Lưu Duẫn, Lê Doãn Diên, 2000 Hóa sinh Cơng nghiệp, Nxb KH&KT, Hà Nội Khuất Hữu Thanh, 2006 Cơ Sở Di Truyền Phân Tử Kỹ Thuật Gen.Nxb Khoa Học Kỹ thuật, Hà Nội Hồ Huỳnh Thùy Dương (2003), Sinh học phân tử, Nxb Giáo dục 10 PGS-TS Phan Tuấn Nghĩa (2004), Bài giảng Các kĩ thuật công nghệ sinh học, 11 Quyền Đình Thi, Nơng Văn Hải (2008), Những kỹ thuật PCR ứng dụng phân tích DNA, Nxb Khoa học tự nhiên công nghệ Khoa Công nghệ Sinh học 54 Viện Đại Học Mở Hà Nội Vũ Văn Trường K14 – Lớp 07 - TÀI LIỆU TIẾNG ANH 12 Barrett, A J., and Rawlings, N D (1996) Perspect Drug Discov Design 6, 1-11 13 Kembhavi, A A., Buttle, D J., Knight, C G., and Barrett, A J (1993) Arch Biochem Biophys 303, 208-213 14 Dalton, J.P., Hola-Jamriska, L., and Brindley, P J (1995) Parasitology 111, 575-580 15 Sanger, F., Nicklen, S., and Coulson, A R (1977) Proc Natl.Acad.Sci.U S A 74, 5463-5467 16 Capranico G, Supino R, Binaschi M, et al Influence of structural modifications at the 3’ and 4’ positions of doxorubicin on the drug ability to trap topoisomerase II and to overcome multidrug resistance Mol Pharmacol 1994;45:908-15 17 Alonso, J M., and Granell, A (1995) Plant Physiol 109, 541-547 18 Capranico G, Zunino F, Kohn KW, Pommier Y Sequence-selective topoisomerase II inhibition by anthracycline derivatives in SV 40 DNA; relationship with DNA binding affinity and cytotoxicity Biochemistry 1990;29:562-9 19 Yano M, Hirai K, Naito Z, et al Expression of cathepsin B and cystatin C in human breast cancer Surg Today 2001;31:385-9 20 Kembhavi AA, Buttle DJ, Knight CG, Barrett AJ The two cysteine endopeptidases of legumain seeds; purification and characterization by use of specific fluorometric assays Arch Biochem Biophys 1993;303:208-13 Khoa Công nghệ Sinh học 55 Viện Đại Học Mở Hà Nội Vũ Văn Trường K14 – Lớp 07 - 21 Chen JM, Đano PM, Rawlings ND, et al Cloning, isolation, and characterization of mammalian legumain, an asparaginyl endopeptidase J Biol Chem 1997;272: 8090-8 22 Liu C, Sun C, Huang H, Janda K, Edgington T Overexpression of legumain in tumors is significant for invasion/metastasis and a candidate enzymatic target for product therapy Cancer Res 2003;63:2957-64 23 Alvarez-Fernandez M, Brrett AJ, Gerhartz B, Dando PM, Ni J, Abrahamson M Inhibition of mammalian legumain by some cystatine is due to a novel second reactive site J Biol Chem 1999;274:19195-203 24 Jing-May Chen, Pam M Dando, Neil D Rawlings, Molly A Brown, Nina E.Young…(Cloning, Isolation, and Characterization of Mammalian Legumain, an Asparaginyl Endopeptidase ), 1996 25 SAMBROOK J AND RUSSELL WD (2001) Molecular cloning: A laboratory manual, 3rd, ed Cold spring harbor laboratory press, cold spring habor NY 26 DNA extraction kit manual (QUIAGEN) Khoa Công nghệ Sinh học 56 Viện Đại Học Mở Hà Nội ... chứa đoạn gen mã hóa legumain vector chứa biểu pET-32c(+), quy trình thiết kế vector biểu mang gen mã hóa legumain tiến hành sau: • Bước 1: Cắt tinh đoạn gen mã hóa legumain vector biểu pET-32c(+)... Lớp 07 - đoạn gen Kích thước đoạn gen khoảng 900bp, đoạn gen mã hóa legumain Tuy nhiên để thu đoạn gen này, tiến hành tinh thu đoạn gen từ gel agarose 3.1.2 Kết tinh đoạn gen mã hóa legumain từ... đoạn gen mã hóa legumain (900bp) Đồng thời vector pET-32c(+) cắt mở vòng với EcoRI HindIII Sau đó, sử dụng enzyme nối T4-ligase để nối đoạn gen mã hóa legumain với vector pET32c(+) tạo vector