Lun Thc s Sinh hc Mở đầu Hàng năm, giới Việt Nam, vụ ngộ độc thực phẩm không ngừng gia tăng Nguyên nhân gây ngộ độc thực phẩm đợc xác định vi sinh vật gây bệnh yếu tố độc (độc tố nấm hay thuốc trừ sâu có rau ) Các vi sinh vật gây bệnh có khả sinh trởng, phát triển tốt loại thực phẩm nh thịt lợn, thịt gia cầm, trứng, hải sản sản phẩm sữa Ngộ độc thực phẩm ảnh hởng trực tiếp đến sức khỏe tính mạng ngời, đồng thời gây tác động không nhỏ đến kinh tế, trị quốc gia Chính thế, vấn đề bảo quản lơng thực, thực phẩm đợc đặt lên hàng đầu sách kinh tế, sức khỏe cộng đồng quốc gia, đặc biệt bảo quản tránh khỏi vi sinh vật gây bệnh Để khắc phục hạn chế phơng pháp bảo quản thực phẩm truyền thống (bảo quản theo phơng pháp hóa học, vật lý), nhà khoa học giới đà nghiên cứu, ứng dụng chất bảo quản sinh học không độc hại gọi chung bacteriocin Đây peptit có hoạt tính kháng khuẩn, đặc biệt an toàn, không gây tác dụng phụ sử dụng bị phân cắt nhanh chóng protease đờng tiêu hóa ngời Nhiều bacteriocin đà đợc nghiên cứu nhng có nisin pediocin PA-1/AcH đợc thơng mại hóa, sử dụng công nghệ thực phẩm dới dạng bột Do đó, việc nghiên cứu tìm bacteriocin an toàn, ứng dụng bảo quản thực phẩm cần thiết Enterocin bacteriocin đợc tạo từ chi vi khuẩn Enterococcus phong phú đa dạng, có đặc tính đáng quan tâm chế biến, bảo quản thực phẩm Điển hình Page of 116 Lun văn Thạc sĩ Sinh học lµ enterocin AS-48 - mét bacteriocin cấu trúc dạng vòng, có phổ ức chế rộng vi khuẩn gram dơng gram âm Những đặc trng khác AS-48 nh tính ổn định, bền nhiệt tính tan tiêu biểu phạm vi pH rộng (thích hợp với nhiều loại thực phẩm) hứa hẹn lựa chọn thay cho chất bảo quản hãa häc t¬ng lai Tõ tÝnh u viƯt cđa enterocin, đặc biệt enterocin AS-48 bảo quản nhiều loại thực phẩm, nhà khoa học đà nghiên cứu nhằm thu lợng lớn peptit với mong muốn sử dụng thành thơng phẩm Vấn đề gặp phải chủng vi khuẩn Enterococcus có khả sinh enterocin thờng tiết độc tố Việc lên men thu hồi sản phẩm theo tiêu chuẩn để sử dụng thực phẩm gặp nhiều khó khăn đạt hiệu suất thấp Do đó, việc tập trung nghiên cứu tạo enterocin tái tổ hợp khắc phục hạn chế mà chủ động đợc nguồn enterocin Enterocin AS-48 hoàn toàn đợc tổng hợp đờng tái tổ hợp biết trình tự ADN gen mà hóa cho AS-48 mà không cần phải phân lập từ chủng tự nhiên Nh vậy, enterocin AS-48 đợc tổng hợp với hiệu suất cao đờng tái tổ hợp nhờ vi khuẩn E coli Từ thực trạng trên, đà tiến hành đề tµi: “Tổng hợp biểu gen m· hãa cho enterocin AS-48 vi khuẩn Enterococcus faecium tế bào Escherichia coli ER2566 nhằm mục đích tổng hợp enterocin AS-48 tái tổ hợp để ứng dụng làm chất bảo quản nông sản, thực phẩm sinh học Công trình đợc thực phòng Kỹ thuật Di truyền, Viện Công nghệ Sinh học, Viện Khoa học Công nghệ Việt Nam Page of 116 Luận văn Thạc sĩ Sinh hc chơng Tổng quan tài liệu 1.1 tổng quan vỊ Bacteriocin 1.1.1 Giíi thiƯu chung 1.1.1.1 Ngé ®éc thực phẩm Mặc dù ngời đà sử dụng công nghệ bảo quản thực phẩm an toàn (vÝ dơ: HACCP - hƯ thèng kiĨm so¸t rđi ro vệ sinh an toàn thực phẩm mang tính phòng ngừa) chế biến bảo quản nhng ca ngộ độc thực phẩm không ngừng gia tăng Error: Reference source not found Các hóa chất, kim loại nặng, ký sinh trùng, nấm, virus vi khuẩn gây ngộ độc thực phẩm Trong đó, vi khuẩn nguyên nhân phổ biến với 90% ca ngộ độc thực phẩm hàng năm, chủ yếu Staphylococcus aureus, Salmonella, Clostridium botulinum, Clostridium perfringens, Campylobacter jejuni, Listeria monocytogenes, Page of 116 Vibrio parahaemolyticus, Bacillus cereus, Luận văn Thạc sĩ Sinh học Toxoplasma gondii vµ Escherichia coli O157:H7 6., Error: Reference source not found Trêng hỵp nhẹ hậu rối loạn tiêu hóa, cân điện giải, kiệt sức, trờng hợp nặng dẫn đến tử vong không chữa trị kịp thời, cách Do đó, an toàn thực phẩm vấn đề quan tâm hàng đầu quốc gia mà trọng tâm bảo quản thực phẩm phòng tránh vi sinh vật gây bệnh 6. Theo uỷ ban Khoa học Công nghệ Hoa Kỳ, ớc tính hàng năm nớc có khoảng 76 triệu ca ngộ độc thực phẩm, gây 5000 ca tử vong Thực phẩm thịt lợn, thịt gia cầm, trứng, hải sản sản phẩm sữa, tiêu tốn từ 6,5-34,9 tỷ đô la Error: Reference source not found Các mầm bệnh thực phẩm nh Listeria spp có khả chịu nhiệt độ thấp nồng độ muối cao, gây 2500 vụ ngộ độc thực phẩm với 500 ca tư vong chØ riªng ë Hoa Kú 12. ë Việt Nam, hàng năm có hàng nghìn ca ngộ độc thực phẩm, gây tổn thất sức khỏe kinh tế Trong năm 2008, tính đến tháng 7, đà có 106 vụ ngộ độc thực phẩm, gần 5000 ngời mắc 43 ngời đà bị tử vong Bởi vậy, chất bảo quản thực phẩm an toàn vô quan trọng 1., 12. Cùng với gia tăng nhu cầu thực phẩm tự nhiên an toàn hơn, ngời cần công nghệ bảo quản để ngăn ngừa h hỏng nhiễm độc thực phẩm Các cách truyền thống đà đợc thay công nghệ mới, cải tiến nh khử trùng nhẹ nhiệt, giảm không khí, đóng gói chân không, áp suất thuỷ tĩnh cao, chiếu tia tử ngoại sử dụng chất kháng khuẩn tự nhiên - bacteriocin 6., Error: Reference source not found ViƯc sư dơng bacteriocin kết hợp với xử lý hoá lý chất bảo quản hoá học biện pháp hiệu để Page of 116 Lun Thc s Sinh hc đảm bảo hàm lợng dinh dỡng nguyên liệu thô thực phẩm, kéo dài thời gian bảo quản, kìm hÃm vi khuẩn làm hỏng, gây bệnh 2. 1.1.1.2 Bacteriocin Bacteriocin đợc Gratia phát lần năm 1925 với tên principe V bắt nguồn từ chủng E coli có khả chống lại chủng E coli khác môi trờng nuôi cấy Thuật ngữ colicin Gratia Fredericq đặt năm 1946 Ngày nay, colicin đợc dùng cho protein kháng khuẩn từ loài E coli có quan hƯ gÇn víi Enterobacteriaceae Error: Reference source not found Năm 1953, Jacob CS đà đặt tên cho protein có hoạt tính kháng khuẩn đặc hiệu cao bacteriocin Thuật ngữ bacteriocin đợc giải thích đơn giản Tơng tù “ase” sư dơng enzyme, tiÕp tè “cin” dïng để biểu thị hoạt tính tạo bacteriocin Tiếp tố cin đợc viết thêm vào tên chi (hay tên loài) Colicin đợc phân lập từ E coli, monocins từ L monocytogenes, subtilin đợc tạo Bacillus subtilis, staphylocin từ S aureus nhiều loại khác Các chữ theo thứ tự tìm đợc viết sau tên bacteriocin để phân biệt với bacteriocin từ chủng khác loài Ví dụ, lactacin F bacteriocin thứ đợc tìm từ loài Lactobacilli 34. Trong tự nhiên, vi sinh vật có khả tạo hợp chất khác nhằm hạn chế chống lại vi sinh vật khác 44., 60. Các hợp chất đợc biết đến nh kháng sinh, sản phẩm trao đổi chất thứ cấp nh axit lactic, yếu tố phân giải nh lysozym, dạng exotoxin protein bacteriocin Bacteriocin đợc tổng hợp vi khuẩn gặp điều kiện ức chế - tác động môi trêng Page of 116 Luận văn Thạc sĩ Sinh hc sống, cạnh tranh nguồn dinh dỡng, không gian Các bacteriocin có hoạt tính kháng khuẩn cao thËm chÝ ë nång ®é rÊt thÊp 69. Hä bacteriocin gồm protein đa dạng mặt kích thớc, vi khuẩn đích, dạng hoạt động chế miễn dịch Hiện nay, có hàng trăm loại bacteriocin Những bacteriocin đợc tìm thấy hầu hết vi khuẩn, gần tìm thấy vi khuẩn cổ - Archaea (gọi Archaeocin) 60. Nhiều nghiên cứu đợc tiến hành với bacteriocin loài vi khuẩn khác cho thấy chúng đợc mà hóa gen plasmid (vÝ dô, Col plasmid E coli) Mét sè đợc mà hóa gen nằm ADN hệ gen, nh plantaracin A vµ sakacina 674, cã trờng hợp đợc xác định transposon nh nisin 69. Vì có hoạt tính kháng khuẩn nên trớc đây, bacteriocin bị nhầm lẫn nh chất kháng sinh Năm 1965, Reeves CS đà tìm kh¸c biƯt cđa bacteriocin víi c¸c chÊt kh¸ng sinh bëi đặc điểm đặc trng: Bacteriocin có chất protein Chính khác biệt đà tạo nên đặc tính u viƯt cđa bacteriocin øng dơng b¶o qu¶n thùc phẩm 34. Sự tranh luận nên đợc đặt vào bối cảnh khám phá nisin năm 1924, trớc penicillin colicin Khi chất kháng khuẩn protein bị xem chất kháng sinh Chất kháng sinh đợc t¹o bëi mét nhãm h¹n chÕ vi sinh vËt, sản phẩm trao đổi chất bậc hai Các chất chức rõ ràng sinh trởng sinh sản thân vi khuẩn, đợc tiết dễ dàng khỏi tế bào 60. Khi khám phá cÊu tróc nisin cã chøa mét sè axit amin nh de-hydroalanin, dehydrobuterin cầu lanthion sulfur đơn, nisin không đợc xem protein riboxom không Page of 116 Luận văn Thạc sĩ Sinh hc tạo axit amin (kể chất tơng đồng với nisin nh subtilin epidermin) Chỉ đến Hansen CS (1990) phát rằng, nisin thực tế đợc tạo riboxom qua trình khử nớc axit amin hình thành cầu lanthion diễn sau dịch mÃ, nisin đợc công nhận bacteriocin Sự có mặt gen riêng rẽ tổng hợp bacteriocin xác nhận chúng protein peptit thực Nh vậy, bacteriocin đợc phân biệt để tránh nhầm lẫn liên quan tới chất kháng sinh y học - gây dị ứng bị cấm sử dụng thực phẩm ngời Đặc điểm khác biệt là: Bacteriocin đợc tổng hợp riboxom, chất chuyển hóa Do có chất protein (thử nghiệm với enzyme phân giải protein nh trypsin, -chymotrypsin pepsin) 4. nên bacteriocin không gây tác dụng phụ bị phân cắt nhanh chóng protease đờng tiêu hóa ngời Bacteriocin có phổ kháng khuẩn tơng đối hẹp, đợc tiết vào môi trờng để ức chế sinh trởng vi khuẩn hay bào tử, tiêu diệt vi khuẩn quan hệ gần gũi với chủng sản xuất Các tế bào sản xuất miễn dịch với hoạt tính bacteriocin Các bacteriocin có dạng hoạt động kháng khuẩn khác với kháng sinh Các đặc điểm đợc tỉng kÕt b¶ng 12., Error: Reference source not found Bảng Sự khác bacteriocin kháng sinh Các đặc điểm Bacteriocins Các kháng sinh ứng dụng Thực phẩm Tổng hợp Riboxom (sản phẩm chuyển Sản Ho¹t tÝnh Page of 116 Y häc phÈm hãa bËc 1) chun hãa bËc Phỉ hĐp Phỉ réng Luận văn Thạc sĩ Sinh học MiƠn dÞch tÕ bào Có Không chủ Sự có mặt Có mặt Vắng mặt tế bào miễn dịch tế bào chủ Dạng hoạt động Hầu hết qua hình thành lỗ Màng tế bào hay nhng tác động lên đích nội bào tổng hợp sinh học thành tế bào ảnh hởng độc lên tế Không Có bào nhân chuẩn 1.1.2 Phân loại bacteriocin Có nhiều tiêu chuẩn phân loại bacteriocin: Theo đặc điểm cấu trúc, khối lợng phân tử, phổ kháng khuẩn, sinh vật sản xuất 56., 59. Riley CS (2007) đà chia bacteriocin thành hai nhóm lớn theo vi khuẩn gram dơng gram âm Bacteriocin vi khuẩn gram dơng phong phú đa dạng vi khuẩn gram âm Chúng phân biệt với bacteriocin gram âm theo hai sở Thứ nhất, trình tạo bacteriocin không cần giết chết thân nh vi khuẩn gram âm Đây chế vận chuyển, giải phóng bacteriocin ë vi khuÈn gram d¬ng Mét sè tham gia vào hệ thống vận chuyển đặc hiệu bacteriocin, số khác tham gia vào đờng vận chuyển phụ thuộc chuỗi tín hiệu (signal sequences dependent export pathway) Thứ hai, vi khuẩn gram dơng tạo trình điều hòa đặc hiệu bacteriocin, Page of 116 Luận văn Thạc sĩ Sinh học c¸c bacteriocin tõ vi khuẩn gram âm phụ thuộc vào hệ thống điều hòa tế bào chủ 60. 1.1.2.1 Bacteriocin từ vi khuẩn gram âm Các bacteriocin tạo từ vi khuẩn gram âm protein kích thớc lớn Hơn 30 loại bacteriocin từ E coli đà đợc xác định Tuy nhiên, đến yếu tố ảnh hởng đến trình tạo bacteriocin đa dạng chúng cha hoàn toàn rõ ràng Những hiểu biết cần thiết, không giúp phân loại quần thể vi khuẩn môi trờng tự nhiên mà để giải vấn đề ứng dụng 60. Đại diện tiêu biểu cho bacteriocin từ vi khuẩn gram âm colicin với phổ kháng khuẩn hẹp hoạt động thông qua tơng tác với thụ thể đặc hiệu màng tế bào đích Colicin có cụm gen phân bố plasmid đợc xếp thành gen colicin mà hóa cho protein gây độc, gen miễn dịch mà hóa cho protein chịu trách nhiệm miễn dịch đặc hiệu với tế bào sản xuất (bằng cách gắn bất hoạt protein gây độc) gen phân giải mà hóa cho protein tham gia vào việc giải phóng colicin thông qua phân giải tế bào chủ 12., 60. Sự tạo colicin đợc thông qua đơn vị điều hòa SOS (SOS regulon - dạng phản ứng vi khuẩn với h hại ADN, đó, gen lexA recA có vai trò chủ chốt giúp điều hòa chuỗi phản ứng SOS) 35., 73. đó, đợc tạo chủ yếu dới điều kiện ức chế Colicin tiêu diệt vi khuẩn qua chế khác nhau, cách ngăn chặn tổng hợp thành tế bào, tăng tính thấm màng tế bào đích hình thành lỗ hay hoạt hoá hoạt động nuclease 60. Phân loại bacteriocin vi khuẩn gram âm Page of 116 Luận văn Thạc sĩ Sinh hc Các bacteriocin từ vi khuẩn gram âm đợc đặt tên theo chi, loài sản xuất, nh klebicin Klebsiella pneumoniae hay theo loµi nh colicin cđa E coli, marcescin cđa Serratia marcescens, alveicins cđa Hafnia alvei vµ cloacins cđa Enterobacter cloacae) 60. Bacteriocin tõ vi khuÈn gram ©m cã thể đợc phân thành ba nhóm dựa vào kích thớc: Nhãm - Colicin kÝch thíc lín (25-80 kDa), nhãm - Các microcin kích thớc nhỏ (