Trong nghiên cứu này đã tạo dòng và biểu hiện thành công gene mã hóa kháng nguyên P42 của Mycoplasma hyopneumoniae phân lập từ mẫu phổi của lợn thu thập tại tỉnh Thừa Thiên Huế, Việt Nam. Gene mã hóa cho kháng nguyên P42 được tạo dòng và biểu hiện bởi vector pET200/DTOPO trong tế bào Escherichia coli BL21 (DE3).
KHOA HỌC KỸ THUẬT THÚ Y TẬP XXVIII SỐ - 2021 TẠO DÒNG VÀ BIỂU HIỆN GEN MÃ HÓA KHÁNG NGUYÊN P42 TỪ MYCOPLASMA HYOPNEUMONIAE TRONG ESCHERICHIA COLI (BL21) Nguyễn Thanh Thủy1, Đinh Thị Bích Lân1*, Lê Viết Quân2, Phùng Thăng Long1 *Email: thuhuong@huaf.edu.vn TÓM TẮT Trong nghiên cứu chúng tơi tạo dịng biểu thành cơng gene mã hóa kháng ngun P42 Mycoplasma hyopneumoniae phân lập từ mẫu phổi lợn thu thập tại tỉnh Thừa Thiên Huế, Việt Nam Gene mã hóa cho kháng nguyên P42 được tạo dòng và biểu bởi vector pET200/DTOPO tế bào Escherichia coli BL21 (DE3) Gene mã hóa kháng ngun P42 tạo dịng có chiều dài 1119 bp, mã hóa mợt ch̃i polypeptide dài 372 axit amin, tương đồng 100% so với trình tự chuỗi polypeptide Mycoplasma hyopneumoniae 7448 (từ vị trí amino acid thứ 229 đến 600) công bố GenBank (mã số AAZ53444.1) Kết điện di SDS-PAGE cho thấy protein tái tổ hợp 6xHis-P42 có khối lượng phân tử khoảng 44 kDa Kết kiểm tra tính đặc hiệu protein tái tổ hợp cho thấy protein tái tổ hợp 6xHis-P42 có kết hợp đặc hiệu với kháng thể có huyết lợn nhiễm Mycoplasma hyopneumoniae Từ khóa: Mycoplasma hyopneumoniae, P42, tạo dòng, biểu hiện, kháng nguyên tái tổ hợp Cloning and expression of gene encoding p42 antigen from Mycoplasma hyopneumoniae in Escherichia coli (bl21) Nguyen Thanh Thuy, Dinh Thi Bich Lan, Le Viet Quan, Phung Thang Long SUMMARY In this study, we successfully cloned and expressed of gene encoding P42 antigen of Mycoplasma hyopneumoniae isolated from lung samples from pigs raised in Thua Thien Hue province, Vietnam The gene encoding P42 antigen was cloned and expressed with vector pET200/D-TOPO in Escherichia coli BL21 (DE3) cells The cloned fragment of gene encoding P42 antigen has a length of 1119 bp, encoding a polypeptide chain with 372 amino acid residues, and 100% similarity to the polypeptide chain of Mycoplasma hyopneumoniae 7448 in GenBank (accession number: AAZ53444.1) Results of SDS-PAGE electrophoresis showed that molecular weight of 6xHis-P42 recombinant protein is about 44 kDa Results of testing the specificity of the recombinant protein showed that the recombinant protein 6xHis-P42 had a specific linkage with antibodies in the serum of pigs infected with Mycoplasma hyopneumoniae Keywords: Mycoplasma hyopneumoniae, P42, cloning, expression, recombinant protein Trường Đại học Nông lâm, Đại học Huế Học viên Thạc sĩ Đại học Okayama, Nhật Bản KHOA HỌC KỸ THUẬT THÚ Y TẬP XXVIII SỐ - 2021 I ĐẶT VẤN ĐỀ Mycoplasma hyopneumoniae (M hyopneumoniae) là vi khuẩn gây bệnh suyễn (hay còn gọi là bệnh viêm phổi địa phương) lợn Đây bệnh hơ hấp mãn tính ảnh hưởng đến lợn toàn giới [3], [11] Đặc trưng bệnh tỉ lệ mắc bệnh cao, tỉ lệ chết thấp Tuy nhiên, thiệt hại bệnh gây lớn do: lợn bị bệnh thường cịi cọc, chậm lớn, lớn khơng đồng đều, tiêu tốn thức ăn cao, thời gian vỗ béo kéo dài dẫn đến giảm suất thịt lợi nhuận [1] Mặt khác, M hyopneumoniae công vào đường hô hấp lợn, làm tổn thương hệ thống lông rung đường hơ hấp, thúc đẩy q trình xâm nhập và tạo điều kiện cho kết hợp M hyopneumoniae với loại vi khuẩn khác [2] Bệnh chẩn đoán sơ vào số triệu chứng bệnh tích đặc trưng, nhiên chẩn đốn phịng thí nghiệm để xác định M hyopneumoniae thực có ý nghĩa giám sát dịch bệnh Hiện nay, tiêm chủng xem chiến lược tiết kiệm chi phí để kiểm sốt phịng ngừa bệnh [7] Các loại vaccine bất hoạt có làm giảm tổn thương phổi dấu hiệu lâm sàng cho lợn tiêm chủng, cải thiện tăng trọng hàng ngày hệ số chuyển hóa thức ăn, vaccine cung cấp bảo hộ phần không ngăn chặn xâm nhập M hyopneumoniae vào phổi; chi phí sản xuất vaccine cao q trình ni cấy in vitro M hyopneumoniae phức tạp [3], [10] Do đó, việc nghiên cứu vaccine hiệu an tồn tích cực tiến hành, đặc biệt vaccine tiểu đơn vị vaccine DNA tái tổ hợp [9], [11] Trong nghiên cứu trước đây, so sánh trình tự nucleotide cho thấy gen mã hóa P42 phần gen mã hóa P65 Phân tích sâu chứng minh P42 thực protein shock nhiệt biểu với số lượng lớn, phơi bày bề mặt mầm bệnh liên quan đến chế sinh bệnh M hyopneumoniae [5] Nhiều nghiên cứu kết luận P42 có khả sinh đáp ứng miễn dịch cao, ngăn chặn phát triển M hyopneumoniae ứng viên cho nghiên cứu sản xuất vaccine tái tổ hợp [4], [5], [6], [11] Nghiên cứu Galli cộng (2012) kiểm tra khả sinh đáp ứng miễn dịch chuột kháng nguyên tái tổ hợp P37, P42, P46 P95 từ M hyopneumoniae Kết ELISA cho thấy huyết từ chuột tiêm kháng nguyên tái tổ hợp P42 có khả liên kết đặc hiệu với protein nguyên thể từ M hyopneumoniae cao Ngoài ra, kháng nguyên tái tổ hợp P42 kích thích sản sinh IgG2a INF tiêm vào thể chuột Do đó, nghiên cứu này chúng tiến hành nghiên cứu sản xuất kháng nguyên P42 tái tổ hợp, nhằm tạo nguồn nguyên liệu cho các nghiên cứu phát triển vaccine hoặc kháng thể dùng phòng và trị bệnh M hyopneumoniae gây ở lợn Việt Nam II NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu - Các mẫu dịch phổi lợn nghi bị nhiễm M hyopneumoniae - Vector pET200/D-TOPO (Invitrogen), chủng vi khuẩn E coli BL21 (DE3) (Invitrogen) - QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen), EZ-10 Spin Column DNA Gel Extraction Miniprep Kit (Biobasic), Isolate II Plasmid Mini Kit, Bio 52056 (Bioline), ProBond™ Purification System Kit (Thermo Fisher Scientific) 2.2 Nội dung nghiên cứu - Phân lập gene mã hóa kháng nguyên P42 từ mẫu dịch phổi lợn nghi bị nhiễm M hyopneumoniae - Tạo dòng gene mã hóa kháng nguyên P42 - Biểu gene mã hóa kháng ngun P42 - Kiểm tra tính đặc hiệu kháng nguyên tái tổ hợp P42 2.3 Phương pháp nghiên cứu KHOA HỌC KỸ THUẬT THÚ Y TẬP XXVIII SỐ - 2021 * Phương pháp phân lập gene mã hóa kháng nguyên P42 Các mẫu dịch phổi lợn nghi bị nhiễm M hyopneumoniae thu thập từ đàn lợn nuôi địa bàn tỉnh Thừa Thiên Huế DNA tổng số tách chiết tinh từ dịch nuôi tăng sinh vi khuẩn có mẫu phổi Kit QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen), và sử dụng làm nguyên liệu cho phản ứng khuếch đại đoạn gene mã hóa kháng nguyên P42 với cặp mồi đặc hiệu đã được thiết kế nghiên cứu của Galli và cộng sự [6]: - Mồi xuôi P42F: 5’-CACCATGGCGCTTACAAGACTTAA-3’ - Mồi ngược P42R: 5’-TGATTAATCCTGCTTGATTTCAGCAT-3’ Thành phần phản ứng PCR gồm có μL DNA tổng số (30 ng), μL mồi xuôi P42F (10 pmol/μL), μL mồi ngược P42R (10 pmol/μL), μL đệm PCR 10X, μL dNTP (10 pmol/μL), μL Enzyme VELOCITY DNA Polymerase (5 U/μL), nước cất vô trùng vừa đủ 50 μL PCR thực với chu trình luân nhiệt sau: biến tính genome 95°C/5 phút, tiếp đến 30 chu kỳ: 95°C/30 giây, 50°C/30 giây 72°C/60 giây, cuối 72°C/10 phút Sản phẩm PCR kiểm tra điện di agarose gel 1% với thuốc nhuộm ethidium bromide (0,5 µg/l) * Phương pháp tạo dịng gene mã hóa kháng nguyên P42 Sản phẩm PCR sau tinh EZ10 Spin Column DNA Gel Extraction Miniprep Kit (Biobasic) gắn vào vector pET200/DTOPO với thành phần phản ứng gắn bao gồm μL sản phẩm PCR sau tinh (20 ng), μL vector pET200/D-TOPO (20 ng/μL), μL dung dịch muối, nước cất vô trùng để đạt thể tích gắn μL Trộn nhẹ ủ 25°C 60 phút; sản phẩm phản ứng gắn biến nạp vào tế bào khả biến E coli BL21 (DE3) phương pháp sốc nhiệt Các dòng tế bào mang vector tái tổ hợp chọn lọc phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu P42 cặp mồi T7 (T7F: 5’-TAATACGACTCACTATAGGG-3´ T7R: 5´-TAGTTATTGCTCAGCGGTGG-3´) thiết kế sẵn vector pET200/D-TOPO Vector tái tổ hợp pET200/P42 tách Isolate II Plasmid Mini Kit, Bio 52056 (Bioline) gửi giải trình tự nucleotide Cơng ty 1st BASE (Malaysia) Kết giải trình tự phân tích phần mềm BioEdit so sánh mức độ tương đồng với trình tự cơng bố GenBank * Phương pháp biểu gene mã hóa kháng nguyên P42 E coli BL21 (DE3) Các tế bào E coli BL21 (DE3) có chứa vector biểu mang gene mã hóa kháng ngun P42 ni 50 mL mơi trường YJ có bổ sung 100 μg/mL kanamycin 37oC, tốc độ lắc 200 vòng/phút Khi mật độ tế bào đạt OD600 = 0,8 bổ sung 40 μL chất cảm ứng IPTG 1M (Bio-Rad) để đạt nồng độ 0,8 mM tiếp tục nuôi 30oC với tốc độ lắc 150 vòng/ phút Sau đó, sinh khối thu phương pháp ly tâm tốc độ 6000 vòng/ phút 10 phút tách chiết protein tổng số cách tái huyền phù tế bào đệm TNE (50 mM Tris-HCl pH 7,5, 100 mM NaCl, mM EDTA), 1% Triton X-100, 0,001 mg/mL lysozyme, ủ đá 60 phút có lắc, sau xử lý với sóng siêu âm phút Ly tâm với tốc độ 10.000 vòng/phút 10 phút để thu lấy protein thể dịch Tiếp tục hòa tan phần kết tủa với dung dịch urea M, ủ 30ºC giờ, sau ly tâm với tốc độ 10.000 vòng/phút 10 phút để thu lấy protein thể vùi Protein dung hợp 6xHis-P42 tinh từ protein tổng số ProBond™ Purification System Kit (Thermo Fisher Scientific) theo hướng dẫn của nhà sản xuất Sự biểu protein đoạn gene mã hóa kháng nguyên P42 E coli BL21 (DE3) đánh giá phương pháp điện di SDSPAGE * Kiểm tra tính đặc hiệu kháng nguyên tái tổ hợp P42 KHOA HỌC KỸ THUẬT THÚ Y TẬP XXVIII SỐ - 2021 Tính đặc hiệu kháng nguyên tái tổ hợp P42 xác định phản ứng ELISA gián tiếp huyết lợn với kháng nguyên phủ đĩa kháng nguyên tái tổ hợp P42 (đã tinh theo phương pháp nêu trên) Có tất sáu mẫu huyết hai nhóm lợn thu thập: mẫu huyết lợn không bị nhiễm M hyopneumoniae; mẫu huyết lợn bị nhiễm M hyopneumoniae Hai nhóm lợn xác định dựa vào triệu chứng lâm sàng kỹ thuật PCR với cặp mồi đặc hiệu 16S rRNA M hyopneumoniae [8] III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Kết phân lập đoạn gene mã hóa kháng nguyên P42 M hyopneumoniae Sau tách DNA tổng số mẫu mô phổi, chúng tiến hành phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu để nhân đoạn gene mã hóa kháng nguyên P42 Kết điện di sản phẩm (hình 1) cho thấy các băng DNA được kh́ch đại có kích thước khoảng 1110 bp Sản phẩm PCR cho một băng nhất, nồng độ cao, sáng và rõ nét Hình Kết điện di kiểm tra sản phẩm PCR với cặp mồi đặc hiệu cho đoạn gene mã hóa kháng nguyên P42 M: Maker HyperLadder™ 1kb (Bioline), 2: Sản phẩm PCR gen mã hóa kháng nguyên P42 phân lập từ mẫu DNA khác 3.2 Kết quả tạo dòng gene mã hóa kháng nguyên P42 M hyopneumoniae Sản phẩm PCR tinh từ gel agarose 1% gắn vào vector pET200/D-TOPO Tiến hành biến nạp sản phẩm gắn chứa plasmid pET200/P42 vào tế bào E coli BL21, chọn lọc mơi trường LB agar có bổ sung ampicillin Sự diện đoạn gen mã hóa kháng nguyên P42 tế bào E coli BL21 kiểm tra phản ứng PCR trực tiếp với cặp mồi đặc hiệu cho đoạn gen mã hóa kháng nguyên P42 cặp mồi T7 vector pET200/D-TOPO Kết điện di sản phẩm PCR hình cho thấy xuất băng DNA tương tự với kích thước phân lập ban đầu (khoảng 1110 bp) cặp mồi đặc hiệu băng DNA có kích thước xấp xỉ khoảng 1300 bp cặp mồi T7 (bao gồm kích thước gen đoạn khoảng 200 bp nằm vector pET200/D-TOPO cặp primer T7 khuếch đại) Điều chứng tỏ đoạn gene mã hóa kháng nguyên P42 tạo dịng thành cơng vào vector pET200/DTOPO tế bào E coli BL21 Hình Kết quả điện di sản phẩm PCR xác định có mặt plasmid tái tổ hợp pET200/P42 tế bào E coli BL21 M: Maker HyperLadder™ 1kb (Bioline) 1, 3: Sản phẩm PCR với cặp mồi T7 2, 4: Sản phẩm PCR với cặp mồi đặc hiệu cho đoạn gen mã hóa kháng ngun P42 Kết giải trình tự cho thấy đoạn gene mã hóa kháng nguyên P42 phân lập có độ dài 1119 bp, có độ tương đồng cao (99%) với trình tự gen mhp0067 Mycoplasma hyopneumoniae KHOA HỌC KỸ THUẬT THÚ Y TẬP XXVIII SỐ - 2021 P42 AE017244.1 88523 ATGGCGCTTACAAGACTTAAAGAAGAGGCTGAAAAAACCAAAATTAATCTTTCAAATCAA 60 ATGGCGCTTACAAGACTTAAAGAAGAGGCTGAAAAAACCAAAATTAATCTTTCAAATCAA 88582 P42 AE017244.1 61 88583 AGTGTTTCTACAGTTTCTCTACCATTTTTAGGAATGGGCAAAAACGGGCCGATTAACGTT AGTGTTTCTACAGTTTCTCTACCATTTTTAGGAATGGGCAAAAACGGGCCGATTAACGTT 120 88642 P42 AE017244.1 121 88643 GAACTTGAACTTAAAAGATCAGAATTTGAAAAAATGACTGCCCATTTAATCGATAGAACT GAACTTGAACTTAAAAGATCAGAATTTGAAAAAATGACTGCCCATTTAATCGATAGAACT 180 88702 P42 AE017244.1 181 88703 CGCAAACCAATTGTTGATGCTCTAAAACAAGCAAAAATTGAGGCTTCAGATCTTGATGAA CGCAAACCAATTGTTGATGCTCTAAAACAAGCAAAAATTGAGGCTTCAGATCTTGATGAA 240 88762 P42 AE017244.1 241 88763 GTTCTCCTTGTAGGTGGATCAACAAGAATGCCAGCTGTTCAGTCAATGATTGAGCATACT GTTCTCCTTGTAGGTGGATCAACAAGAATGCCAGCTGTTCAGTCAATGATTGAGCATACT 300 88822 P42 AE017244.1 301 88823 TTAAATAAAAAGCCAAATCGTTCAATTAATCCTGATGAGGTAGTCGCAATTGGTGCTGCA TTAAATAAAAAGCCAAATCGTTCAATTAATCCTGATGAAGTAGTCGCAATTGGTGCTGCA 360 88882 P42 AE017244.1 361 88883 ATTCAAGGGGGGGTTCTAGCTGGAGAGATCAGTGATGTTCTACTTTTAGATGTTACTCCT ATTCAAGGGGGGGTTCTAGCTGGAGAGATCAGCGATGTTCTACTTTTAGATGTTACTCCT 420 88942 P42 AE017244.1 421 88943 TTAACTTTAGGAATTGAAACTTTAGGTGGAATTGCAACACCTTTGATTCCAAGAAATACA TTAACTTTAGGAATTGAAACTTTAGGTGGAATTGCAACACCTTTGATTCCAAGAAATACA 480 89002 P42 AE017244.1 481 89003 ACAATTCCGGTAACAAAATCACAAATTTTCTCAACAGCTGAGGATAATCAAACCGAAGTA ACAATTCCGGTAACAAAATCACAAATTTTCTCAACAGCTGAGGATAATCAAACCGAAGTA 540 89062 P42 AE017244.1 541 89063 ACAATTTCTGTTGTCCAAGGTGAACGTCAACTTGCAGCGGATAATAAAATGTTAGGTCGC ACAATTTCTGTTGTCCAAGGTGAACGTCAACTTGCAGCGGATAATAAAATGTTAGGTCGC 600 89122 P42 AE017244.1 601 89123 TTTAATTTATCAGGAATTGAAGCTGCTCCACGAGGTCTTCCCCAGATTGAAGTTAGTTTT TTTAATTTATCAGGAATTGAAGCTGCTCCACGAGGTCTTCCCCAGATTGAAGTTAGTTTT 660 89182 P42 AE017244.1 661 89183 TCAATTGATGTCAACGGGATTACAACGGTTTCAGCAAAAGATaaaaaaaCCGGCAAAGAA TCAATTGATGTCAACGGGATTACAACGGTTTCAGCAAAAGATAAAAAAACCGGCAAAGAA 720 89242 P42 AE017244.1 721 89243 CAAACAATTACAATTAAAAATACTTCAACTTTATCAGAAGAAGAAATTAATAAGATGATT CAAACAATTACAATTAAAAATACTTCAACTTTATCAGAAGAAGAAATTAATAAGATGATT 780 89302 P42 AE017244.1 781 89303 CAGGAAGCCGAAGAAAATCGTGAAGCTGATGCTCTTAAAAAAGACAAAATCGAGACAACA 840 CAGGAAGCCGAAGAAAATCGTGAAGCTGATGCTCTTAAAAAAGACAAAATCGAGACAACA 89362 P42 AE017244.1 841 89363 GTTCGTGCCGAAGGGCTTATTAATCAACTTGAGAAATCAATAACTGATCAAGGTGAAAAA GTTCGTGCCGAAGGGCTTATTAATCAACTTGAGAAATCAATAACTGATCAAGGTGAAAAA 900 89422 P42 AE017244.1 901 89423 ATTGATCCAAAACAAAAAGAATTACTTGAAAAACAGATTCAAGAATTAAAAGATCTTCTA ATTGATCCAAAACAAAAAGAATTACTTGAAAAACAAATTCAAGAATTAAAAGATCTTCTA 960 89482 P42 AE017244.1 961 89483 AAAGAAGAAAAAACTGACGAATTAAAATTAAAATTAGACCAAATTGAAGCAGCTGCCCAA AAAGAAGAAAAAACTGACGAATTAAAATTAAAATTAGACCAAATTGAAGCAGCTGCCCAA 1020 89542 P42 AE017244.1 1021 89543 TCTTTTGCGCAGGCAACCGCGCAGCAAGCAAATACATCTGAATCTGATCCAAAAGCTGAT TCTTTTGCGCAGGCAACCGCGCAGCAAGCAAATACATCTGAATCTGATCCAAAAGCTGAT 1080 89602 P42 AE017244.1 1081 89603 GATTCAAACACAATTGATGCTGAAATCAAGCAGGATTAA GATTCAAACACAATTGATGCTGAAATCAAGCAGGATTAA 1119 89641 Hình Kết so sánh trình tự nucleotide đoạn gen mã hóa kháng ngun P42 với trình tự gen mhp0067 M hyopneumoniae 7448 (AE017244.1) P42 AAZ53444.1 229 MALTRLKEEAEKTKINLSNQSVSTVSLPFLGMGKNGPINVELELKRSEFEKMTAHLIDRT MALTRLKEEAEKTKINLSNQSVSTVSLPFLGMGKNGPINVELELKRSEFEKMTAHLIDRT 60 288 P42 AAZ53444.1 61 289 RKPIVDALKQAKIEASDLDEVLLVGGSTRMPAVQSMIEHTLNKKPNRSINPDEVVAIGAA RKPIVDALKQAKIEASDLDEVLLVGGSTRMPAVQSMIEHTLNKKPNRSINPDEVVAIGAA 120 348 P42 AAZ53444.1 121 349 IQGGVLAGEISDVLLLDVTPLTLGIETLGGIATPLIPRNTTIPVTKSQIFSTAEDNQTEV IQGGVLAGEISDVLLLDVTPLTLGIETLGGIATPLIPRNTTIPVTKSQIFSTAEDNQTEV 180 408 P42 AAZ53444.1 181 409 TISVVQGERQLAADNKMLGRFNLSGIEAAPRGLPQIEVSFSIDVNGITTVSAKDKKTGKE TISVVQGERQLAADNKMLGRFNLSGIEAAPRGLPQIEVSFSIDVNGITTVSAKDKKTGKE 240 468 P42 AAZ53444.1 241 469 QTITIKNTSTLSEEEINKMIQEAEENREADALKKDKIETTVRAEGLINQLEKSITDQGEK QTITIKNTSTLSEEEINKMIQEAEENREADALKKDKIETTVRAEGLINQLEKSITDQGEK 300 528 P42 AAZ53444.1 301 529 IDPKQKELLEKQIQELKDLLKEEKTDELKLKLDQIEAAAQSFAQATAQQANTSESDPKAD IDPKQKELLEKQIQELKDLLKEEKTDELKLKLDQIEAAAQSFAQATAQQANTSESDPKAD 360 588 P42 AAZ53444.1 361 589 DSNTIDAEIKQD DSNTIDAEIKQD 372 600 Hình Kết so sánh trình tự amino acid suy diễn từ đoạn gen mã hóa kháng ngun P42 với trình tự amino acid M hyopneumoniae 7448 (AAZ53444.1) KHOA HỌC KỸ THUẬT THÚ Y TẬP XXVIII SỐ - 2021 7448, mã số AE017244.1 (từ vị trí nucleotide thứ 88523 đến 89641), sai khác vị trí (nucleotide thứ 339, 393 936) (hình 3) Tuy nhiên, sai khác của nucleotide thứ 339, 393 936 không làm ảnh hưởng đến quá trình biểu hiện protein vì trình tự axit amin suy diễn của kháng nguyên P42 thu được có độ tương đồng 100% với protein tương ứng Mycoplasma hyopneumoniae 7448, mã số AAZ53444.1 (từ vị trí amino acid thứ 229 đến 600) (hình 4) 3.3 Kết biểu đoạn gene mã hóa kháng nguyên P42 Sự biểu protein P42 tái tổ hợp E coli BL21 (DE3) môi trường YJ thể gel polyacrylamide 15% có chứa SDS (Hình 5) Hình Điện di SDS-PAGE đánh giá khả biểu protein tái tổ hợp P42 E coli BL21 (DE3) M: Marker 10-200 kDa (Bio basic) 1: Mẫu protein hòa tan thu từ tế bào E coli mang vector tái tổ hợp pET200/P42 không cảm ứng IPTG 2: Mẫu protein thể vùi thu từ tế bào E coli mang vector tái tổ hợp pET200/P42 không cảm ứng IPTG 3: Mẫu protein hòa tan thu từ tế bào E coli mang vector tái tổ hợp pET200/P42 được cảm ứng IPTG 4: Mẫu protein thể vùi thu từ tế bào E coli mang vector tái tổ hợp pET200/P42 được cảm ứng IPTG Theo tính tốn, protein P42 tái tổ hợp biểu có khối lượng khoảng 43,8 kDa, gồm protein P42 có khối lượng phân tử khoảng 40,6 kDa đuôi dung hợp vector pET200/ D-TOPO có khối lượng phân tử khoảng 3,2 kDa Kết điện di SDS-PAGE cho thấy protein P42 tái tổ hợp khơng có mặt protein dịch thể, mà nằm protein thể vùi có khối lượng khoảng 45 kDa, phù hợp với kích thước ước tính Như vậy, protein P42 tái tổ hợp biểu thành công tế bào E coli BL21 (DE3), dung dịch urea 8M có hiệu quả hòa tan protein thể vùi Sau tinh protein thể vùi ProBond™ Purification System Kit (Thermo Fisher Scientific), thu băng protein có khối lượng khoảng 45 kDa (Hình 6) Kết hồn toàn tương tự với kết nghiên cứu Simionatto cộng (2010) [12] Hình Kết tinh protein tái tổ hợp 6xHis-P42 từ thể vùi M: Marker 10-200 kDa (Bio basic) 1: Dịch thu sau cho dịch protein tái tổ hợp chảy qua gel 2: Dịch thu sau rửa gel với Denaturing Binding Buffer 3,4: Dịch thu sau rửa gel với Denaturing Wash Buffer 5,6,7: Dịch thu sau rửa gel với Denaturing Elution Buffer 10 KHOA HỌC KỸ THUẬT THÚ Y TẬP XXVIII SỐ - 2021 3.4 Kết kiểm tra tính đặc hiệu protein tái tổ hợp P42 Kết kiểm tra tính đặc hiệu protein tái tổ hợp P42 phương pháp ELISA gián tiếp trình bày hình bảng Hình Kết ELISA kiểm tra tính đặc hiệu kháng nguyên tái tổ hợp P42 Bảng Kết kiểm tra tính đặc hiệu kháng ngun tái tổ hợp P42 Nhóm Khơng bị nhiễm Bị nhiễm Mẫu huyết Giá trị OD450 Trung bình 0,172 0,185 0,198 0,184 1,475 1,454 1,368 Đối chứng 1,432 0,064 (không huyết thanh) Kết bảng cho thấy trung bình giá trị OD 450 giếng phủ kháng nguyên tái tổ hợp P42 nhóm bị nhiễm M hyopneumoniae 1,432; giếng phủ kháng nguyên tái tổ hợp P42 nhóm khơng bị nhiễm M hyopneumoniae 0,185; giếng đổi chứng 0,064 Điều này chứng tỏ kháng nguyên tái tổ hợp P42 có liên kết với kháng thể có huyết lợn nhiễm M hyopneumoniae IV KẾT LUẬN Đoạn gene mã hóa kháng nguyên P42 M hyopneumoniae được tạo dòng biểu thành công tế bào E coli BL21 (DE3) Đoạn gene có kích thước 1119 bp mã hóa tạo chuỗi polypeptide dài 372 axit amin, có độ tương đồng 100% so với trình tự cơng bố GenBank (mã số AAZ53444.1) Thí nghiệm tinh điện di SDS-PAGE cho thấy protein tái tổ hợp 6xHis-P42 có khối lượng phân tử khoảng 44 kDa Protein 11 KHOA HỌC KỸ THUẬT THÚ Y TẬP XXVIII SỐ - 2021 tái tổ hợp 6xHis-P42 có kết hợp đặc hiệu với kháng thể có huyết lợn nhiễm M hyopneumoniae TÀI LIỆU THAM KHẢO Nguyễn Bá Hiên (2011) Giáo trình Bệnh truyền nhiễm thú y Hà Nội: NXB Nông nghiệp, tr.252 Phạm Sĩ Lăng Trương Văn Dung (2002) Một số bệnh vi khuẩn Mycoplasma gia súc - gia cầm nhập nội biện pháp phòng trị Hà Nội: NXB Nông nghiệp Assao V.S., Scatamburlo T.M., Araujo E.N., Santos M.R., Pereira C.E.R., Guedes R.M.C., Bressan G.C., Fietto J.L.R., Chang Y.-F & Moreira M.A.S (2019) Genetic variation of Mycoplasma hyopneumoniae from Brazilian field samples BMC microbiology, 19(1), 234 Chen Y.L., Wang S.N., Yang W.J., Chen Y.J., Lin H.H & Shiuan D (2003) Expression and immunogenicity of Mycoplasma hyopneumoniae heat shock protein antigen P42 by DNA vaccination Infection and immunity, 71(3), 1155-1160 Chou S.Y., Chung T.L., Chen R.J., Ro L.H., Tsui P.I & Shiuan D (1997) Molecular cloning and analysis of a HSP (heat shock protein) Like 42 kDa antigen gene of Mycoplasma hyopneumoniae IUBMB Life, 41(4), 821-831 Galli V., Simionatto S., Marchioro S., Fisch A., Gomes C., Conceiỗóo F & Dellagostin O (2012) Immunisation of mice with Mycoplasma hyopneumoniae antigens P37, P42, P46 and P95 delivered as recombinant subunit or DNA vaccines Vaccine, 31(1), 135-140 Maes D., Segales J., Meyns T., Sibila M., Pieters M & Haesebrouck F (2008) 12 Control of Mycoplasma hyopneumoniae infections in pigs Veterinary microbiology, 126(4), 297-309 Mattsson J.G., Bergström K., Wallgren P & Johansson K.E (1995) Detection of Mycoplasma hyopneumoniae in nose swabs from pigs by in vitro amplification of the 16S rRNA gene Journal of Clinical Microbiology, 33(4), 893-897 Meens J., Selke M & Gerlach G.F (2006) Identification and immunological characterization of conserved Mycoplasma hyopneumoniae lipoproteins Mhp378 and Mhp651 Veterinary microbiology, 116(13), 85-95 10 Sibila M., Pieters M., Molitor T., Maes D., Haesebrouck F & Segalés J (2009) Current perspectives on the diagnosis and epidemiology of Mycoplasma hyopneumoniae infection The Veterinary Journal, 181(3), 221-231 11 Simionatto S., Marchioro S.B., Galli V., Brum C.B., Klein C.S., Rebelatto R., Silva E.F., Borsuk S., Conceiỗóo F.R & Dellagostin O.A (2012) Immunological characterization of Mycoplasma hyopneumoniae recombinant proteins Comparative immunology, microbiology and infectious diseases, 35(2), 209-216 12 Simionatto S., Marchioro S.B., Galli V., Hartwig D.D., Carlessi R.M., Munari F.M., Laurino J.P., Conceiỗóo F.R & Dellagostin O.A (2010) Cloning and purification of recombinant proteins of Mycoplasma hyopneumoniae expressed in Escherichia coli Protein expression and purification, 69(2), 132-136 Ngày nhận 1-6-2021 Ngày phản biện 15-6-2021 Ngày đăng 15-8-2021 ... lập gene mã hóa kháng nguyên P42 từ mẫu dịch phổi lợn nghi bị nhiễm M hyopneumoniae - Tạo dịng gene mã hóa kháng ngun P42 - Biểu gene mã hóa kháng nguyên P42 - Kiểm tra tính đặc hiệu kháng nguyên. .. đoạn gene mã hóa kháng nguyên P42 M: Maker HyperLadder™ 1kb (Bioline), 2: Sản phẩm PCR gen mã hóa kháng nguyên P42 phân lập từ mẫu DNA khác 3.2 Kết quả tạo dịng gene mã hóa kháng ngun P42 M hyopneumoniae. .. với trình tự cơng bố GenBank * Phương pháp biểu gene mã hóa kháng nguyên P42 E coli BL21 (DE3) Các tế bào E coli BL21 (DE3) có chứa vector biểu mang gene mã hóa kháng nguyên P42 nuôi 50 mL môi