Bài viết Phân lập và tuyển chọn các chủng vi nấm có khả năng chịu mặn thu thập tại Cần Giờ tập trung vào mục tiêu phân lập và chọn lựa những chủng vi nấm có khả năng chịu mặn cao tạo tiền đề cho những nghiên cứu tiếp theo.
Tuyển tập Hội nghị Nấm học Toàn quốc lần thứ doi: 10.15625/vap.2022.0137 PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG VI NẤM CÓ KHẢ NĂNG CHỊU MẶN THU THẬP TẠI CẦN GIỜ Nguyễn Thị Thùy Dương1*, Phạm Thị Anh Thư2, Trần Chí Hiếu1, Đạo Nữ Diệu Hồng1, Lê Thị Huỳnh Trâm1, Nguyễn Đăng Quân1, Hà Thị Loan1 Trung tâm Cơng nghệ Sinh học Thành phố Hồ Chí Minh Trường Đại học Khoa học Tự nhiên Thành phố Hồ Chí Minh *Email: nguyenduongbiology@gmail.com TĨM TẮT Tình hình xâm nhập mặn có chiều hướng gia tăng việc nghiên cứu chủng nấm có khả chịu mặn cần thiết Từ 12 mẫu đất thu thập, phân lập môi trường thạch dichloran rose bengal chloramphenicol (DRBC) 22 chủng vi nấm, tiến hành phân loại sơ có 21 chủng phân loại đến chi gồm (Aspergillus, Penicillium, Trichoderma, Pythium, Geotrichum) 01 chủng định danh đến loài Rhizoctonia solani Khảo sát khả chịu mặn nồng độ % %, nồng độ % (NaCl) lựa chọn chủng chịu mặn tốt phục vụ nghiên cứu tiếp theo, kết khảo sát tất chủng phân lập chịu độ mặn % %, nồng độ % (NaCl) có 03 chủng chịu độ mặn (NaCl) tốt CG1.1.2, CG4.2.3 CG5.1.1 Sau trình định danh hình thái sinh học phân tử ghi nhận chủng CG1.1.2, CG4.2.3 tương đồng với loài Trichoderma caribbaeum CG5.1.1 tương đồng Rhizoctonia solani Chi Trichoderma ứng dụng phổ biến sản xuất chế phẩm sinh học, hai chủng CG1.1.2, CG4.2.3 xem xét cho nghiên cứu ứng dụng lĩnh vực nơng nghiệp Từ khố: Vi nấm, chịu mặn, Aspergillus, Penicillium, Trichoderma, Cần Giờ GIỚI THIỆU Trong điều kiện biến đổi khí hậu, nóng lên tồn cầu tình trạng thiếu nước khu vực thượng nguồn sơng Mekong làm cho tình hình xâm nhập mặn nghiêm trọng tỉnh Đồng sông Cửu Long Xâm nhập mặn làm đất trồng nhiễm mặn, diện tích sản xuất nơng nghiệp ngày thu hẹp Trước tình hình xâm nhiễm mặn vào đất trồng trọt làm tăng độ mặn đất, cần có biện pháp sống chung với điều kiện Ngoài việc chọn giống trồng có khả chịu mặn việc phân lập vi sinh có khả chịu mặn để tiến đến sản xuất chế phẩm sinh học ứng dụng làm giảm độ mặn đất hướng cần thiết Các nghiên cứu từ 2017 đến đa số tập trung vào chủng vi khuẩn địa loại trồng cụ thể như: phân lập dòng vi khuẩn Burkholderia sp BL1-10 chịu mặn từ đất lúa [1], nhận diện Bacillus megaterium dòng Bukholderia cenocepacia chịu độ mặn muối 10 ‰ [2], phân lập chủng vi khuẩn Pseudomonas oryzihabitans có khả chịu mặn với nồng độ NaCl >5 % Burkholderia sp chịu NaCl % [3], phân lập chủng vi khuẩn thuộc chi Pseudomonas từ Bến Tre, có khả sống điều kiện mặn [4]; có nghiên cứu chủng nấm mốc có khả chịu mặn Nghiên cứu tập trung vào mục tiêu phân lập chọn lựa chủng vi nấm có khả chịu mặn cao tạo tiền đề cho nghiên cứu 69 Nguyễn Thị Thùy Dương cs VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1 Vị trí mẫu thu Rừng ngập mặn Cần Giờ có điều kiện môi trường đặc biệt, hệ sinh thái trung gian hệ sinh thái thủy vực với hệ sinh thái cạn, hệ sinh thái nước hệ sinh thái nước mặn Ở có hệ sinh thái đa dạng phong phú, điều kiện khí hậu khắc nghiệt làm cho sinh vật nấm sợi có tính thích nghi cao tạo sản phẩm trao đổi chất đặc biệt so với điều kiện khác nơi lý tưởng để thu mẫu phân lập chủng nấm mốc Tiến hành thu 12 mẫu đất vị trí thuộc huyện Cần Giờ, Thành phố Hồ Chí Minh Địa điểm thu mẫu ghi lại định vị GPS Hình Vị trí điểm thu mẫu Cách thu mẫu: Tiến hành kg đất độ sâu cm so với mặt đất, thu mẫu nơi có cối sinh trưởng Ký hiệu mẫu vị trí lấy mẫu, lưu oC đến phân lập 2.2 Phương pháp phân lập Cân 10 g đất cho vào bình tam giác chứa 90 mL dung dịch nước muối sinh lý (9 o/oo) trùng Đặt bình tam giác chứa mẫu máy lắc, điều chỉnh thơng số 150 vịng/ phút, lắc để yên 30 phút Tiến hành pha loãng dãy nồng độ 100, 10-1, 10-2, 10-3, 10-4,… Hút 100 µL dịch nồng độ pha lỗng trải lên đĩa Petri chứa mơi trường thạch dichloran rose bengal chloramphenicol (DRBC) (TCVN 11039-8:2015) [5] Các đĩa ủ nhiệt độ phòng - ngày, quan sát tách loại khuẩn lạc nấm sang môi trường PDA 2.3 Phương pháp định danh hình thái Các mẫu phân lập tiến hành khảo sát hình thái khuẩn lạc - 10 ngày tuổi ghi nhận màu sắc, hình thái đại thể, vi thể Phương pháp làm tiêu quan sát vi thể: hấp khử trùng đĩa petri có chứa giấy thấm, lame, lamelle 121 oC, 20 phút Cắt miếng thạch môi trường PDA tích cm3 đặt lên miếng lame, cấy vi nấm xung quanh miếng thạch đậy lamelle, nhỏ nước cất vô trùng vào giấy thấm, đậy nắp đĩa petri lại ủ 72 Sau ủ, dùng kẹp vô trùng gắp nhẹ lamelle đặt lên miếng lame 70 Phân lập tuyển chọn chủng vi nấm có khả chịu mặn thu thập Cần Giờ khác có chứa giọt nước cất trùng xem hình thái vi thể kính hiển vi (độ phóng đại 40X, 63X, 100X) Dựa vào khóa phân loại nấm tiến hành phân loại dựa vào vi thể đại thể 2.4 Khảo sát khả chịu mặn mẫu phân lập Cấy điểm theo hình tam giác tương ứng với ba lần lặp lại nghiệm thức thí nghiệm [6] đĩa mơi trường PDA bổ sung thêm NaCl theo ba tỷ lệ khác %, %, % [7] Đem ủ nhiệt độ phòng sau ngày đo đường kính phát triển theo cơng thức D - d (mm), đó: D đường kính khuẩn lạc, d đường kính tản nấm cấy vào Kết ghi nhận phân tích ANOVA phần mềm SAS để chọn chủng có khả chịu mặn tốt 2.5 Phương pháp định danh kỹ thuật sinh học học phân tử mẫu phân lập có khả chịu mặn cao Ly trích DNA theo phương pháp Kosuke (2012) [8] Khuyết đại vùng ITS-rDNA dòng nấm phân lập Sử dụng cặp mồi ITS5 (GGA AGT AAAAGTCGTAACAAGG) LR5 (TCCTGAGGGAAACTTCG) Sản phẩm PCR điện di gel agarose 0,8 % để kiểm tra kết Sau đó, tinh sản phẩm PCR kit Isolate II PCR gel Kit Bioline Sản phẩm sau tinh giải trình tự Phân tích phả hệ: Dựa vào trình tự nucleotide thu được, tìm kiếm trình tự gần gũi công cụ BLAST NCBI (National Center for Biotechnology Information) Phương pháp phân tích trình tự phả hệ thực với phần mềm MEGA 6.0 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Kết phân lập mẫu đất thu Cần Giờ Từ 12 mẫu đất (CG1.1, CG1.2, CG2.1, CG2.2, CG3.1, CG3.2, CG4.1, CG4.2, CG5.1, CG5.2, CG6.1, CG6.2) thu vị trí thuộc huyện Cần Giờ, TP HCM phân lập 22 mẫu phân lập (MPL) nghi ngờ nấm mốc ký hiệu Bảng Bảng Các mẫu nấm mốc phân lập từ đất thu Cần Giờ STT MPL CG6.1.2 CG1.1.2 CG4.2.1 CG4.2.3 CG5.1.2 CG6.2.2 CG2.1.2 CG2.1.1 STT 10 11 12 13 14 15 16 MPL CG4.2.2 CG1.1.1 CG2.2.1 CG5.2 CG1.2.2 CG6.1.1 CG6.2.1 CG5.1.1 STT 17 18 19 20 21 22 MPL CG3.2.2 CG3.1.2 CG1.2.1 CG4.1 CG2.2.2 CG3.1.1 3.2 Kết định danh mẫu phân lập đặc điểm hình thái Dựa vào khóa phân loại Barnet & Hunter (1998) [9], quan sát phát triển khuẩn lạc, màu sắc, hình thái bào tử, cành bào đài kính hiển vi, phân loại 22 chủng Bảng 71 Nguyễn Thị Thùy Dương cs sau: 21 chủng phân loại đến chi gồm (Aspergillus, Penicillium, Trichoderma, Pythium, Geotrichum) chủng định danh đến loài Rhizoctonia solani [10] Bảng Hình ảnh đại thể, vi thể chủng phân lập STT 72 Nhóm Aspergillus sp Penicillium sp.1 Penicillium sp.2 Penicillium sp.3 Penicillium sp.4 Penicillium sp.5 Pythium sp.1 Pythium sp.2 Khuẩn lạc Vi thể Phân lập tuyển chọn chủng vi nấm có khả chịu mặn thu thập Cần Giờ Trichoderma sp 10 Geotrichum sp 11 Rhizoctonia solani Bảng Bảng phân nhóm chủng nấm mốc từ mẫu đất Vị trí STT 1 Tổng Phân nhóm 10 11 Aspergillus sp Penicillium sp.1 Penicillium sp.2 Penicillium sp.3 Penicillium sp.4 Penicillium sp.5 Pythium sp.1 Pythium sp.2 Trichoderma sp Geotrichum sp Rhizoctonia solani 1 1 1 1 1 1 1 Hình Biểu đồ phần trăm chủng nấm mốc phân lập 73 Nguyễn Thị Thùy Dương cs Theo ghi nhận tổng hợp phân loại nhóm Penicillium chiếm ưu (59 %) xuất phổ biến mẫu đất thu thập, Trichoderma Aspergillus 3.3 Kết khảo sát khả chịu mặn mẫu phân lập Sau nuôi cấy ghi nhận đường kính phát triển khuẩn lạc nấm đĩa môi trường PDA bổ sung NaCl theo ba tỷ lệ %, %, %, quan sát thấy nồng độ muối cao hạn chế khả phát triển nấm mốc Các chủng nấm mốc có biến đổi đặc điểm hình thái đặc điểm sợi nấm thay đổi, tạo nhiều bào tử nồng độ muối tăng Quá trình quan sát phát triển khuẩn lạc đĩa mơi trường phân tích số liệu đường kính phát triển khuẩn lạc cho thấy nồng độ % chủng nấm phát triển chưa ảnh hưởng nhiều Ở nồng độ muối % phát triển chủng nấm phân lập khác biệt rõ rệt, có chủng (CG2.1.2) khuẩn lạc khơng phát triển, chủng (CG1.1.2, CG4.2.3, CG5.1.1) có khả phát triển tốt chủng lại từ kết phân hạng (Bảng 4) Tiến hành định danh đến loài 03 chủng CG1.1.2, CG4.2.3, CG5.1.1 phương pháp sinh học phân tử Bảng Đường kính phát triển chủng phân lập nồng độ mặn khác 74 STT MPL Độ mặn % Độ mặn % Độ mặn % CG6.1.2 8,54jk 6,87ji 6,69ghij CG1.1.2 61,99a 34,61cd 31 ,15a CG4.2.1 11,64hij 9,26ijh 9,11defg CG4.2.3 59,99ab 50,21a 27,74ab CG5.1.2 27,09ef 15,81fg 11,15d CG6.2.2 6,41k 8,26ijh 5,5eijk CG2.1.2 28,25e 10,58ij 0,00l CG2.1.1 13,18hi 12,78gh 10,83de CG4.2.2 38,55d 32,14d 9,57def 10 CG1.1.1 7,31k 6,07j 3,96k 11 CG2.2.1 14,51h 11,98gh 8,33efg 12 CG5.2 10,06ijk 6,66j 5,62hijk 13 CG1.2.2 23,67fg 20,89e 18,82c 14 CG6.1.1 10,4ijk 7,68hij 7,19fghi 15 CG6.2.1 8,33ij 6,54j 4,78jk 16 CG5.1.1 56,24bc 39,07bc 32,26a 17 CG3.2.2 13,87hi 9,71hij 7,63fghi 18 CG3.1.2 20,84g 16,83efg 7,74fgh 19 CG1.2.1 57,51bc 35,79cd 32,00a 20 CG4.1 21,54g 19,10ef 25,03b 21 CG2.2.2 54,30c 40,59b 24,23b 22 CG3.1.1 10,42ijk 9,59hij 7,61fghi CV (%) 8,60 14,67 6,61 P