BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC NGUYỄN DUY KHÁNH KHẢO SÁT ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY VÀ SINH BÀO TỬ VI KHUẨN Bac[.]
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC NGUYỄN DUY KHÁNH KHẢO SÁT ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY VÀ SINH BÀO TỬ VI KHUẨN Bacillus subtilis LUẬN VĂN KỸ SƢ CHUYÊN NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2006 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC KHẢO SÁT ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY VÀ SINH BÀO TỬ VI KHUẨN Bacillus subtilis LUẬN VĂN KỸ SƢ CHUYÊN NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giáo viên hƣớng dẫn Sinh viên thực TS NGUYỄN NGỌC HẢI NGUYỄN DUY KHÁNH KHÓA: 2002 – 2006 Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2006 MINISTRY OF EDUCATION AND TRAINING NONG LAM UNIVERSITY, HCMC FACULTY OF BIOTECHNOLOGY EXAMINE CULTURE CONDITION AND SPORULATION OF Bacillus subtilis GRADUATION THESIS MAJOR: BIOTECHNOLOGY Professor Student Dr.NGUYEN NGOC HAI NGUYEN DUY KHANH TERM: 2002 - 2006 HCMC, 09/2006 LỜI CẢM ƠN Với tất lịng kính trọng, em xin chân thành cảm ơn Ban Giám hiệu trường Đại học Nơng Lâm thành phố Hồ Chí Minh, Ban chủ nhiệm Bộ Môn Công nghệ sinh học, tất quý Thầy Cô truyền đạt kiến thức cho em suốt trình học trường Em xin chân thành cảm ơn TS Nguyễn Ngọc Hải hết lòng hướng dẫn dạy dỗ, động viên, quan tâm, ủng hộ em hồn thành khố luận Em xin chân thành cám ơn TS Lê Anh Phụng, BSTY Nguyễn Thị Kim Loan giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi cho em suốt q trình hồn thành khố luận Em xin chân thành cảm ơn Phịng vi sinh, Khoa Chăn ni – Thú Y cho phép tạo điều kiện thuận lợi cho em học tập nghiên cứu phịng Tơi xin cảm ơn bạn lớp CNSH 28 chia xẻ vui buồn thời gian học hết lòng hỗ trợ, giúp đỡ thời gian thực tập Sinh viên thực Nguyễn Duy Khánh i TÓM TẮT NGUYỄN DUY KHÁNH, ĐH Nơng Lâm Tp Hồ Chí Minh Tháng 8/2006 “KHẢO SÁT ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY VÀ SINH BÀO TỬ VI KHUẨN Bacillus subtilis” Hội đồng hướng dẫn: TS NGUYỄN NGỌC HẢI Việt nam nước nơng nghiệp có nghành chăn ni phát triển có đóng góp lớn vào phát triển kinh tế đất nước Vì vậy, vấn đề nâng cao suất, chất lượng sản phẩm cải thiện môi trường chăn nuôi quan tâm nước ta Xuất phát từ vấn đề này, tiến hành nghiên cứu khảo sát đặc điểm vi khuẩn Bacillus subtils, tìm hiểu điều kiện ni cấy thích hợp xử lí bào tử để sản xuất chế phẩm sinh học nhằm cung cấp thông tin để chọn lựa điều kiện ni cấy vi khuẩn Bacillus subtilis thích hợp, từ sản xuất chế phẩm sinh học cung cấp cho nghành chăn ni Qua q trình thực đề tài chúng tơi có ghi nhận sau: Khảo sát ảnh hưởng chế độ nuôi cấy tĩnh nuôi cấy lắc (15 phút lắc, 45 phút nghỉ) chế độ nuôi cấy lắc cho số lượng vi khuẩn cao Khảo sát ảnh hưởng loại môi trường khác (TSB, TSB + 1% glucose, TSB + 1% cao nấm men, TSB + 1% glucose + 1% cao nấm men) mơi trường TSB cho số lượng vi khuẩn thấp nhất, mơi trường cịn lại mơi trường phù hợp cho Bacillus subtilis phát triển Khảo sát ảnh hưởng pH môi trường (pH 7,5), thời gian (24,36 48 giờ) nhiệt độ nuôi cấy (nhiệt độ phịng, 37oC) pH 7, thời gian 48 nhiệt độ nuôi cấy 37oC cho số lượng vi khuẩn lớn Khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ (50, 70), pH (6, 9) thời gian xử lí (3, giờ) đến hình thành bào tử xử lí nhiệt độ pH có ảnh hưởng đến trình hình thành bào tử vi khuẩn Bacillus subtilis ii MỤC LỤC Trang tựa Lời cảm tạ i Tóm tắt ii Mục lục iii Danh sách chữ viết tắt iv Danh sách hình v Danh sách bảng vi Phần MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục đích – Yêu cầu Phần TỔNG QUAN 2.1 Đại cương vi khuẩn Bacilus subtilis 2.1.1 Lịch sử phát triển 2.1.2 Đặc điểm phân loại 2.1.3 Đặc điểm phân bố 2.1.4 Đặc điểm hình thái 2.1.5 Đặc điểm nuôi cấy 2.1.6 Đặc điểm sinh hoá 2.1.7 Cấu trúc kháng nguyên 2.1.8 Tính chất đối kháng B subtilis với số vi sinh vật gây bệnh 2.2 Bào tử vi khuẩn Bacillus subtilis 2.2.1 Khả sinh bào tử 2.2.2 Cấu tạo bào tử 2.2.3 Thành phần hoá học bào tử 2.2.4 Sự nảy mầm bào tử 2.2.5 Sức đề kháng bào tử 2.3 Hệ vi sinh vật đường ruột loạn khuẩn 10 2.3.1 Hệ vi sinh vật đường ruột 10 2.3.2 Vai trò hệ vi sinh vật đường ruột 11 iii 2.3.3 Sự loạn khuẩn 12 2.4 Giới thiệu chung probiotic 13 2.4.1 Định nghĩa 13 2.4.2 Chức sinh học probiotic 13 2.5 Tình hình nghiên cứu ứng dụng chế phẩm chứa vi khuẩn Bacillus subtilis 14 PHẦN NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16 3.1 Thời gian địa điểm thực đề tài 16 3.2 Vật liệu thí nghiệm 16 3.2.1 Giống vi khuẩn 16 3.2.2 Môi trường nuôi cấy 16 3.2.3 Hoá chất 16 3.2.4 Thiết bị dụng cụ 16 3.3 Nội dung nghiên cứu 17 3.4 Phương pháp thực đề tài 17 3.4.1 Khảo sát đặc điểm sinh học Bacillus subtilis 17 3.4.2 Các thí nghiệm Bacillus subtilis 17 3.4.2.1 Ảnh hưởng chế độ nuôi cấy (nuôi cấy tĩnh, nuôi cấy lắc) thời gian nuôi cấy đến số lượng vi khuẩn 17 3.4.2.2 Khảo sát môi trường thời gian ni cấy thích hợp cho vi khuẩn Bacillus subtilis phát triển tạo sinh khối 18 3.4.2.3 Khảo sát pH mơi trường thích hợp cho nuôi cấy vi khuẩn Bacilus subtilis 19 3.4.3 Các thí nghiệm bào tử Bacillus subtilis 20 3.4.3.1 Khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ đến tạo bào tử vi khuẩn Bacillus subtilis 20 3.4.3.2 Khảo sát ảnh hưởng pH đến tạo bào tử vi khuẩn Bacillus subtilis 21 PHẦN KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 22 4.1 Khảo sát đặc điểm sinh học Bacillus subtilis 22 4.1.1 Đặc điểm hình thái Bacillus sutilis 22 iv 4.1.2 Quan sát đặc điểm khuẩn lạc Bacillus subtilis 22 4.1.3 Quan sát dăc điểm nuôi cấy Bacillus subtilis môi trường canh23 4.1.4 Tính chất sinh hố 23 4.2 Các thí nghiệm Bacillus subtíils 25 4.2.1 Khảo sát chế độ (nuôi cấy tĩnh, nuôi cấy lắc) thời gian nuôi cấy thích hợp 25 4.2.2 Khảo sát môi trường thời gian ni cấy thích hợp 27 4.2.3 Khảo sát pH mơi trường ni cấy vi khuẩn thích hợp 29 4.2.4 Các thí nghiệm bào tử Bacillus subtilis 30 4.2.4.1 Khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ đến hình thành bào tử Bacillus subtilis 30 4.2.4.2 Khảo sát ảnh hưởng pH đến hình thành bào tử vi khuẩn Bacillus subtilis 32 Phần KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 34 5.1 Kết luận 34 5.2 Đề nghị 34 Phần TÀI LIỆU THAM KHẢO 36 Phần PHỤ LỤC 38 v DANH SÁCH CÁC HÌNH Hình 2.1 Hình thái vi khuẩn Bacillus subtilis Hình 2.2 Quá trình tạo bào tử Hình 2.3 Cấu tạo bào tử Bacillus sutilis Hình 4.1 Tế bào vi khuẩn Bacillus subtilis kính hiển vi độ phóng đại 1000 lần 22 Hình 4.2 Đặc điểm khuẩn lạc Bacillus subtilis môi trường TSA 23 Hình 4.3 Khuẩn lạc Bacillus subtilis mơi trường thạch tinh bột 23 Hình 4.4 Phản ứng lên men số loại đường vi khuẩn Bacillus subtilis 25 vi DANH SÁCH CÁC BẢNG Bảng 2.1 Các phản ứng sinh hoá Bacillus subtilis Bảng 2.2 Sự khác bào tử tế bào sinh dưỡng Bacillus subtilis Bảng 3.1 Bố trí thí nghiệm 18 Bảng 3.2 Bố trí thí nghiệm 19 Bảng 3.3 Bố trí thí nghiệm 20 Bảng 3.4 Bố trí thí nghiệm 21 Bảng 3.5 Bố trí thí nghiệm 21 Bảng 4.1 Ảnh hưởng thời gian chế độ nuôi cấy đến số lượng vi khuẩn Bacillus subtilis 25 Bảng 4.2 Ảnh hưởng môi trường thời gian nuôi cấy đến số lượng vi khuẩn Bacillus subtilis 27 Bảng 43 Ảnh hưởng pH, nhiệt độ thời gian nuôi cấy đến số lượng vi khuẩn Bacillus subtilis 29 Bảng 4.4 Ảnh hưởng nhiệt độ đến hình thành bào tử vi khuẩn Bacillus subtilis 30 Bảng 4.6 Ảnh hưởng pH đến hình thành bào tử vi khuẩn Bacillus subtilis 32 vii Với vi sinh vật gây bệnh Môi trường nuôi cấy nấm bệnh có diện Bacillus subtilis với số lượng lớn gây cạnh tranh dinh dưỡng, cạnh trạnh không gian sống vi khuẩn nấm Do vi khuẩn phát triển nhanh (trong 24h) sử dụng phần lớn chất dinh dưỡng môi trường, đồng thời tạo kháng sinh subtilin nên sinh trưởng nấm bị ức chế Với đồng loại Các chuyên gia Đại Học Havard, Mỹ cho biết: chất dinh dưỡng bắt đầu cạn kiệt, vi sinh vật đối phó cách chuyển sang tình trạng “ngủ đơng”, hay nghỉ ngơi thời gian dài Bacillus subtilis thực điều cách tạo bào tử, trì trạng thái sống tiềm tàng nhiều năm, chí hàng kỉ Tuy nhiên thí nghiệm mình, nhóm nghiên cứu nhận thấy giai đoạn sớm hình thành bào tử, vài tế bào Bacillus tạo kháng sinh để giết chết tế bào vi khuẩn bên cạnh chưa bắt đầu trình Chất kháng sinh phá vỡ màng tế bào vi khuẩn bị cơng, giải phóng chất dinh dưỡng tế bào hình thành bào tử tiêu thụ Theo nhà nghiên cứu trên, trình tạo bào tử tiêu tốn lượng lớn lượng, phải vài bắt đầu khơng thể đảo ngược Do đó, vi khuẩn cố gắng tránh thời điểm lâu tốt Đặc biệt, dinh dưỡng môi trường cạn kiệt, vi khuẩn tiêu diệt kẻ xung quanh để hút chất dinh dưỡng kéo dài thời kì chờ đợi này, phải chuyển sang sống tiềm sinh (Nguyễn Thị Công Dung, 2004) 2.2 Bào tử vi khuẩn Bacillus subtilis Bào tử hình thức tiềm sinh vi khuẩn, giúp cho vi khuẩn vượt qua điều kiện bất lợi như: môi trường nghèo dinh dưỡng, nhiệt độ, pH khơng thích hợp, mơi trường tích luỹ nhiều sản phẩm trao đổi chất bất lợi… Mỗi vi khuẩn tạo bào tử Khi gặp điều kiện thuận lợi, bào tử nảy mầm để trở dạng tế bào sinh dưỡng 2.2.1 Sự hình thành bào tử Một đặc điểm quan trọng Bacillus subtilis khả tạo bào tử điều kiện định Bacillus subtilis có khả hình thành bào tử chu trình phát triển tự nhiên vi khuẩn gặp điều kiện bất lợi (dinh dưỡng môi trường bị kiệt quệ, nhiệt độ…) (Tơ Minh Châu, 2000) Q trình hình thành bào tử gồm bước Hình thành vách ngăn Sự tạo tiền bào tử Tạo lớp vỏ bào tử Sự tổng hợp lớp vỏ bào tử Sự giải phóng bào tử Hình 2.2 Quá trình tạo bào tử www.biol.lu.se/cellorgbiol/ membprot/pop_sv.html Lúc đầu lớp nguyên sinh chất tế bào sử dụng Tế bào chất nhân tập trung vị trí định tế bào Tế bào chất tiếp tục cô đặc tạo thành tiền bào tử (prospore) Tiền bào tử dần bao bọc lớp màng Tiền bào tử phát triển trở thành bào tử Khi bào tử trưởng thành, tế bào sinh dưỡng phân giải bào tử giải phóng khỏi tế bào mẹ Khi gặp điều kiện thuận lợi bào tử hút nước bị trương Sau vỏ chúng bị phá huỷ bào tử nảy mầm phát triển thành tế bào Mỗi tế bào sinh dưỡng tạo bào tử (Lê Đỗ Mai Phương, 2004) 2.2.2.Cấu tạo bào tử Bào tử khối nguyên sinh chất đặc, có chứa thành phần hoá học tế bào sinh dưỡng có vài điểm khác tỉ lệ thành phần có thêm số thành phần Phía ngồi ngun sinh chất bao bọc nhiều lớp màng Hình 2.3 Cấu tạo bào tử Bacillus sutilis www.biol.lu.se/cellorgbiol/ membprot/pop_sv.html Ngoài bào tử lớp màng, mỏng không thấm nước, cấu tạo chủ yếu lipoprotein Dưới lớp màng vỏ, vỏ bào tử có nhiều lớp, bề mặt lớp xù xì, thành phần hố học protein có tham gia keratin lớp có khả ngăn chặn thẩm thấu nước chất hoà tan nước, chúng có tác dụng tăng cường khả bảo vệ bào tử trước điều kiện bất lợi Dưới lớp vỏ lớp màng bào tử khối tế bào chất đồng Trong bào tử tự không tồn trao đổi chất, giữ trạng thái tiềm sinh nhiều năm (Lê Đỗ Mai Phương 2004) Bào tử khác tế bào sinh dưỡng cấu trúc, thành phần hố học, tính chất sinh lí Bảng 2.2 Sự khác bào tử tế bào sinh dƣỡng B subtilis Đặc tính Tế bào sinh dưỡng Bào tử Cấu trúc Tế bào G+, điển hình Vỏ bào tử dày, khó thấm nước Canxi Thấp Cao Protein Thấp Cao Hoạt tính enzyme Cao Thấp Đặc tính chịu nhiệt Yếu Cao Đặc tính chịu xạ Kém Mạnh Đặc tính chịu chất hoá học acid Yếu Cao Khả bắt màu chất nhuộm Dễ nhuộm Phải sử dụng phương pháp đặc biệt Thành phần hoá học 2.2.3 Thành phần hoá học bào tử Các lớp bao màng bào tử có cấu tạo protein có chứa nhiều glyxin, tyroxin đặc biệt cystein, cịn có tham gia keratin Ngun sinh chất bào tử có chứa nhiễm sắc thể, ribosome enzyme chuyển hố trạng thái khơng hoạt động Khi bào tử nảy mầm enzyme bắt đầu hoạt động Bào tử có chứa lượng lớn canxi, magie acid dipicolinic Acid chiếm từ 5- 12% khối lượng khô bào tử (acid tế bào sinh dưỡng, hình thành trình hình thành bào tử nảy mầm) Lượng nước bào tử thấp tồn dạng liên kết 2.2.4 Sự nảy mầm bào tử (Nguyễn Lân Dũng cộng sự, 1998) Quá trình chuyển bào tử từ trạng thái nghỉ sang tế bào sinh dưỡng vi khuẩn gọi trình nảy mầm bào tử Q trình gồm giai đoạn: hoạt hố, nảy mầm sinh trưởng: Hoạt hoá Sau cho bào tử Bacillus subtilis tồn trạng thái nghỉ ngày, ta xử lí 60oC phút xúc tiến q trình nảy mầm Sau xử lí nhiệt, ta chuyển vào mơi trường ni cấy thích hợp Có số hố chất đặc biệt xúc tiến q trình nảy mầm bào tử Ví dụ: L-alanine, Mn2+, chất hoạt động bề mặt, glucose,… Cũng có chất lại có tác dụng ức chế trình nảy mầm: D-alanine, natri bicarbonate… Nảy mầm Protein có chứa nhiều cystein áo bào tử hố xốp lên làm tăng tính thấm, xúc tiến hoạt động enzyme protease Khi lượng protein bào tử áo giảm xuống Các cation bên co thể xâm nhập vào lớp vỏ bào tử làm trương lớp vỏ bào tử lên, sau làm tan tiêu Khi đó, nước bên ngồi xâm nhập vào lớp lõi bào tử, làm cho lõi trương to lên, loại enzyme bắt đầu hoạt hố, bắt đầu q trình tổng hợp thành tế bào Trong q trình nảy mầm đặc tính chịu nhiệt, tính chiết quang…bắt đầu giảm dần; lượng dipicolinate-canxi, acid amin, polipeptide đi; bắt đầu việc tổng hợp DNA, RNA protein vỏ bào tử Bào tử chuyển thành tế bào sinh dưỡng Khi nảy mầm, bào tử đâm theo phía cực đâm ngang Lúc thành tế bào cịn mỏng chưa hồn chỉnh, nâng cao khả tiếp nhận thêm DNA ngoại lai để thực trình biến nạp 2.2.5 Sức đề kháng bào tử Bào tử có sức đề kháng cao yếu tố vật lý hoá học như: nhiệt độ, tia cực tím, áp suất chất sát trùng Sỡ dĩ bào tử có sức đề kháng cao sống lâu yếu tố sau: Nước bào tử phần lớn trạng thái liên kết, khơng có khả làm biến tính protein tăng nhiệt độ Do bào tử có khối lượng lớn ion Ca2+ acid dipicolinic, protein bào tử kết hợp với dipicolinate canxi thành phức chất có tính chất ổn định cao nhiệt độ Các enzyme hoạt chất sinh học khác chứa bào tử tồn dạng không hoạt động, hạn chế trao đổi chất bào tử tế bào bên ... cứu khảo sát đặc điểm vi khuẩn Bacillus subtils, tìm hiểu điều kiện ni cấy thích hợp xử lí bào tử để sản xuất chế phẩm sinh học nhằm cung cấp thông tin để chọn lựa điều kiện ni cấy vi khuẩn Bacillus. .. nghiệm bào tử Bacillus subtilis 30 4.2.4.1 Khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ đến hình thành bào tử Bacillus subtilis 30 4.2.4.2 Khảo sát ảnh hưởng pH đến hình thành bào tử vi khuẩn Bacillus. .. tạo bào tử Khi gặp điều kiện thuận lợi, bào tử nảy mầm để trở dạng tế bào sinh dưỡng 6 2.2.1 Sự hình thành bào tử Một đặc điểm quan trọng Bacillus subtilis khả tạo bào tử điều kiện định Bacillus