Sử dụng cao chiết lá muồng (cassia angustifolia) để ức chế nấm mốc và vi khuẩn trong bảo quản trái cây

PHẦN I LÝ DO CHỌN ĐỀ TÀI Vi sinh vật (như nấm mốc và vi khuẩn) làm trái cây bị hư hỏng và có thể gây bệnh đối với người sử dụng. Các biện pháp bảo quản trái cây, chống lại các vi sinh vật gây bệnh đã được tìm hiểu từ lâu. Bảo quản trái cây có thể thực hiện bằng phương pháp sơ chế vật lý như chiếu xạ, bao gói bằng màng bán thấm điều hòa khí hoặc đưa về môi trường bảo quản bất lợi đối với sự phát triển của vi sinh vật, nhưng các phương pháp này phức tạp và nhiều tốn kém. Trái cây cũng được bảo quản nhờ phương pháp xử lý bằng hóa chất 1,2, tuy nhiên có nhiều loại hóa chất độc hại cho sức khỏe của người sản xuất và tiêu dùng như: hóa chất nguồn gốc organophosphate, carbamate, dẫn xuất của DDT, carbenadazim, auxin, 2,4D và các chất diệt cỏ đã bị cấm hoàn toàn hoặc một phần trong điều kiện sống hiện tại. Để đáp ứng được yêu cầu chất lượng hiện nay của các cơ quan quản lý và chức năng như Cục Bảo Vệ Thực Vật, Cục Vệ Sinh An Toàn Thực Phẩm, việc tạo ra các loại thuốc bảo quản trái cây với quy trình công nghệ đơn giản, thân thiện với môi trường, không độc hại, có nguồn gốc từ các nguyên liệu thảo mộc, thực vật làm thuốc hoặc sàng lọc hoạt tính trong điều kiện nghiên cứu hóa học, sinh học hiện tại là hết sức cần thiết. Thực tế cho thấy nhiều loại cây cỏ đã được sử dụng để trị bệnh, trong đó lá Muồng là một loại thảo dược có tác dụng trong việc gây xổ ở những trường hợp táo bón. Tra cứu tiếp từ nguồn tài liệu về cây cỏ làm thuốc, nguyên liệu lá Muồng còn được biết có hiệu quả ức chế khối u, kháng viêm và đặc biệt có nhiều hoạt tính ức chế vi sinh vật gây bệnh đường ruột đối với người. Như vậy, lá Muồng có khả năng ức chế sự phát triển của vi sinh vật gây hại trên trái cây hay không??? vấn đề này hiện nay vẫn chưa được nghiên cứu rộng rãi trong nước và trên thế giới. Xuất phát từ các lý do nêu trên, chúng em tiến hành chế tạo cao chiết từ lá Muồng; kiểm tra hiệu quả ức chế của cao chiết này với một số vi khuẩn gây bệnh cho trái cây trong phòng thí nghiệm và thử nghiệm khả năng bảo quản trái cây của cao chiết.

SỞ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO HÀ NỘI QUẬN TÂY HỒ TRƯỜNG THPT CHU VĂN AN ************** ĐỀ TÀI DỰ THI KHOA HỌC, KỸ THUẬT DÀNH CHO HỌC SINH TRUNG HỌC CẤP THÀNH PHỐ LẦN THỨ TƯ (NĂM HỌC 2014 - 2015) Tên đề tài: SỬ DỤNG CAO CHIẾT LÁ MUỒNG (CASSIA ANGUSTIFOLIA) ĐỂ ỨC CHẾ NẤM MỐC VÀ VI KHUẨN TRONG BẢO QUẢN TRÁI CÂY Lĩnh vực: Hóa sinh NGƯỜI HƯỚNG DẪN - TS Lê Đăng Quang - Đơn vị cơng tác: Viện Hóa học cơng nghiệp Việt Nam TÁC GIẢ: Phạm Anh Quân Hà Nội Đoàn Quỳnh Chi Hà Nội Lớp: 10 Hóa Trường: THPT Chu Văn An Lớp:10 Sinh Trường: THPT Chu Văn An Hà Nội, tháng 11 năm 2014 MỤC LỤC Trang PHẦN I Lý chọn đề tài……………………………….3 PHẦN II Tổng quan………………………………………4 PHẦN III Qúa trình nghiên cứu kết quả……………… 3.1 Cây Muồng………………………………………….5 3.2 Phương pháp chiết cao hướng nghiên cứu……….6 3.3 Thực nghiệm…………………………………………7 3.3.1 Xay Muồng……………………………… 3.3.2 Tách chiết lấy hoạt chất từ Muồng…… 3.3.3 Kiểm tra anthraquinone tổng số………….10 3.3.4 Kiểm tra hoạt tính cao chiết………….11 PHẦN IV Kết luận…………………………………….….20 PHẦN I LÝ DO CHỌN ĐỀ TÀI Vi sinh vật (như nấm mốc vi khuẩn) làm trái bị hư hỏng gây bệnh người sử dụng Các biện pháp bảo quản trái cây, chống lại vi sinh vật gây bệnh tìm hiểu từ lâu Bảo quản trái thực phương pháp sơ chế vật lý chiếu xạ, bao gói màng bán thấm - điều hịa khí đưa môi trường bảo quản bất lợi phát triển vi sinh vật, phương pháp phức tạp nhiều tốn Trái bảo quản nhờ phương pháp xử lý hóa chất [1,2], nhiên có nhiều loại hóa chất độc hại cho sức khỏe người sản xuất tiêu dùng như: hóa chất nguồn gốc organophosphate, carbamate, dẫn xuất DDT, carbenadazim, auxin, 2,4-D chất diệt cỏ bị cấm hoàn toàn phần điều kiện sống Để đáp ứng yêu cầu chất lượng quan quản lý chức Cục Bảo Vệ Thực Vật, Cục Vệ Sinh An Toàn Thực Phẩm, việc tạo loại thuốc bảo quản trái với quy trình công nghệ đơn giản, thân thiện với môi trường, không độc hại, có nguồn gốc từ nguyên liệu thảo mộc, thực vật làm thuốc sàng lọc hoạt tính điều kiện nghiên cứu hóa học, sinh học cần thiết Thực tế cho thấy nhiều loại cỏ sử dụng để trị bệnh, Muồng loại thảo dược có tác dụng việc gây xổ trường hợp táo bón Tra cứu tiếp từ nguồn tài liệu cỏ làm thuốc, nguyên liệu Muồng biết có hiệu ức chế khối u, kháng viêm đặc biệt có nhiều hoạt tính ức chế vi sinh vật gây bệnh đường ruột người Như vậy, Muồng có khả ức chế phát triển vi sinh vật gây hại trái hay không??? vấn đề chưa nghiên cứu rộng rãi nước giới Xuất phát từ lý nêu trên, chúng em tiến hành chế tạo cao chiết từ Muồng; kiểm tra hiệu ức chế cao chiết với số vi khuẩn gây bệnh cho trái phịng thí nghiệm thử nghiệm khả bảo quản trái cao chiết Phần II TỔNG QUAN Cây Muồng hẹp (tên khoa học: Cassia angustifolia Vahl; họ: Caesalpinaceae), trồng nước nhiệt đới, thuộc họ Muồng Lá Muồng sử dụng làm thuốc để trị bệnh táo bón (Atal et al 1982; Das et 2003; Martindale, 1997; Sharma, 2004), kháng viêm, ức chế khối u… thể người Thực nghiệm cho thấy cao chiết thu từ nguồn nguyên liệu Muồng (bằng phương pháp chiết khác nhau) có chứa hoạt chất anthraquinone Các cao chiết ức chế có hiệu phát triển nấm Colletotrichum gloeosporioides (gây bệnh đốm đen); vi khuẩn Xanthomonas axonopodis (gây bệnh loét vi khuẩn) trái ngồi cịn ức chế phát triển chủng Tụ cầu vàng 2.1 Tính Sử dụng cao chiết chứa hoạt chất anthraquinone có Muồng để ức chế hiệu phát triển vi sinh vật gây hại trái hướng đề tài 2.2 Tính sáng tạo Việc sử dụng Muồng - nguồn ngun liệu rẻ tiền, sẵn có, khơng độc hại với người thân thiện với môi trường, để chiết lấy cao chứa anthraquinone quy trình cơng nghệ đơn giản, dễ thực hiện: phương pháp chiết với dung môi nước (sắc) ý tưởng sáng tạo Phần III QUÁ TRÌNH NGHIÊN CỨU VÀ KẾT QUẢ 3.1 Cây Muồng Cây Muồng hẹp (tên khoa học: Cassia angustifolia Vahl; họ: Caesalpinaceae), trồng nước nhiệt đới, thuộc họ Muồng Trong Muồng hẹp có chứa sennoside A, B, C D (Hayashi et al 1980); kaemferol; phytosterols (Khorama Sanghvi, 1964); rhein; glylcoside rhein chrysophanic acid Vỏ chứa hoạt chất sennosides A B sử dụng rộng rãi y học chúng có tính nhuận tràng Muồng hẹp có vị ngọt, đắng, tính hàn, qui kinh Đại tràng, loại có giá trị y dược cao Từ kỷ thứ 9, Muồng hẹp dùng làm thuốc nước Ả rập, đến thời kỳ cận đại truyền vào Trung quốc Cây Muồng hẹp có tác dụng nhuận tràng, sử dụng để trị bệnh táo bón (Atal et al 1982; Das et 2003; Martindale, 1997; Sharma, 2004), kháng viêm, ức chế khối u… Lá Muồng nghiên cứu đề tài mua cửa hàng bán thuốc đông y dạng sấy khô 3.2 Phương pháp chiết cao hướng nghiên cứu Bằng số phương pháp chiết với dung môi nước dung mơi hữu etanol, nhóm nghiên cứu tiến hành tách hoạt chất anthraquinone khỏi thực vật, sau đuổi dung mơi để thu cao chiết Phương pháp chiết với dung môi nước (sắc), dùng để thu hồi hoạt chất có hịa tan vào dịch nước Phương pháp rẻ tiền, dễ thực hiện, nhiên dịch chiết thu có nhiều tạp chất, gây thuỷ phân số hoạt chất (glycoside, ancaloid) gây phân huỷ số hoạt chất tiến hành nhiệt độ cao Phương pháp chiết với dung môi etanol, nhằm thu hồi hoạt chất có hịa tan vào dịch etanol Phương pháp tiến hành nhiệt độ nhiệt độ 400C nên hoạt chất bị phân huỷ, cao chiết có khả pha lỗng với nước nên dễ phun tẩm vào thực nghiệm nồng độ thấp Với nồng độ 20% dịch chiết có khả bảo quản, ngăn cản vi khuẩn, nấm mốc phát triển, không làm trương nở dược liệu, loại tạp chất làm đơng vón chất nhày, albumin, gôm pectin…Tuy nhiên phương pháp dễ gây cháy nên đòi hỏi thao tác điều kiện an toàn Để tinh chế anthraquinone, dịch chiết nước axit hóa để chuyển anthraquynone dạng tan nước Dịch nước lắc chiết với etyl axetat, sau tiếp tục chiết với butanol Phần dung mơi butanol thu có hàm lượng anthraquinone cao so với dịch chiết nước ban đầu dịch chiết sử dụng cồn Nhược điểm phương pháp trải qua ba bước phức tạp, sử dụng hai loại dung mơi hữu khác Hóa chất tiến hành có nguy gây cháy nổ ảnh hưởng sức khỏe người làm việc không gian xung quanh Các sản phẩm thu chứa hàm lượng antharaquinon cao (hình ảnh sắc ký) đưa thử nghiệm theo hai hướng: Hướng 1: Kiểm tra hoạt tính ức chế cao chiết số vi khuẩn gây bệnh cho trái gây ngộ độc thức ăn người phịng thí nghiệm Phương pháp khuyếch tán giếng đĩa thạch với vi khuẩn gây hại Phương pháp khoanh giấy với vi khuẩn gây bệnh người Hướng 2: Thử nghiệm hiệu ức chế vi sinh vật gây bệnh trực tiếp trái 3.3 Thực nghiệm 3.3.1 Xay nhỏ Muồng khô nhằm tăng diện tích tiếp xúc dược liệu với dung môi 3.3.2 Tách chiết lấy hoạt chất từ Muồng: Cách 1: Tách chiết cao nước (sắc) (1,3 lít) cao màu đen chứa anthraquinone tạp chất (tinh bột, protein…) Cách 2: Tách chiết cao dung mơi etanol Lựa chọn nồng độ etanol thích hợp: Ngâm gam Muồng 20 ml etanol nồng độ 30 0, 500, 700, 960 Kết sau ngày: Màu dịch chiết Muồng etanol 300, 500 700 theo thứ tự có màu vàng đậm dần, chứng tỏ nồng độ etanol cao, lượng anthraquinone tan dịch chiết nhiều Dịch chiết etanol 960 có màu xanh đậm hịa tan nhiều chất diệp lục làm giảm độ tinh khiết anthraquinone dịch chiết Vì chúng tơi định chọn etanol 700 làm dung môi chiết 10 Cách 3: Tinh chế hoạt chất dịch chiết nước (thu từ hai lần chiết 100 gam muồng) với dung môi hữu thu cao chiết butanol 3.3.3 Kiểm tra anthraquinone tổng số mẫu cao Bằng phương pháp sử dụng sắc ký mỏng với kích thước: rộng cm; chân cm; khoảng cách chạy sắc ký 3,5 cm; khoảng cách chạy đỉnh 0,5 cm Ba mẫu cao chiết pha theo tỉ lệ mg cao ml dung môi etanol Lấy 10 l dịch chiết pha với loại đưa lên sắc ký mỏng (triển khai với hệ dung môi etyl axetat/etanol/nước = 4,5/3,5/2) 11 Các anthraquinone màu (màu cam) tác nhân KOH 5% etanol Kết cho thấy hàm lượng anthraquinone mẫu cao giảm dần theo thứ tự: Cao chiết butanol > Cao chiết cồn > Cao chiết nước 3.3.4 Kiểm tra hoạt tính cao chiết 3.3.4.1 Thí nghiệm với vi khuẩn phịng thí nghiệm 3.3.4.1.1 Kiểm tra hoạt tính ức chế cao chiết số vi sinh vật gây hại trái phương pháp khuyếch tán giếng đĩa thạch Phương pháp tiến hành sở phương pháp Hadacek et al (2000) [3] có điều chỉnh phù hợp với điều kiện phịng thí nghiệm Viện Cơng nghệ Mơi trường, Viện Hàn Lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam 12 Nguyên lý: Mỗi chủng vi khuẩn bị ức chế chất khác kiểm tra kháng khuẩn chất dựa vào khuyếch tán chất mơi trường phát triển vi khuẩn Nếu vi khuẩn bị ức chế tạo vịng vơ khuẩn xung quanh lỗ thạch có chứa chất thử Tiến hành: Các vi khuẩn gây bệnh (Xanthomonas axonopodis, Ralstonia solanacearum, Clavibacter michiganensis) ni kích hoạt 100 ml mơi trường MP lỏng nhiệt độ phịng Dịch ni cấy vi khuẩn bệnh sau ngày (50µL) cấy gạt đĩa petri chứa môi trường MPA (mỗi đĩa petri cấy chủng vi khuẩn nghiên cứu) Sử dụng ống sắt có đường kính d = cm (đã khử trùng lửa đèn cồn để nguội) để đục lỗ thạch đĩa petri cấy gạt vi khuẩn Dùng pipet hút 100 µl dịch chiết nồng độ khác cho vào lỗ thạch, đĩa để lỗ thạch nhỏ 100µl dung dịch pha loãng làm đối chứng Đĩa thạch ủ ấm nhiệt độ 27°C 24h - 48h sau quan sát vịng vơ khuẩn Kiểm tra vịng kháng khuẩn chụp ảnh sau 24h sau 48h ni cấy 13 Kết quả: Xuất vịng vơ khuẩn xung quanh giếng thạch (trên đĩa petri nuôi cấy chủng Xanthomonas axonopodis gây bệnh cho số loài ăn quả) nồng độ 500 µg / 100 µL nồng độ 1000 µg /100 µL Vịng kháng khuẩn với cao chiết etanol Vòng kháng khuẩn với cao chiết butanol 14 Vòng kháng khuẩn với cao chiết nước (sắc) 3.3.4.1.2 Kiểm tra hoạt tính ức chế cao chiết số vi khuẩn bệnh người phịng thí nghiệm phương pháp khoanh giấy Phương pháp đánh giá sở đánh giá độ nhạy cảm vi khuẩn với kháng sinh kiểm tra (CLSI [5]) sử dụng khoanh giấy: khoanh giấy tẩm dung dịch thuốc thử khuếch tán thạch (kỹ thuật Kirby-Bauer) [4,5] Nguyên lý: chủng vi khuẩn khác có mức độ nhạy cảm với khoanh giấy tẩm dung dịch thuốc thử khác nhau, biểu khác đường kính vùng ức chế xung quanh khoanh giấy khoanh giấy tẩm dung dịch thuốc thử có tiếp xúc vi khuẩn với khoanh giấy tẩm dung dịch thuốc thử Chuẩn bị: + Thạch Mueller - Hinton, để tủ ấm khoảng 15 phút cho khô mặt thạch trước làm kháng khuẩn; + Dung dịch thuốc thử  cao chiết nước nồng độ pha lỗng 200µg, 500 µg, 1000µg  cao chiết cồn etanol nồng độ pha lỗng 200µg, 500 µg, 1000µg  nước sắc muồng khơng đặc + Nhóm chứng; 15 + Chủng vi khuẩn: ATCC S aureus; ATCC E coli; V parahaemolyticus; V cholerae; Salmonella group D; S flexneri; Các chủng vi khuẩn phải khiết nuôi cấy sau 18 - 24 giờ; + Khoanh giấy tẩm dịch chiết Muồng với nồng độ khác để khô tự nhiên trước sử dụng Tiến hành: + Pha loãng vi khuẩn: dùng que cấy vơ trùng chấm vào ba điểm mặt thạch nghiêng có vi khuẩn khuẩn lạc chủng thạch đĩa (để tránh vi khuẩn đột biến), hịa tan vào ống nghiệm có chứa sẵn 1ml nước muối sinh lý vô trùng Lắc máy lắc Vortex So với độ đục chuẩn Mc Faland 0.5 máy đo độ đục, độ đục tương đương 10 CFU/ml (Colony Forming Unit) Nếu hỗn dịch vi khuẩn đục cho thêm nước muối sinh lý vô trùng, ngược lại cho thêm vi khuẩn để có độ đục độ đục chuẩn; + Ria cấy vi khuẩn: dùng que tăm vô trùng nhúng vào hỗn dịch 10 CFU/ml vi khuẩn Ép nhẹ tăm lên thành ống nghiệm cho bớt nước Ria hỗn dịch vi khuẩn lên mặt thạch cách vừa ria vừa xoay que tăm bông, đường ria chéo 1200C cho sau để tủ ấm khuẩn lạc vi khuẩn mọc sát vào mà không chồng lên nhau; + Đặt khoanh giấy tẩm dịch chiết Muồng : khoanh cách tối thiểu cm rìa khoanh giấy cách thành đĩa tối thiểu cm; + Để đĩa kháng sinh đồ nhiệt độ phòng 30 phút cho khoanh giấy tẩm dịch chiết Muồng khuếch tán mơi trường, sau để tủ ấm 350C qua đêm Đọc kết quả: Kết thử nghiệm khoa xét nghiệm viện Y học lâm sang bệnh nhiệt đới 16 Bạch Mai làm ngày 22/10, phương pháp khoanh giấy tẩm dung dịch thuốc thử khuếch tán thạch (kỹ thuật Kirby-Bauer) [4]: - Xuất rõ ràng vịng vơ khuẩn với chủng Tụ cầu vàng dịch chiết nồng độ 500 micro gram/ 100 microlít nồng độ 1000 microgram/ 100 microlít với loại cao dịch sắc không cô đặc (dịch sắc ngâm rau quả.) - Vịng vơ khuẩn khơng rõ với chủng Vibrio parahemolyticus E Coli - Khơng có vịng vô khuẩn với chủng thương hàn, lỵ, tả 3.3.4.2 Thử nghiệm hiệu ức chế vi sinh vật gây bệnh trực tiếp trái Nguyên liệu: Nguồn trái tươi, ( Hợp tác xã rau Vân nội Đơng Anh Hà Nội): Ổi; Khế; Cà chua; Bơ; Xồi; Chanh; Chuối; Đu đủ; Su su; Dưa chuột; Mướp đắng; Cà tím; Ớt 3.3.4.2.1 Mỗi loại trái thử nghiệm chia làm ba nhóm đối chứng Nhóm Nhóm Nhóm Ngày thử nghiệm: 24/09/2014 17 Nhóm 1: Trái không xử lý, để môi trường tự nhiên (K) Nhóm 2: Trái rửa sạch, ngâm nước muối loãng (0,9%) phút, để khơ tự nhiên (M) Nhóm 3: Trái ngâm dịch sắc Muồng phút, để khô tự nhiên (P) Kết quả: Nhóm Nhóm Nhóm Ngày kiểm tra 03/10/2014 18 Nhóm ngâm dịch sắc Muồng giữ tươi lâu hơn, không thối so với nhóm đối chứng từ đến ngày 3.3.4.2.2 Gây bệnh đốm đen trái (do nấm Colletotrichum gloeosporioides): Sau xử lý theo nhóm thí nghiệm (như mục 3.3.4.2.1.), trái gây bệnh cách lấy mầm bệnh từ bị bệnh (hớt lớp mỏng (0,2 mm); đường kính cm vỏ nơi bị bệnh), ép lên chỗ lớp vỏ khơng bị bệnh, cố định băng dính Theo dõi trình lây bệnh Quả bơ trước lây bệnh (Ngày 27/09/2014) Kết quả: Quả để tự nhiên Quả để tự nhiên Quả ngâm nước sắc Muồng (Ngày kiểm tra 28/09/2014) Quả ngâm nước sắc Muồng (Ngày kiểm tra 29/09/2014) 19 Ngày thử nghiệm 4/10/2014 Ngày kiểm tra 10/10/2014 Kết luận: Không bệnh Bị nhiễm nhiễm bệnh Nhóm bơ, sắc bị xồi, ổi ngâm dịch 70% 30% Nhóm bơ, xồi, ổi để tự nhiên 0% 100% 20 ... tiến hành chế tạo cao chiết từ Muồng; kiểm tra hiệu ức chế cao chiết với số vi khuẩn gây bệnh cho trái phịng thí nghiệm thử nghiệm khả bảo quản trái cao chiết Phần II TỔNG QUAN Cây Muồng hẹp... bệnh loét vi khuẩn) trái ngồi cịn ức chế phát triển chủng Tụ cầu vàng 2.1 Tính Sử dụng cao chiết chứa hoạt chất anthraquinone có Muồng để ức chế hiệu phát triển vi sinh vật gây hại trái hướng... µL Vòng kháng khuẩn với cao chiết etanol Vòng kháng khuẩn với cao chiết butanol 14 Vòng kháng khuẩn với cao chiết nước (sắc) 3.3.4.1.2 Kiểm tra hoạt tính ức chế cao chiết số vi khuẩn bệnh người