sử dụng nước sắc lá muồng (cassia angustifolia) để ức chế nấm mốc và vi khuẩn trong bảo quản trái cây

SỞ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO HÀ NỘI QUẬN TÂY HỒ TRƯỜNG THPT CHU VĂN AN ************** ĐỀ TÀI DỰ THI KHOA HỌC, KỸ THUẬT DÀNH CHO HỌC SINH TRUNG HỌC CẤP THÀNH PHỐ LẦN THỨ TƯ (NĂM HỌC 2014 - 2015). Tên đề tài: SỬ DỤNG CAO CHIẾT LÁ MUỒNG (CASSIA ANGUSTIFOLIA) ĐỂ ỨC CHẾ NẤM MỐC VÀ VI KHUẨN TRONG BẢO QUẢN TRÁI CÂY Lĩnh vực: Hóa sinh NGƯỜI HƯỚNG DẪN - TS. Lê Đăng Quang - Đơn vị công tác: Viện Hóa học công nghiệp Việt Nam TÁC GIẢ: 1. Phạm Anh Quân Lớp: 10 Hóa Trường: THPT Chu Văn An Hà Nội 2. Đoàn Quỳnh Chi Lớp:10 Sinh Trường: THPT Chu Văn An Hà Nội Hà Nội, tháng 11 năm 2014 1 MỤC LỤC Trang PHẦN I. Lý do chọn đề tài……………………………….3 PHẦN II Tổng quan………………………………………4 PHẦN III Qúa trình nghiên cứu và kết quả……………… 5 3.1. Cây Muồng………………………………………….5 3.2. Phương pháp chiết cao và hướng nghiên cứu……….6 3.3. Thực nghiệm…………………………………………7 3.3.1. Xay Muồng……………………………… 7 3.3.2. Tách chiết lấy hoạt chất từ lá Muồng…… 7 3.3.3. Kiểm tra anthraquinone tổng số………….10 3.3.4. Kiểm tra hoạt tính của cao chiết………….11 PHẦN IV Kết luận…………………………………….….20 2 PHẦN I LÝ DO CHỌN ĐỀ TÀI Vi sinh vật (như nấm mốc và vi khuẩn) làm trái cây bị hư hỏng và có thể gây bệnh đối với người sử dụng. Các biện pháp bảo quản trái cây, chống lại các vi sinh vật gây bệnh đã được tìm hiểu từ lâu. Bảo quản trái cây có thể thực hiện bằng phương pháp sơ chế vật lý như chiếu xạ, bao gói bằng màng bán thấm - điều hòa khí hoặc đưa về môi trường bảo quản bất lợi đối với sự phát triển của vi sinh vật, nhưng các phương pháp này phức tạp và nhiều tốn kém. Trái cây cũng được bảo quản nhờ phương pháp xử lý bằng hóa chất [1,2], tuy nhiên có nhiều loại hóa chất độc hại cho sức khỏe của người sản xuất và tiêu dùng như: hóa chất nguồn gốc organophosphate, carbamate, dẫn xuất của DDT, carbenadazim, auxin, 2,4-D và các chất diệt cỏ đã bị cấm hoàn toàn hoặc một phần trong điều kiện sống hiện tại. Để đáp ứng được yêu cầu chất lượng hiện nay của các cơ quan quản lý và chức năng như Cục Bảo Vệ Thực Vật, Cục Vệ Sinh An Toàn Thực Phẩm, việc tạo ra các loại thuốc bảo quản trái cây với quy trình công nghệ đơn giản, thân thiện với môi trường, không độc hại, có nguồn gốc từ các nguyên liệu thảo mộc, thực vật làm thuốc hoặc sàng lọc hoạt tính trong điều kiện nghiên cứu hóa học, sinh học hiện tại là hết sức cần thiết. Thực tế cho thấy nhiều loại cây cỏ đã được sử dụng để trị bệnh, trong đó lá Muồng là một loại thảo dược có tác dụng trong việc gây xổ ở những trường hợp táo bón. Tra cứu tiếp từ nguồn tài liệu về cây cỏ làm thuốc, nguyên liệu lá Muồng còn được biết có hiệu quả ức chế khối u, kháng viêm và đặc biệt có nhiều hoạt tính ức chế vi sinh vật gây bệnh đường ruột đối với người. Như vậy, lá Muồng có khả năng ức chế sự phát triển của vi sinh vật gây hại trên trái cây hay không??? vấn đề này hiện nay vẫn chưa được nghiên cứu rộng rãi trong nước và trên thế giới. Xuất phát từ các lý do nêu trên, chúng em tiến hành chế tạo cao chiết từ lá Muồng; kiểm tra hiệu quả ức chế của cao chiết này với một số vi khuẩn gây 3 bệnh cho trái cây trong phòng thí nghiệm và thử nghiệm khả năng bảo quản trái cây của cao chiết. Phần II TỔNG QUAN Cây Muồng lá hẹp (tên khoa học: Cassia angustifolia Vahl; họ: Caesalpinaceae), được trồng tại các nước nhiệt đới, thuộc họ Muồng. Lá Muồng được sử dụng làm thuốc để trị bệnh táo bón (Atal et al. 1982; Das et. 2003; Martindale, 1997; Sharma, 2004), kháng viêm, ức chế khối u… trên cơ thể người. Thực nghiệm cho thấy cao chiết thu được từ nguồn nguyên liệu lá Muồng (bằng các phương pháp chiết khác nhau) đều có chứa hoạt chất anthraquinone. Các cao chiết đều ức chế có hiệu quả sự phát triển của nấm Colletotrichum gloeosporioides (gây bệnh đốm đen); vi khuẩn Xanthomonas axonopodis (gây bệnh loét vi khuẩn) trên trái cây và ngoài ra còn ức chế sự phát triển của chủng Tụ cầu vàng. 2.1. Tính mới Sử dụng cao chiết chứa hoạt chất anthraquinone có trong lá Muồng để ức chế hiệu quả sự phát triển của vi sinh vật gây hại trên trái cây là một hướng đi mới của đề tài. 2.2. Tính sáng tạo Việc sử dụng lá Muồng - nguồn nguyên liệu rẻ tiền, sẵn có, không độc hại với con người và thân thiện với môi trường, để chiết lấy cao chứa anthraquinone bằng quy trình công nghệ đơn giản, dễ thực hiện: phương pháp chiết với dung môi nước (sắc) là một ý tưởng sáng tạo. 4 Phần III QUÁ TRÌNH NGHIÊN CỨU VÀ KẾT QUẢ 3.1. Cây Muồng Cây Muồng lá hẹp (tên khoa học: Cassia angustifolia Vahl; họ: Caesalpinaceae), được trồng tại các nước nhiệt đới, thuộc họ Muồng. Trong cây Muồng lá hẹp có chứa sennoside A, B, C và D (Hayashi et al. 1980); kaemferol; phytosterols (Khorama và Sanghvi, 1964); rhein; glylcoside của rhein và chrysophanic acid. Vỏ và lá của cây chứa hoạt chất chính là sennosides A và B được sử dụng rộng rãi trong y học vì chúng có tính nhuận tràng. 5 Muồng lá hẹp có vị ngọt, đắng, tính hàn, qui kinh Đại tràng, là loại cây có giá trị y dược cao. Từ thế kỷ thứ 9, cây Muồng lá hẹp đã được dùng làm thuốc tại các nước Ả rập, đến thời kỳ cận đại mới truyền vào Trung quốc. Cây Muồng lá hẹp có tác dụng nhuận tràng, được sử dụng để trị bệnh táo bón (Atal et al. 1982; Das et. 2003; Martindale, 1997; Sharma, 2004), kháng viêm, ức chế khối u… 6 Lá Muồng nghiên cứu trong đề tài được mua tại cửa hàng bán thuốc đông y dưới dạng lá đã sấy khô. 3.2. Phương pháp chiết cao và hướng nghiên cứu Bằng một số phương pháp chiết với dung môi nước hoặc dung môi hữu cơ như etanol, nhóm nghiên cứu đã tiến hành tách hoạt chất anthraquinone khỏi thực vật, sau đó cô đuổi dung môi để thu được cao chiết. Phương pháp chiết với dung môi nước (sắc), dùng để thu hồi các hoạt chất có trong lá cây hòa tan vào dịch nước. Phương pháp này rẻ tiền, dễ thực hiện, tuy nhiên dịch chiết thu được có nhiều tạp chất, có thể gây thuỷ phân một số hoạt chất (glycoside, ancaloid) hoặc gây phân huỷ một số hoạt chất khi tiến hành ở nhiệt độ cao. Phương pháp chiết với dung môi etanol, nhằm thu hồi các hoạt chất có trong lá cây hòa tan vào dịch etanol. Phương pháp này tiến hành ở nhiệt độ ở nhiệt độ dưới 40 0 C nên hoạt chất ít bị phân huỷ, cao chiết có khả năng pha loãng với nước nên dễ phun hoặc tẩm vào quả thực nghiệm ở các nồng độ thấp hơn. Với nồng độ trên 20% dịch chiết có khả năng bảo quản, ngăn cản vi khuẩn, nấm mốc phát triển, không làm trương nở dược liệu, có thể loại tạp chất do làm đông vón chất nhày, albumin, gôm pectin…Tuy nhiên phương pháp này dễ gây cháy nên đòi hỏi thao tác trong điều kiện an toàn. Để tinh chế anthraquinone, dịch chiết nước được axit hóa để chuyển anthraquynone về dạng ít tan trong nước. Dịch nước này được lắc chiết với etyl axetat, sau đó tiếp tục chiết với butanol. Phần dung môi butanol thu được có hàm lượng các anthraquinone cao hơn so với dịch chiết nước ban đầu và dịch chiết sử dụng cồn. Nhược điểm của phương pháp này là trải qua ba bước chính phức tạp, sử dụng hai loại dung môi hữu cơ khác nhau. Hóa chất tiến hành có nguy cơ gây cháy nổ và ảnh hưởng sức khỏe người làm việc trong không gian xung quanh. Các sản phẩm thu được chứa hàm lượng antharaquinon cao (hình ảnh sắc ký) sẽ được đưa thử nghiệm theo hai hướng: 7 Hướng 1: Kiểm tra hoạt tính ức chế của cao chiết đối với một số vi khuẩn gây bệnh cho trái cây và gây ngộ độc thức ăn trên người trong phòng thí nghiệm. 1. Phương pháp khuyếch tán giếng trên đĩa thạch với vi khuẩn gây hại cây 2. Phương pháp khoanh giấy với vi khuẩn gây bệnh trên người Hướng 2: Thử nghiệm hiệu quả ức chế vi sinh vật gây bệnh trực tiếp trên trái cây. 3.3. Thực nghiệm 3.3.1. Xay nhỏ lá Muồng khô nhằm tăng diện tích tiếp xúc của dược liệu với dung môi. 3.3.2. Tách chiết lấy hoạt chất từ lá Muồng: Cách 1: Tách chiết cao bằng nước (sắc) 8 (1,3 lít) cao màu đen chứa anthraquinone và tạp chất (tinh bột, protein…). Cách 2: Tách chiết cao bằng dung môi etanol Lựa chọn nồng độ etanol thích hợp: Ngâm 2 gam lá Muồng trong 20 ml etanol ở các nồng độ lần lượt là 30 0 , 50 0 , 70 0 , 96 0 . Kết quả sau một ngày: 9 Màu dịch chiết lá Muồng trong etanol 30 0 , 50 0 và 70 0 theo thứ tự có màu vàng đậm dần, chứng tỏ nồng độ etanol càng cao, lượng anthraquinone tan trong dịch chiết càng nhiều. Dịch chiết etanol 96 0 có màu xanh đậm do hòa tan nhiều chất diệp lục làm giảm độ tinh khiết của anthraquinone trong dịch chiết. Vì vậy chúng tôi quyết định chọn etanol 70 0 làm dung môi chiết. 10 [...]... vật, sử dụng để bảo quản hoa quả 2- Hiệu quả ức chế sự phát triển vi sinh vật gây bệnh cho cây của dịch chiết với dung môi nước (sắc) tương đương dịch chiết etanol và dịch chiết butanol 3- Dịch chiết xuất từ lá Muồng ức chế có hiệu quả vi sinh vật gây bệnh cho trái cây - Ức chế sự lây bệnh do nấm mốc Colletotrichum gloeosporioides gây bệnh đốm đen trên quả bơ, quả ổi, quả xoài - Ức chế vi khuẩn Xanthomonas... Nhóm 2: Trái cây được rửa sạch, ngâm trong nước muối loãng (0,9%) trong 5 phút, để khô tự nhiên (M) Nhóm 3: Trái cây được ngâm trong dịch sắc lá Muồng trong 5 phút, để khô tự nhiên (P) Kết quả: Nhóm 2 Nhóm 1 Nhóm 3 Ngày kiểm tra 03/10/2014 18 Nhóm quả ngâm dịch sắc lá Muồng giữ được tươi lâu hơn, không thối so với nhóm đối chứng từ 6 đến 8 ngày 3.3.4.2.2 Gây bệnh đốm đen trên trái cây (do nấm Colletotrichum... dịch sắc không bị nhiễm bệnh PHẦN IV 21 KẾT LUẬN 1- Chế tạo thành công một loại cao chiết từ lá Muồng (Cassia angustifolia) bằng cách sắc với nước hoặc chiết với cồn 70° Các loại cao chiết đều có chứa các hoạt chất hóa học là các anthraquinone và có hiệu quả ức chế gây bệnh trên trái cây như bơ, ổi, xoài và chanh Cao chiết này có tính an toàn cao, có thể sử dụng làm thành thuốc bảo vệ thực vật, sử dụng. .. Không bệnh Bị lá nhiễm nhiễm bệnh Nhóm bơ, sắc bị xoài, ổi ngâm dịch cây 70% 30% Nhóm bơ, xoài, ổi để tự nhiên 0% 100% 3.3.4.2.3 Gây bệnh loét vi khuẩn trái cây: (do chủng vi khuẩn Xanthomonas axonopodis) 20 Phân chia chanh trên cây thành 3 nhóm thí nghiệm: nhóm ngâm dịch sắc lá Muồng; nhóm ngâm nước muối và nhóm để tự nhiên, không xử lý Dùng tăm bông thấm dung dịch nuôi cấy chủng vi khuẩn Xanthomonas... kháng khuẩn của một chất dựa vào sự khuyếch tán của chất đó trên môi trường phát triển của vi khuẩn Nếu vi khuẩn bị ức chế sẽ tạo ra vòng vô khuẩn xung quanh lỗ thạch có chứa chất thử Tiến hành: Các vi khuẩn gây bệnh cây (Xanthomonas axonopodis, Ralstonia solanacearum, Clavibacter michiganensis) được nuôi kích hoạt trong 100 ml môi trường MP lỏng ở nhiệt độ phòng Dịch nuôi cấy vi khuẩn bệnh cây sau... lại nếu trong hơn cho thêm vi khuẩn để có độ đục bằng độ đục chuẩn; + Ria cấy vi khuẩn: dùng que tăm bông vô trùng nhúng vào hỗn dịch 10 8 CFU/ml vi khuẩn Ép nhẹ tăm bông lên thành ống nghiệm cho bớt nước Ria đều hỗn dịch vi khuẩn lên mặt thạch bằng cách vừa ria vừa xoay que tăm bông, các đường ria chéo nhau 1200C sao cho sau khi để tủ ấm các khuẩn lạc vi khuẩn mọc sát vào nhau mà không chồng lên nhau;... trên cây và trong phòng thí nghiệm - Ức chế vi khuẩn Tụ cầu vàng (Staphilococus aureus) hay gây ngộ độc thực phẩm - Tăng thời gian bảo quản trái cây như Bơ, Xoài, Ổi, Đu Đủ, Chanh 4- Đề tài sẽ tiếp tục nghiên cứu sâu hơn về thành phần hóa học của cao chiết, tiến hành nhiều thí nghiệm lặp lại, và sẽ có những đánh giá có giá trị hơn sau khi các nghiên cứu khoa học hoàn chỉnh Cao chiết có thể ứng dụng. .. nghiên cứu khoa học hoàn chỉnh Cao chiết có thể ứng dụng làm thuốc bảo quản trái cây khi đã đủ điều kiện để đáp ứng yêu cầu đăng ký của Cục Bảo Vệ Thực Vật 5- Đề tài có thể còn được phát triển tiếp theo hướng nghiên cứu về khả năng ức chế thêm một số vi khuẩn gây bệnh cho cây, gây ngộ độc thức ăn ở người 22 TÀI LIỆU THAM KHẢO: 1 Vi n cây ăn quả Miền Nam: http://sofri.org.vn/Default.aspx? l=&pg=1&cat=1&catdetail=6... 3.3.4.2.1.), trái cây được gây bệnh bằng cách lấy mầm bệnh từ quả bị bệnh (hớt một lớp mỏng (0,2 mm); đường kính 1 cm trên vỏ nơi quả bị bệnh), ép lên chỗ lớp vỏ quả không bị bệnh, cố định bằng băng dính trong Theo dõi quá trình lây bệnh Quả bơ trước khi lây bệnh (Ngày 27/09/2014) Kết quả: Quả để tự nhiên Quả ngâm nước sắc lá Muồng (Ngày kiểm tra 28/09/2014) Quả để tự nhiên Quả ngâm nước sắc lá Muồng (Ngày... 1000µg  nước sắc lá muồng không cô đặc + Nhóm chứng; 15 + Chủng vi khuẩn: ATCC S aureus; ATCC E coli; V parahaemolyticus; V cholerae; Salmonella group D; S flexneri; Các chủng vi khuẩn phải thuần khiết được nuôi cấy sau 18 - 24 giờ; + Khoanh giấy tẩm dịch chiết lá Muồng với nồng độ khác nhau để khô tự nhiên trước khi sử dụng Tiến hành: + Pha loãng vi khuẩn: dùng que cấy vô trùng chấm vào ít nhất ba điểm . tài: SỬ DỤNG CAO CHIẾT LÁ MUỒNG (CASSIA ANGUSTIFOLIA) ĐỂ ỨC CHẾ NẤM MỐC VÀ VI KHUẨN TRONG BẢO QUẢN TRÁI CÂY Lĩnh vực: Hóa sinh NGƯỜI HƯỚNG DẪN - TS. Lê Đăng Quang - Đơn vị công tác: Vi n. nấm mốc và vi khuẩn) làm trái cây bị hư hỏng và có thể gây bệnh đối với người sử dụng. Các biện pháp bảo quản trái cây, chống lại các vi sinh vật gây bệnh đã được tìm hiểu từ lâu. Bảo quản trái. chất anthraquinone có trong lá Muồng để ức chế hiệu quả sự phát triển của vi sinh vật gây hại trên trái cây là một hướng đi mới của đề tài. 2.2. Tính sáng tạo Vi c sử dụng lá Muồng - nguồn nguyên