Nghiên cứu phát triển bộ sinh phẩm chẩn đoán vi khuẩn lao

I.GIỚI THIỆU 1.LÝ DO CHỌN ĐỀ TÀI Bệnh Lao (Mycobacterium Tuberculosis MTB) – Tác nhân gây bệnh nhiễm trùng chiếm tỉ lệ tử vong hàng đầu tại các Quốc gia đang phát triển trong khoảng 15 năm trở lại đây. Cùng với sự bùng phát của đại dịch HIV trên toàn cầu, môi trường sống ngày càng suy thoái, người nhập cư từ các quốc gia kém phát triển, bệnh nhân mắc lao bỏ điều trị … ảnh hưởng trực tiếp tới khả năng miễn dịch của con người và sức khỏe cộng đồng, và quan trọng nhất sự quay trở lại của bệnh lao – lao kháng thuốc đã đặt nhân loại một lần nữa đối diện với đại dịch lao tưởng như đã được thanh toán ở thế kỷ trước. Còn tại các nước phát triển, nơi bệnh lao về cơ bản được khống chế thì bệnh lao không điển hình (Nontubercolusis Mycobacterium – NTM) lại là tác nhân gây nhiễm trùng âm thầm và nguy hại đối với các bệnh nhân mắc bệnh liên quan đến tình trạng miễn dịch. Tại Việt Nam, nếu trực khuẩn mủ xanh (Pseudomonas aeruginosa) là tác nhân gây nhiễm trùng bệnh viện hàng đầu thì NTM âm thầm đứng ở vị trí thứ 2 về độ nguy hiểm, và tác hại to lớn của nó với bản thân bệnh nhân, liệu trình điều trị đã gây ra tổn thất nặng nề về kinh tế, và tâm lý cho người bệnh. Thông thường một trường hợp nuôi cấy xác định có vi khuẩn lao M.tuberculosis thì vấn đề điều trị thường đặt ra sớm. Nhưng với một trường hợp nuôi cấy NTM (+) thì không phải lúc nào cũng đặt vấn đề điều trị mà cần phải cần nhắc giữa nguy cơ và lợi ích cho người bệnh. Ngoài ra còn thấy rằng có sự khó khăn trong việc điều trị phức tạp và kéo dài cần kết hợp nhiều loại thuốc hoặc sự nhiễm đồng thời nhiều loại bệnh cơ hội khác cùng NTM. Vì vậy, việc xác định rõ ràng căn nguyên gây bệnh nhiễm trùng do NTM và các vấn đề liên quan mang tính cấp thiết và thời sự đối với ngành Y tế hiện nay. Từ những thống kê nêu trên, nhóm nghiên cứu quyết định tiến hành đề tài “Nghiên cứu phát triển bộ sinh phẩm chẩn đoán vi khuẩn lao không điển hình trên bệnh nhân nghi mắc bệnh lao tại Việt Nam” nhằm thiết kế một bộ sinh phẩm đơn giản, hiệu quả, an toàn và có giá trị thực tiễn và tính linh động cao

SỞ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO HÀ NỘI TRƯỜNG THPT CHUYÊN HÀ NỘI-AMSTERDAM QUẬN CẦU GIẤY ************** ĐỀ TÀI DỰ THI KHOA HỌC, KỸ THUẬT DÀNH CHO HỌC SINH TRUNG HỌC CẤP THÀNH PHỐ LẦN THỨ TƯ (NĂM HỌC 2014 - 2015) Tên đề tài: NGHIÊN CỨU PHÁT TRIỂN BỘ SINH PHẨM CHẨN ĐỐN VI KHUẨN LAO KHƠNG ĐIỂN HÌNH (NONTUBERCULOSIS MYCOBACTERIA - NTM) TRÊN BỆNH NHÂN NGHI MẮC BỆNH LAO TẠI VIỆT NAM Lĩnh vực: Y- Sinh NGƯỜI HƯỚNG DẪN TÁC GIẢ: - Th.S Phan Minh Tuấn Nguyễn Cơng Minh - Phịng Phát triển Cơng nghệ Y-Sinh, Trung tâm phát triển công nghệ cao, Viện Hàn lâm Khoa học kĩ thuật Việt Nam Nguyễn Trọng Hiếu Lớp: 12 Sinh - Trường THPT Chuyên Hà Nội Amsterdam Lớp: 12 Sinh - Trường THPT Chuyên Hà Nội Amsterdam Hà Nội, tháng 12 năm 2014 LỜI CẢM ƠN Nhóm nghiên cứu xin chân thành cảm ơn công ty Intel tổ chức Hội thi Khoa học trẻ Intel ISEF toàn giới, cảm ơn Bộ Giáo dục Đào tạo Việt Nam, Sở Giáo dục Đào tạo Hà Nội chi nhánh công ty ISEF Việt Nam phối hợp tổ chức nên hội thi Việt Nam, tạo hội cho nhóm tiếp cận gần với hoạt động khoa học trẻ toàn giới Đây hội tốt cho nhóm nghiên cứu nói riêng học sinh Hà Nội học sinh Việt Nam nói chúng có dịp đào sâu kiến thức, đưa ý tưởng khoa học thực hóa, làm quen kỹ mềm khác, giao lưu học hỏi với bạn bè nước quốc tế Trong trình thực đề tài, nhóm nhận quan tâm đạo, góp ý chân thành Ban Giám hiệu Nhóm Khoa học tạo điều kiện thầy cô giáo trường THPT Hà Nội Amsterdam Đồng thời, hỗ trợ phịng phát triến cơng nghệ Y Sinh, Trung tâm phát triển công nghệ cao thuộc viện hàn lâm khoa học công nghệ Việt Nam mặt địa điểm, sở vật chất, trang thiết bị, dụng cụ thí nghiệm vơ q giá với nhóm nghiên cứu suốt thời gian nghiên cứu Nhóm thực đề tài nhận hỗ trợ vơ nhiệt tình giáo viên hướng dẫn: ThS Trần Thị Thu Hương, cô Nguyễn Thị Hưởng chuyên gia ThS Phan Minh Tuấn, ThS Nguyễn Chi Mai KS Lê Thành Long hỗ trợ hết lịng mặt lí thuyết kĩ năng, nhờ mà nhóm nghiên cứu hồn thành đề tài Một lần nữa, nhóm xin gửi lời cảm ơn chân thành đến cá nhân, tập thể tổ chức đóng góp quý báu ủng hộ nhiệt tình suốt thời gian thực đề tài Nhóm nghiên cứu Mục lục TÓM TẮT I GIỚI THIỆU LÝ DO CHỌN ĐỀ TÀI .6 MỤC TIÊU ĐỀ TÀI TÍNH MỚI VÀ SÁNG TẠO CỦA ĐỀ TÀI II.NỘI DUNG NGHIÊN CỨU KHÁI NIỆM CHUNG TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRONG VÀ NGỒI NƯỚC .9 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU VÀ CÁC KỸ THUẬT SỬ DỤNG .10 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU VÀ KẾT QUẢ DỰ KIẾN 12 III QUÁ TRÌNH NGHIÊN CỨU 13 THU THẬP, VẬN CHUYỂN, BẢO QUẢN MẪU BỆNH PHẨM VÀ CHỦNG VI KHUẨN 13 XỬ LÝ VÀ KHỬ TẠP MẪU BỆNH PHẨM 14 TÁCH CHIẾT DNA TỔNG SỐ TỪ MAC 14 KIỂM TRA KẾT QUẢ SẢN PHẨM PCR 15 GIẢI TRÌNH TỰ NUCLEOTIDE VÀ PHÂN TÍCH TRÌNH TỰ GENE TRÊN PHẦN MỀM CHUYÊN DỤNG 20 IV.KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 24 KẾT QUẢ TÁCH CHIẾT DNA TỔNG SỐ 24 KẾT QUẢ NHÂN GENE(PCR) 24 KẾT QUẢ PHÂN TÍCH TRÌNH TỰ NUCLEOTIDE 27 THỜI GIAN HOÀN THÀNH MỘT LẦN XÉT NGHIỆM 27 IV KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .28 KẾT LUẬN 28 KIẾN NGHỊ .28 TÀI LIỆU THAM KHẢO 29 PHỤ LỤC 31 Mục lục bảng Bảng Thành phần phản ứng PCR 11 Bảng Chu kỳ nhiệt thông thường cho phản ứng PCR 11 Bảng Danh sách mẫu .13 Bảng Chu kì nhiệt cho phản ứng PCR khuếch đại DNA tổng số thu từ mẫu 19 Bảng Thành phần phản ứng PCR đọc trình tự .20 Mục lục hình ảnh Hình 1: MAC môi trường Lowenstein – Jensen sau tuần nuôi cấy Hình Tỉ lệ ca bệnh vi khuẩn nhóm NTM gây khu vực châu Á Hình 3: Ảnh minh họa liệu tìm kiếm thơng tin qua từ khóa “mycobacterium” cổng thông tin NCBI 16 Hình 4: Ảnh minh họa liệu tìm kiếm nucleotide thơng qua từ khóa “mycobacterium 16S” cổng thơng tin NCBI 17 Hình 5: Ảnh minh họa liệu tìm kiếm nucleotide thơng qua từ khóa “mycobacterium rpoB” cổng thơng tin NCBI 17 Hình 6: Ảnh minh họa liệu tìm kiếm nucleotide thơng qua từ khóa “mycobacterium hsp65” cổng thơng tin NCBI 18 Hình 7: Chu kỳ nhiệt cho phản ứng PCR đọc trình tự .21 Hình 8: Kết trình tự so sánh với mẫu đối chứng 22 Hình 9: Kết trình tự so sánh với ngân hàng genethế giới (Genbank) để tìm tương đồng .23 Hình 10: Ảnh điện di kiểm tra DNA tổng số tách từ mẫu NTM1 theo quy trình tách chiết 24 Hình 11: Kết điện thí nghiệm tìm nhiệt độ bắt cặp nồng độ DNA tổng số phù hợp 25 Hình 12: Kết điện di sản phẩm PCR 26 TÓM TẮT Cho đến thời điểm tại, vào kỷ thứ 21, vi khuẩn lao gây vấn đề trầm trọng cho y tế sức khỏe cộng đồng Mặc dù đầu tư cho y tế tốt nhiều với phương tiện trang thiết bị máy móc đại, phương pháp chẩn đoán hiệu làm giảm thiểu ca lây truyền nhiễm lao mới, tượng mắc lao khơng điển hình (Nontuberculosis mycobacteria - NTM) lại gia tăng đối tượng bệnh nhân có tình trạng suy giảm miễn dịch, có tiền sử bệnh lý mãn tính phổi hay có bất thường kiểu genecủa bệnh xơ hóa kén, α-antitrypsin, interferon-gamma (IFN-), interleukin-12 Tại Việt Nam, việc chẩn đoán NTM bệnh viện sở y tế từ trước đến sử dụng phương pháp nuôi cấy vi sinh truyền thống cho kết chậm (15 – 20 ngày) thường xuyên bị tạp nhiễm, nên khả đặc hiệu chẩn đoán thấp Ở lĩnh vực chẩn đoán phân tử gần chưa có nghiên cứu vấn đề triển khai ghi nhận Cũng phải nói việc chẩn đốn cận lâm sàng NTM sở y tế Việt Nam chưa đầu tư nghiên cứu cách có bản, điều góp phần đưa bệnh lao khơng điển hình NTM âm thầm bùng phát gây tác hại lớn đến sức khỏe kinh tế người bệnh Do vậy, Nhóm nghiên cứu đề xuất nghiên cứu sử dụng kỹ thuật chẩn đoán phân tử đại việc chẩn đoán phát sớm có mặt vi khuẩn lao khơng điển hình (NTM) mẫu bệnh phẩm bệnh nhân nghi mắc lao không đáp ứng với công thức điều trị lao thông thường, mục tiêu nghiên cứu tập trungtối ưu khâu trình thực khâu xử lý mẫu, tách chiết DNA vi khuẩn từ mẫu bệnh phẩm khâu xác định kết theo hướng đơn giản, dễ thao tác, hạn chế tối đa khả nhiễm chéo mẫu xét nghiệm, an tồn cho người sử dụng thân thiện với mơi trường Từ khóa: Mycobacterium tuberculosis (MTB), Non Tubercolusis Mycobacterium (NTM), Mycobacterium avium complex (MAC), PCR, lao điển hình, lao khơng điển hình, lao mơi trường I GIỚI THIỆU LÝ DO CHỌN ĐỀ TÀI Bệnh Lao (Mycobacterium Tuberculosis - MTB) – Tác nhân gây bệnh nhiễm trùng chiếm tỉ lệ tử vong hàng đầu Quốc gia phát triển khoảng 15 năm trở lại Cùng với bùng phát đại dịch HIV toàn cầu, mơi trường sống ngày suy thối, người nhập cư từ quốc gia phát triển, bệnh nhân mắc lao bỏ điều trị … ảnh hưởng trực tiếp tới khả miễn dịch người sức khỏe cộng đồng, quan trọng quay trở lại bệnh lao – lao kháng thuốc đặt nhân loại lần đối diện với đại dịch lao tưởng toán kỷ trước Còn nước phát triển, nơi bệnh lao khống chế bệnh lao khơng điển hình (Nontubercolusis Mycobacterium – NTM) lại tác nhân gây nhiễm trùng âm thầm nguy hại bệnh nhân mắc bệnh liên quan đến tình trạng miễn dịch Tại Việt Nam, trực khuẩn mủ xanh (Pseudomonas aeruginosa) tác nhân gây nhiễm trùng bệnh viện hàng đầu NTM âm thầm đứng vị trí thứ độ nguy hiểm, tác hại to lớn với thân bệnh nhân, liệu trình điều trị gây tổn thất nặng nề kinh tế, tâm lý cho người bệnh Thông thường trường hợp ni cấy xác định có vi khuẩn lao M.tuberculosis vấn đề điều trị thường đặt sớm Nhưng với trường hợp nuôi cấy NTM (+) khơng phải lúc đặt vấn đề điều trị mà cần phải cần nhắc nguy lợi ích cho người bệnh Ngồi cịn thấy có khó khăn việc điều trị phức tạp kéo dài cần kết hợp nhiều loại thuốc nhiễm đồng thời nhiều loại bệnh hội khác NTM Vì vậy, việc xác định rõ ràng nguyên gây bệnh nhiễm trùng NTM vấn đề liên quan mang tính cấp thiết thời ngành Y tế Từ thống kê nêu trên, nhóm nghiên cứu định tiến hành đề tài “Nghiên cứu phát triển sinh phẩm chẩn đốn vi khuẩn lao khơng điển hình bệnh nhân nghi mắc bệnh lao Việt Nam” nhằm thiết kế sinh phẩm đơn giản, hiệu quả, an toàn có giá trị thực tiễn tính linh động cao MỤC TIÊU ĐỀ TÀI Đề tài thực nhằm mục tiêu nghiên cứu, phát triển bước đầu ứng dụng sinh phẩm việc xác định chẩn đốn có mặt vi khuẩn NTM (cụ thể MAC-Mycobacterium avium complex) đối tượng nghi mắc bệnh lao không đáp ứng với phương pháp điều trị lao truyền thống mức độ phịng thí nghiệm Kết nghiên cứu đề tài công cụ hữu hiệu hỗ trợ đắc lực cho ngành chẩn đoán cận lâm sàng bệnh viện, trung tâm y tế đấu tranh chống lại bệnh nhiễm trùng NTM nguyên, nhằm giảm bớt thiệt hại tình trạng sức khỏe, thời gian, tâm lý tài bệnh nhân cộng đồng xã hội TÍNH MỚI VÀ SÁNG TẠO CỦA ĐỀ TÀI -Vi khuẩn gây bệnh NTM chủng vi khuẩn mà vi khuẩn ghi nhận phân bố phổ biến rộng rãi mơi trường tồn cầu Tuy nhiên, đặc tính thích nghi vi khuẩn tùy thuộc vào môi trường phát triển tồn mà độc lực hệ gene chúng thay đổi tùy theo mơi trường điều kiện sống Vì thế, mục tiêu đề tài nhằm xác định chủng vi khuẩn NTM tồn tại Việt Nam liệu có thay đổi so với chủng NTM ghi nhận quốc gia khác Nếu có, thay đổi gì? có mang tính đặc hữu vùng miền hay khơng? có ảnh hưởng đến khả sinh trưởng, phát triển đặc tính gây bệnh hay không? Nội dung chưa ghi nhận nghiên cứu Việt Nam - Ngoài ra, sinh phẩm, nghiên cứu phát triển thành cơng, vũ khí hữu hiệu hỗ trợ cho ngành chẩn đoán cận lâm sàng với tiêu chí: đơn giản, giá thành thấp, hiệu sử dụng có tính ứng dụng cao II.NỘI DUNG NGHIÊN CỨU KHÁI NIỆM CHUNG NTM nhóm vi khuẩn họ với vi khuẩn lao gây bệnh phổi, điểm khác biệt phân tán rộng rãi mơi trường, đặc tính gây bệnh linh động không lây từ người sang người khác NTM có 140 lồi khác khơng thiết liên quan đến bệnh lao nên gọi tên khác Vi khuẩn lao khơng điển hình (atypical tuberculosis), vi khuẩn lao hội (opportunitic tuberculosis), vi khuẩn lao môi trường (environmental tuberculosis) Những nghiên cứu dịch tễ gần ghi nhận gia tăng ca bệnh NTM xảy toàn cầu với tỉ lệ cao bệnh lao truyền thống Hình 1: MAC mơi trường Lowenstein – Jensen sau tuần nuôi cấy Triệu chứng lâm sàng bệnh biểu phổi phổi, biểu phổi thường gặp Các triệu chứng tồn thân thường khơng đặc hiệu sốt nhẹ chiều, mệt mỏi, gầy sút ăn uống kém. Các triệu chứng chỗ bao gồm ho, ho khan, ho khạc đờm kéo dài Triệu chứng phổi thường triệu chứng bệnh lao Ngoài trường hợp nhiễm trùng biểu số quan hạch, da, vết mổ… cịn có thể gặp tình trạng bệnh tồn phát đa quan 10 ... nêu trên, nhóm nghiên cứu định tiến hành đề tài ? ?Nghiên cứu phát triển sinh phẩm chẩn đốn vi khuẩn lao khơng điển hình bệnh nhân nghi mắc bệnh lao Vi? ??t Nam” nhằm thiết kế sinh phẩm đơn giản,... trình tự vi khuẩn lao (M tuberculosis); 61847 trình tự vi khuẩn lao khơng điển hình M avium (hình 1) Từ số liệu cho thấy hệ genecủa vi khuẩn lao vi khuẩn lao không điển hình nghiên cứu sâu phổ... định sinh phẩm 14 III QUÁ TRÌNH NGHIÊN CỨU THU THẬP, VẬN CHUYỂN, BẢO QUẢN MẪU BỆNH PHẨM VÀ CHỦNG VI KHUẨN 1.1 Thu thập mẫu bệnh phẩm chủng vi khuẩn chủng vi khuẩn MAC có nguồn gốc từ Bệnh vi? ??n