Luận văn thạc sĩ HUS nghiên cứu tình hình kháng kháng sinh của vi khuẩn trong ao nuôi cá tra tại tỉnh cần thơ giai đoạn 2014 2015

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NÔI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NGHIÊN - VŨ TUẤN LONG NGHIÊN CỨU TÌNH HÌNH KHÁNG KHÁNG SINH CỦA VI KHUẨN TRONG AO NUÔI CÁ TRA TẠI TỈNH CẦN THƠ GIAI ĐOẠN 2014-2015 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Hà nội – 2017 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NGHIÊN - VŨ TUẤN LONG NGHIÊN CỨU TÌNH HÌNH KHÁNG KHÁNG SINH CỦA VI KHUẨN TRONG AO NUÔI CÁ TRA TẠI TỈNH CẦN THƠ GIAI ĐOẠN 2014-2015 Chuyên ngành: Vi sinh vật học Mã số: 60420107 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: TS PHẠM ĐỨC NGỌC Hà nội – 2017 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com LỜI CẢM ƠN Để hồn thành luận văn thạc sĩ mình, tơi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới TS Phạm Đức Ngọc – Bộ môn Vi sinh vật học, Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên – Đại học Quốc gia Hà Nội, ngƣời tận tình bảo, hƣớng dẫn tạo điều kiện tốt cho suốt q trình học tập nghiên cứu Tơi xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo cán Trung tâm Kiểm nghiệm kiểm chứng Tƣ vấn chất lƣợng nông lâm thủy sản – Cục Quản lý chất lƣợng nông lâm thủy sản giúp đỡ, cung cấp sở vật chất tạo điều thuận lợi cho tơi hồn thành tốt nghiên cứu Luận văn đƣợc thực khuôn khổ Dự án “thí điểm giám sát kháng kháng sinh ni trồng thủy sản Việt Nam” Trung tâm Kiểm nghiệm kiểm chứng Tƣ vấn chất lƣợng nông lâm thủy sản làm chủ dự án dƣới hỗ trợ kinh phí từ Tổ chức y tế giới WHO (thơng qua Bộ NN&PTNT) Tôi xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo Công ty CP Thủy sản Sông Hậu, Công ty TNHH Hải Sáng, Công ty TNHH Biển Đông, Công ty CP Công nghiệp Thủy sản Miền Nam, Công ty Cổ phần Nam Việt hỗ trợ tạo điều kiện cho tơi hồn thành nghiên cứu Tơi vô biết ơn thầy cô Bộ môn Vi sinh vật học Khoa Sinh học – Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên nhiệt tình bảo, truyền đạt kiến thức quý báu giúp đỡ tơi q trình học tập Cuối cùng, tơi xin gửi lời cảm ơn gia đình, ngƣời thân bạn bè khích lệ, giúp đỡ tơi suốt q trình học tập sống Tơi xin chân thành cảm ơn! Học viên Vũ Tuấn Long LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com MỤC LỤC MỞ ĐẦU Chƣơng TỔNG QUAN 1.1 Ngành nuôi trồng thủy sản 1.2 Cá tra nuôi .3 1.3 Đặc điểm số vi khuẩn thƣờng trú cá tra 1.4 Kháng sinh tƣợng kháng kháng sinh nuôi trồng thủy sản .6 1.5 Hiện trạng kháng kháng sinh 10 1.6 Mục tiêu nghiên cứu 12 Chƣơng VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP .13 2.1 Vật liệu 13 2.2 Địa điểm nghiên cứu 13 2.3 Phƣơng pháp nghiên cứu .14 Chƣơng KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .18 3.1 Kết thu thập mẫu 18 3.2 Kết phân lập vi khuẩn 18 3.3 Kết phân tích kháng sinh đồ 22 3.3.1 Kết phân tích tính kháng kháng sinh E.coli .22 3.3.2 Kết phân tích tính kháng sinh Aeromonas spp 25 3.3.3 Kết phân tích tính kháng sinh Vibrio spp 28 3.3.4 Kết phân tích tính kháng sinh Salmonella spp 31 3.3.5 Tổng hợp tỉ lệ kháng kháng sinh 04 chủng vi khuẩn nghiên cứu 34 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .36 TÀI LIỆU THAM KHẢO .37 PHỤ LỤC 1: Phƣơng pháp phân lập E coli 40 PHỤ LỤC 2: Phƣơng pháp phân lập Salmonella spp 43 PHỤ LỤC 3: Phƣơng pháp phân lập Aeromonas spp 50 PHỤ LỤC 4: Phƣơng pháp phân lập Vibrio spp 54 PHỤ LỤC 5: Phƣơng pháp khoanh giấy kháng sinh khuếch tán 58 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com CHỮ VIẾT TẮT WHO World Health Organization (Tổ chức Y tế giới) FAO Food and Agriculture Organization (Tổ chức nông lƣơng liên hiệp quốc) OIE World Organization for Animal Health (Tổ chức Thú Y giới) NN&PTNT Nông nghiệp phát triển nông thôn TCVN Tiêu chuẩn Việt Nam ISO International Organisation for Standardisation (Tổ chức tiêu chuẩn hóa quốc tế) CLSI The Clinical Laboratory Standards Institute DNA Deoxyribonucleic acid FFC Florphenicol OTX Oxytetracyline ENR Enrofloxacine NOR Norfloxacin SXT Trimethoprim-sulfamethoxazole SDM Sulfadimidine AMP Ampicilline AMO Amoxycilline GN Gentamycine LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com MỞ ĐẦU Trong năm gần nghề nuôi cá tra Việt Nam phát triển nhanh góp phần tích cực vào việc nâng cao nguồn thu nhập cộng đồng tăng kim ngạch xuất Song song với tăng sản lƣợng khơng ngừng tình hình dịch bệnh thƣờng xuyên xảy ngày phức tạp nhƣ bệnh ký sinh trùng, bệnh đốm đỏ, bệnh trắng da, phù đầu phù mắt, bệnh gan thận mủ vi khuẩn Aeromonas, Edwardsiella ictaluri, Pseudomonas Vibrio gây gây thiệt hại nghiêm trọng cho nghề nuôi cá tra vùng Đồng sông Cửu Long Do hình thức ni thâm canh ngày phát triển nên việc sử dụng kháng sinh để điều trị bệnh cá điều không tránh khỏi Mặt trái việc lạm dụng thuốc kháng sinh để điều trị bệnh thủy sản ni nói chung cá tra ni nói riêng phát sinh nguy kháng kháng sinh vi khuẩn thƣờng diện diện cá tra nuôi Vi khuẩn kháng kháng sinh đối tƣợng nuôi đƣợc nhiều nhà khoa học nghiên cứu Bằng chứng năm 2006 2007 tác giả Akinbowale Sarter phát nhiều loài vi khuẩn gây bệnh tôm, cá kháng thuốc Việc kháng thuốc không loài mà loài vi khuẩn khác, vi khuẩn gây bệnh cho ngƣời động vật cạn Cá tra nuôi sản phẩm chủ lực nghề ni, việc thực đề tài “nghiên cứu tình hình kháng kháng sinh vi khuẩn ao nuôi cá tra tỉnh Cần Thơ giai đoạn 2014-2015” cần thiết nhằm mục tiêu cung cấp thông tin cho việc sử dụng thuốc kháng sinh điều trị bệnh cá có hiệu đảm bảo an toàn sức khỏe ngƣời LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Chƣơng TỔNG QUAN 1.1 Ngành nuôi trồng thủy sản Ngành thủy sản đóng vai trị quan trọng việc đảm bảo an ninh lƣơng thực, cung cấp dinh dƣỡng cho ngƣời nhƣ góp phần tạo cơng ăn việc làm, đóng góp vào kinh tế nhiều quốc gia giới Theo thống kê Tổ chức Nông Lƣơng Liên Hợp Quốc (FAO), năm 2008, gần 81% (115 triệu tấn) sản lƣợng cá giới đƣợc sử dụng làm thực phẩm cho ngƣời, phần lại (27 triệu tấn) đƣợc sử dụng cho mục đích phi thực phẩm nhƣ sử dụng làm sản phẩm trang trí (6,4 triệu tấn), sản xuất bột dầu cá (20,8 triệu tấn) cung cấp thức ăn cho động vật khác sử dụng làm dƣợc phẩm Trong ngành ni trồng thủy sản đóng góp tới 46% sản lƣợng cá toàn cầu Trong thời gian từ năm 1976 đến 2008, trung bình hàng năm thƣơng mại thủy sản toàn cầu tăng 8,3% tổng sản lƣợng kim nghạch Nhu cầu thuỷ sản toàn cầu tiếp tục gia tăng dân số giới không ngừng phát triển Trong điều kiện nguồn hải sản tự nhiên gia tăng việc khai thác q mức chƣa đƣợc kiểm sốt, hoạt đơng ni trồng thuỷ sản nguồn cung cho tƣơng lai Ni trồng thuỷ sản làm giảm áp lực thuỷ sản tự nhiên đóng góp vào phát triển kinh tế xã hội Tại Việt Nam, 15 năm qua, nuôi trồng thuỷ sản phát triển mạnh mẽ Việt Nam quốc gia sản xuất thuỷ sản lớn giới Ngành nuôi trồng thủy sản trở thành phần quan trọng kinh tế quốc dân phát triển gần giúp cải thiện sinh kế cho ngƣời dân, đăc biệt đồng sông Cửu Long, nơi tập trung hầu hết hoạt động nuôi trồng thuỷ sản nƣớc ta Theo số liệu thông kê Hiệp hội xuất thủy sản Vasep (Hình 1.1), tổng sản lƣợng khai thác nuôi trồng thủy sản Việt Nam tăng gần lần, từ 1,3 triệu (năm 1995) lên 6,7 triệu (năm 2017) Đặc biệt trơng đó, tỉ lệ nuôi trồng thủy sản ngày chiếm tỉ trọng lớn tổng sản lƣợng, từ xấp xỉ 30% (năm 1995) lên tới 50% (năm 2017) tiếp tục chiếm tỉ trọng lớn năm nguồn thủy sản tự nhiên dần cạn kiệt LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Hình 1.1: Sản lƣợng nuôi trồng khai thác thủy sản Việt Nam (Vasep, 2017) 1.2 Cá tra nuôi Giới (regnum) Animalia Ngành (phylum) Chordata Phân ngành(subphylum) Vertebrata Lớp (class) Actinopterygii Phân lớp (subclass) Liên (superordo) Bộ (ordo) Họ (familia) Lồi Neopterygii Ostariophysi Siluriformes Pangasiidae Pangasius hypophthalmus Cá tra ni (Pangasius hypophthalmus) loài cá da trơn họ Pangasiidae phân bố lƣu vực sơng Mê kơng, có mặt bốn nƣớc Lào, Việt Nam, Campuchia Thái lan Đây loài cá đại diện cho họ cá tra (Pangasiidae) đƣợc nuôi nhiều Việt Nam, đặc biệt vùng đồng Sông Cửu Long Cá tra có hình dáng thân thon dài phía sau, lƣng xám đen, bụng bạc, miệng rộng, có đôi râu dài Cá tra sống chủ yếu nƣớc ngọt, sống đƣợc vùng nƣớc lợ (nồng độ muối 7-10 o/oo), chịu đựng đƣợc nƣớc phèn với pH >5, dễ chết nhiệt độ thấp dƣới 15 0C, nhƣng chịu nóng tới 390C Cá tra có số lƣợng hồng cầu máu nhiều lồi cá khác Cá có quan hơ hấp phụ cịn hơ hấp bóng khí da nên chịu đựng đƣợc LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com môi trƣờng nƣớc thiếu oxy hòa tan Tiêu hao oxy ngƣỡng oxy cá tra thấp lần so với cá mè trắng Cá tra có tốc độ tăng trƣởng tƣơng đối nhanh, nhỏ cá tăng nhanh chiều dài Từ khoảng 2,5 kg trở đi, mức tăng trọng lƣợng nhanh so với tăng chiều dài thể Cỡ cá 10 tuổi tự nhiên (ở Campuchia) tăng trọng Cá tra tự nhiên sống 20 năm Ðộ béo cá tăng dần theo trọng lƣợng nhanh năm đầu, cá đực thƣờng có độ béo cao cá độ béo thƣờng giảm vào mùa sinh sản Trƣớc đây, cá giống đƣợc bắt từ tự nhiên nuôi đến 2,5-3 năm tuổi thành thục sinh dục, cá giống đƣợc sinh sản nhân tạo cần nuôi từ 10-12 tháng tuổi thành thục Hình 1.2: Cá tra ni (Pangasius hypophthalmus) Trong số sản phẩm thủy sản nuôi Việt Nam, với tơm nƣớc lợ, cá tra sản phẩm đóng vai trị chủ lực ngành thủy sản nuôi Việt Nam Từ việc bắt đầu nuôi cá tra từ năm 1940, sản phẩm cá tra Việt Nam xuất sang 100 quốc gia giới với thị trƣờng khó tính nhƣ châu Âu, Mỹ Nga với kim ngạch xuất hàng năm 1,7 tỉ đô, sản lƣợng triệu 1.3 Đặc điểm số vi khuẩn thƣờng trú cá tra a Escheriachia coli Escheriachia coli (E.coli) vi khuẩn gram âm, kị khí khơng bắt buộc, hình que Vị trí phân loại học vi khuẩn E.coli nhƣ sau: Giới (regnum) Bacteria LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Ngành (phylum) Proteobacteria Lớp (class) Gammaproteobacteria Bộ (ordo) Enterobacteriales Họ (familia) Enterobacteriacease Chi (genus) Escheriachia Lồi (species) E.coli Hầu hết E coli có tự nhiên ruột ngƣời nhƣ động vật đóng vai trị quan trọng việc giúp thể vật chủ tiêu hóa thức ăn Tuy nhiên có số serotype gây ngộ độc, tiêu chảy, tiêu biểu chủng E coli O157:H7 E coli bị thải môi trƣờng qua phân Chúng sinh trƣởng mạnh phân tƣơi điều kiện yếm khí ngày, nhƣng dần suy giảm số lƣợng dần sau b Aeromonas spp Aeromonas spp nhóm vi khuẩn gram âm, kị khí khơng bắt buộc, hình que, số lồi có khả di động (A hydrophyla, A caviae, A sobria) Vị trí phân loại học vi khuẩn Aeromonas spp nhƣ sau: Giới (regnum) Bacteria Ngành (phylum) Proteobacteria Lớp (class) Gammaproteobacteria Bộ (ordo) Aeromonadales Họ (familia) Chi (genus) Aeromonadaceae Aeromonas Vi khuẩn Aoeromonas spp phân bố chủ yếu môi trƣờng nƣớc nƣớc lợ Trong chủng vi khuẩn có khả di động (A hydrophyla, A caviae, A sobria) tác nhân gây bệnh quan trọng Hai bệnh liên quan đến Aoeromonas spp viêm dày nhiễm trùng vết hở c Vibro spp Vibrio spp nhóm vi khuẩn gram âm, hình que thẳng uốn cong hình dấu phẩy, kị khí tùy nghi, khơng có khả hình thành bào tử có khả di chuyển nhờ nhiều tiên mao Vị trí phân loại học vi khuẩn Vibrio spp., nhƣ sau: Giới (regnum) Bacteria LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Trên TSI sau cấy Salmonella có số đặc điểm sau: mặt nghiêng có tính kiểm thể màu đỏ, đáy ống có tính acid thể màu vàng, có bọt khí 90 % có màu đen sinh H2S 8.1.5.1.2 Urea agar a) Thực hiện: dùng que cấy vòng, lấy lƣợng nhỏ sinh khối NA, cấy ria mặt nghiêng ống thạch Urea Ủ ống tủ ủ 37.0  1.0 0C /24 + Nếu phản ứng dƣơng tính, phân cắt ure giải phóng NH3 làm thay đổi màu thị phenol-red sang hồng kế đỏ hồng Phản ứng thƣờng rõ ràng sau 2-4 ủ b) Kết quả: dƣơng tính màu đỏ hồng khắp ống (Proteus mirabilisProteus vulgaris , Morganella morganii, Providencia rettgeri) Âm tính mơi trƣờng khơng đổi màu (vàng cam) 8.1.5.1.3 L-Lysin decarboxylation a) Thực hiện: dùng que cấy vòng, lấy lƣợng nhỏ sinh khối NA ống nghiệm chứa khoảng ml môi trƣờng Lysin decarboxylation, phủ lên lớp mỏng dầu khoáng Ủ ống tủ ủ 37.0  1.0 0C /24 + b) Kết quả: Dƣơng tính mơi trƣờng có màu tím, đục Âm tính mơi trƣờng có vàng 8.1.5.1.4 β-galactosidase a) Thực hiện: dùng que cấy vòng, lấy lƣợng nhỏ sinh khối NA ống nghiệm chứa 0.25 ml nƣớc muối sinh lý, để đĩa ONPG vào ủ 37.0  0C /24 + Kết quả: dƣơng tính mơi trƣờng có màu vàng Âm tính: mơi trƣờng có màu nhƣ ban đầu 8.1.5.1.5 Voges-Proskauer (VP) Chuyển sinh khối từ NA vào ống nghiệm chứa 5ml môi trƣờng VP Ủ ống tủ ủ 37.0  10C /24 + Sau ủ, thêm hai giọt dung dịch creatine lắc đều, thêm tiếp ba giọt dung dịch 1-naphthol lắc sau hai giọt dung dịch KOH lắc đều.Trong vòng 15 phút phản ứng dƣơng tính mơi trƣờng ống nghiệm chuyển thành màu hồng đỏ tƣơi 8.1.5.1.6 Indole Chuyển sinh khối từ NA vào ống nghiệm chứa ml môi trƣờng tryptone (Pepton from casein) ủ 37,0  0C/ 24 + Sau ủ thêm 1ml thuốc thử Kovacs Phản ứng dƣơng tính xuất vòng màu đỏ bề mặt ống nghiệm, màu nâu vàng âm tính 8.1.5.2 Thử nghiệm kháng huyết 47 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Trƣớc thực thử nghiệm kháng huyết thanh, cần loại trừ kiểu huyết có khả tự ngƣng kết Cách thực nhƣ sau:  Kiểm tra khả tự ngƣng kết vi khuẩn cách nhỏ giọt nƣớc muối sinh lý lên phiến kính Sau đó, dùng que cấy vịng lấy lƣợng sinh khối vừa đủ môi trƣờng NA, trộn nhẹ nhàng vòng 3060 giây thành huyền dịch, quan sát kết tối, tốt sử dụng kính lúp  Đọc kết quả, có hạt ngƣng kết ngừng phản ứng, huyền dịch đục tiến hành thực phản ứng kháng huyết với kháng nguyên O, H, Vi 8.1.5.2.1 Thử ngƣng kết kháng nguyên O Sử dụng khuẩn lạc khơng có khả tự ngƣng kết, tiếp tục qui trình giống nhƣ thử nghiệm tự ngƣng kết, thay giọt nƣớc muối sinh lý kháng huyết O Phản ứng dƣơng tính xuất hạt nhỏ trắng li ti, phản ứng âm tính huyền dịch vẩn đục 8.1.5.2.2 Thử ngƣng kết kháng nguyên Vi Sử dụng khuẩn lạc khả tự ngƣng kết, tiếp tục qui trình giống nhƣ thử nghiệm tự ngƣng kết, thay giọt nƣớc muối sinh lý kháng huyết Vi Phản ứng dƣơng tính xuất hạt hạt nhỏ trắng li ti, phản ứng âm tính huyền dịch vẩn đục 8.1.5.2.3 Thử ngƣng kết kháng nguyên H Sử dụng khuẩn lạc khơng có khả tự ngƣng kết cấy vào môi trƣờng thạch bán rắn NAB ủ 37.0  0C /24 + Sau ủ lấy sinh khối thạch mềm tiếp tục qui trình giống nhƣ thử nghiệm tự ngƣng kết, thay giọt nƣớc muối sinh lý kháng huyết H Phản ứng dƣơng tính xuất hạt nhỏ trắng li ti, phản ứng âm tính huyền dịch vẩn đục 8.1.6 Diễn giải kết Không thể kết luận dƣơng tính âm tính Salmonella spp mẫu thử dựa vào thử nghiệm sinh hóa dựa vào thử nghiệm huyết kháng Do:  Thử nghiệm sinh hóa khơng thể phát tất kiểu huyết thanh, ngồi dịng Salmonella spp khơng phải ln ln cho phản ứng điển hình  Thử nghiệm huyết kháng dựa vào phản ứng ngƣng kết kháng nguyên O, kháng nguyên H kháng nguyên Vi Tuy nhiên, Salmonella spp thay đổi hình dáng khuẩn lạc từ trơn (smooth) sang nhăn (rough) Dạng nhăn đột biến ngăn tổng hợp polysaccharide Do đó, khơng có chuỗi nhánh O, khả ngƣng kết kháng nguyên O Nếu phản ứng ngƣng kết kháng nguyên O dƣơng tính, chƣa thể kết luận Salmonella spp đƣợc có số lồi khác (E.coli, Citrobacter, Shigella Enterobacter) có 48 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com chung số kháng nguyên O có kháng nguyên tƣơng tự với kháng nguyên Salmonella spp Do đó, để kết luận mẫu dƣơng tính âm tính Salmonella spp., cần phải kết hợp kết hai thử nghiệm sinh hóa huyết kháng Khi kết hợp, có trƣờng hợp sau:  Trƣờng hợp Các thử nghiệm sinh hóa nghiệm nhƣ bảng 1, khơng có tự ngƣng kết phản ứng ngƣng kết H O Vi dƣơng tính Trƣờng hợp khẳng định mẫu dƣơng tính Salmonella spp  Trƣờng hợp Phản ứng ngƣng kết H O Vi âm tính không nghiệm hết tất thử nghiệm sinh hóa bảng Trƣờng hợp khẳng định mẫu âm tính Salmonella spp  Trƣờng hợp Các thử nghiệm sinh hóa nghiệm nhƣ Bảng nhƣng phản ứng ngƣng kết H, O Vi âm tính Trƣờng hợp nghi ngờ dƣơng tính Salmonella spp Khi thực lại thử nghiệm nhƣ sau: lấy sinh khối môi trƣờng TSI cấy sang đĩa thạch môi trƣờng di động cách đâm sâu nhƣng không đƣợc chạm đáy Ủ tủ ủ 37 oC/ 24 Nếu di động, cấy chuyển sinh khối mơi trƣờng di động sang môi trƣờng NAB lặp lại thử nghiệm ngƣng kết kháng nguyên H Nếu vi khuẩn không di động sau 24 ủ, ủ tiếp ngày, khơng di động đến phịng thí nghiệm kiểm chứng để xác định cuối  Trƣờng hợp Các thử nghiệm sinh hóa khơng nghiệm nhƣ Bảng nhƣng phản ứng ngƣng kết H O Vi cho kết dƣơng tính Trƣờng hợp nghi ngờ dƣơng tính Salmonella spp cấn kiểm chứng để xác định cuối Bảng 1: diễn giải kết sinh hóa Salmonella spp Stt 10 Thử nghiệm Phản ứng sinh hóa % chất kháng huyết Dƣơng tính Salmonella spp Glucose (TSI) + 100 Khí từ glucose(TSI) + 92 Lactose (TSI) Sucrose (TSI) H2S (TSI) + 92 Ure Lysin decarboxylase + 95 VP Indole β-galactosidase 49 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com PHỤ LỤC 3: Phƣơng pháp phân lập Aeromonas spp PHẠM VI ÁP DỤNG Phƣơng pháp dùng để phân lập Aeromonas spp thủy sản môi trƣờng nuôi thủy sản ĐỊNH NGHĨA Aeromonas spp vi khuẩn thuộc họ Vibrionaceae, nhóm vi khuẩn gram âm, hình que có kích thƣớc 0,3-1,0 x 1,0-4,0 µm, di động đƣợc nhờ roi cực thể Phản ứng lên men oxy hóa đƣờng, oxidase, catalase dƣơng tính kháng với O/129 (Inglis et al., 1993) Aeromonas spp đƣợc tìm thấy nƣớc ao hồ ni ao tự nhiên (Swann et al., 1989) NGUYÊN TẮC Để phát Aeromanas spp cần bƣớc Đó là: [1]Tăng sinh [2] Phân lập (isolation) [3] Khẳng định (confirmation) KIỂM SỐT CHẤT LƢỢNG Các mơi trƣờng, hóa chất dùng cho giai đoạn tăng sinh, khẳng định sinh hóa phải đƣợc làm ấm trƣớc cách để tủ ủ nhiệt độ phân tích trƣớc thực Phải thực phân tích chủng dƣơng với mẫu KHUYẾN CÁO VỀ AN TOÀN 6.1 Các mơi trƣờng sau ni cấy, hóa chất bị nhiễm khuẩn phải đƣợc hấp trùng (121oC/15 phút) trƣớc loại bỏ 6.2 Khi pha chế môi trƣờng nuôi cấy, phải đeo trang để tránh hít phải bụi môi trƣờng 6.3 Tránh để vật miệng (bút chì, bút mực, ngón tay…) tuyệt đối không đƣợc dùng miệng lấy mẫu pipette 6.4 Không đƣợc để vật dụng bị nhiễm vi sinh vật bàn nhƣ que cấy, đầu tip pipette thủy tinh… mà phải đƣợc trùng nhƣ hơ lửa que cấy để dung dịch khử trùng (đầu típ pipette thủy tinh) 6.5 Mặt bàn nơi phân tích phải đƣợc khử trùng cồn 70 o trƣớc sau thực 6.6 Nếu ống nghiệm chứa chủng vi sinh vật bị vỡ bị đổ mặt bàn sàn nhà Dùng khăn giấy phủ khắp lên nơi lau Sau lau, ngâm khăn giấy dung dịch khử trùng khoảng 15 phút trƣớc loại bỏ MÔI TRƢỜNG NI CẤY & DỊCH PHA LỖNG 6.1 Phosphate bufferred saline – PBS 50 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 6.2 Pseudomonas aeromonas selective agar – GSP 6.3 TSA 6.4 Oxidase 6.5 O129 (10µg; 150 µg) 6.6 Bộ nhuộm Gram (Crystal Violet, Ethanol 95 %, Ammonium oxalate, Saffarin, Iodine, Potassium iodine) THIẾT BỊ CHÍNH & VẬT DỤNG 7.21 Thiết bị đồng mẫu 7.22 Kính hiển vi quang học, lam lamelle 7.23 Cân điện tử (d=0.1g) 7.24 Đĩa Petri, bao PE ống nghiệm vô trùng, viết lông kim 7.25 Micropipette 100 l – 1000 l, đầu tip vô trùng 7.26 Kéo, nẹp vô trùng để lấy mẫu 7.27 Cồn 70o cồn tuyệt đối 7.28 Que cấy vòng que cấy thẳng 7.29 Tủ ủ 37.0  1,0 oC 7.30 Tủ ủ 44.0  0,5 oC 7.31 Bể điều nhiệt 42.0  1.0 oC 45.0  1.0 oC QUY TRÌNH PHÂN TÍCH 8.1 Phƣơng pháp phát Aeromonas spp theo NWFHS - 2009 8.1.1 Xử lý mẫu Cân phần mẫu vào phần PBS (25g mẫu cho vào bao PE vô trùng thêm vào 225ml PBS) Đồng mẫu khoảng 30 – 60 giây tùy theo đặc điểm mẫu Dịch mẫu sau đồng đƣợc ủ tủ ủ 37oC1 oC / 243 8.1.2 Phân lập Giai đoạn phân lập đƣợc thực môi trƣờng thạch GSP agar Từ dịch mẫu 8.1.4.1, dùng que cấy vòng, cấy ria dịch mẫu sang môi trƣờng thạch GSP agar Lật ngƣợc đĩa ủ tủ ủ 37.01.00C 24 + Sau ủ 24 + xem xét diện khuẩn lạc điển hình Trên mơi trƣờng GSP agar: Aeromonas spp tạo khuẩn lạc màu vàng 8.1.3 Khẳng định 51 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Trên đĩa có khuẩn lạc điển hình chọn khuẩn lạc điển hình cấy ria sang mơi trƣờng TSA Ủ đĩa qua đêm 37.0oC, sau thực hiệc phản ứng sinh hóa sau: 8.1.3.1 Phản ứng oxidase a) Thực hiện: dùng vòng cấy, chuyển sinh khối từ đĩa TSA sang giấy lọc tẩm ƣớt thuốc thử oxidase (1% N,N,N,N’- tetramethyl-pphenylenediamine.2HCl) b) Kết quả: dƣơng tính màu xanh tía xuất vịng 10 giây, âm tính khơng xuất màu xanh tía Aeromonas spp cho kết oxidase dƣơng tính 8.1.3.2 Kiểm tra dƣới kính hiển vi 8.1.3.2.1 Nhuộm Gram Cố định mẫu Đối với sinh khối mơi trƣờng rắn: Hơ đỏ vịng cấy, làm nguội thành ống nghiệm, Lấy lƣợng nhỏ sinh khối khuẩn lạc môi trƣờng thạch không chọn lọc sau 18-24 ủ, để lên miếng lam (đã khử trùng cồn 70o) chứa giọt nƣớc muối vô trùng Dùng vòng cấy trải dịch mẫu tâm miếng lam Hơ nhẹ lửa đƣa miếng lam qua lại vài lần đầu lửa Đối với sinh khối môi trƣờng lỏng: lấy sinh khối dịch mẩu sau 18-24 ủ trải hơ lửa nhƣ Nhuộm Nhỏ dung dịch crystal violet phủ khắp mẫu cố định miếng lam Để yên phút Rửa miếng lam nƣớc cất khoảng giây Để khô tự nhiên hơ nhẹ lửa nhƣ mục cố định mẫu Nhỏ dung dịch Lugol phủ khắp dịch mẫu Để yên khoảng phút Rửa miếng lam nƣớc cất khoảng giây Để khô tự nhiên hơ nhẹ lửa nhƣ mục cố định mẫu Để nghiêng miếng lam Nhỏ giọt dung dịch khử màu Dừng lại khơng cịn thấy chất màu trôi theo dung dịch khử màu vùng dịch mẫu cố định có màu xanh-hơi xám Rửa miếng lam nƣớc cất khoảng giây Để khô tự nhiên Phủ dung dịch Safranin lên vùng dịch mẫu cố định Để yên phút Rửa miếng lam nƣớc cất khoảng giây Để khô tự nhiên hơ nhẹ lửa nhƣ mục cố định mẫu Nhỏ giọt dầu immersion oil xem dƣới kính hiển vi vật kính 100X Kết Aeromonas spp có đặc điểm Gram âm 8.1.3.2.2 Xem di động 52 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Từ khuẩn lạc đĩa GSP agar, chuyển sinh khối sang ống nghiệm chứa khoảng ml BHI Ủ tủ ủ 37 oC/ – Sau ủ, nhỏ giọt dịch lên miếng lam Đậy miếng lamelle kiểm tra di động dƣới kính hiển vi Dƣơng tính có di động 8.1.3.3 Sử dụng glucose a) Thực hiện: Dùng que cấy vòng, lấy lƣợng nhỏ sinh khối TSA, cấy ria mặt nghiêng ống thạch TSI Sau dùng que cấy nhọn, lấy sinh khối đâm sâu xuống đáy ống (tránh chạm đáy) Ủ ống tủ ủ 37,0  0C /24 + b) Kết quả: Sự chuyển màu TSI sau 24 ủ đƣợc mô tả nhƣ sau: Đáy ống Vàng … ……… Glucose dƣơng tính Đỏ ………… Glucose âm tính Đen ………… Hình thành H2S Có bọt khí nứt mặt thạch sinh khí từ glucose Mặt nghiêng Vàng …………… Lactose Sucrose dƣơng tính Đỏ ……………… Lactose Sucrose âm tính 8.1.3.4 Thử nghiệm hoạt tính kháng khuẩn O 129 a) Thực hiện: Dùng que cấy vòng, lấy lƣợng nhỏ sinh khối TSA cấy ria đĩa TSA, sau đặt đĩa O 129 150 µg đĩa O 129 10 µg lên vùng cấy Ủ các đĩa tủ ủ 37.0  1.00C /18-24 b) Kết quả: Dƣơng tính xuất vùng ức chế, âm tính không xuất vùng ức chế 53 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com PHỤ LỤC 4: Phƣơng pháp phân lập Vibrio spp PHẠM VI ÁP DỤNG Phƣơng pháp dùng phân lập Vibrio spp thủy sản môi trƣờng nuôi thủy sản ĐỊNH NGHĨA Vibrio spp vi khuẩn tạo khuẩn lạc điển hình mơi trƣờng rắn chọn lọc, có đặc tính sinh hóa đặc trƣng thử theo phƣơng pháp ISO/TS 21872 – 1,2 : 2007 NGUYÊN TẮC Để phát Vibrio spp gồm bƣớc: tăng sinh, phân lập, khẳng định Thiết bị, mơi trƣờng ni cấy quy trình phân tích phƣơng pháp dựa theo phƣơng pháp ISO/TS 21872 – 1,2 : 2007 KIỂM SOÁT CHẤT LƢỢNG Quy trình phân tích đƣợc thực phân tích chủng chuẩn Vibrio cholerae Vibrioparahaemolyticus với mẫu KHUYẾN CÁO VỀ AN TỒN Do số dịng V cholera gây bệnh ngƣời (O1 O139) nên việc phân lập xác định phải đƣợc thực kiểm nghiệm viên đƣợc đào tạo đƣợc giám sát phù hợp Hấp trùng vật liệu quy trình phân tích Các quy trình cấy chuyền khẳng định phải thực tủ vô trùng (biosafety) Khi pha chế môi trƣờng nuôi cấy, phải đeo trang để tránh hít phải bụi mơi trƣờng Không đƣợc hút mẫu miệng Mặt bàn nơi phân tích phải đƣợc khử trùng cồn 70 o trƣớc sau thực MÔI TRƢỜNG NUÔI CẤY & DỊCH PHA LOÃNG 6.1 Alkaline Peptone water – APW 6.2 Thiosulphate citrate bile salt sucrose agar – TCBS 6.3 Cellobiose – Colistin (CC) agar TSAT 6.4 T1N1agar Oxidase 6.6 O 129 (10µg; 150 µg) 54 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 6.7 Bộ nhuộm Gram (Crystal Violet, Ethanol 95%, Ammonium oxalate, Saffarin, Iodine, Potassium iodine) THIẾT BỊ CHÍNH & VẬT DỤNG 7.32 Thiết bị đồng mẫu 7.33 Kính hiển vi quang học, lam lamelle 7.34 Cân điện tử (d=0.1g) 7.35 Đĩa Petri, bao PE ống nghiệm vô trùng, viết lông kim 7.36 Micropipette 100 l – 1000 l, đầu tip vô trùng 7.37 Kéo, nẹp vô trùng để lấy mẫu 7.38 Cồn 70o cồn tuyệt đối 7.39 Que cấy vòng que cấy thẳng 7.40 Tủ ủ 37.0  1,0 oC 7.41 Tủ ủ 44.0  0,5 oC 7.42 Bể điều nhiệt 42.0  1.0 oC 45.0  1.0 oC QUY TRÌNH PHÂN TÍCH 8.1 Phƣơng pháp phát Vibrio spp theo ISO/TS 21872 – 1,2: 2007 8.1.1 Xử lý mẫu Cân phần mẫu vào phần APW (25g mẫu cho vào bao PE vô trùng thêm vào 225ml APW) Đồng mẫu khoảng 30 – 60 giây tùy theo đặc điểm mẫu 8.1.2 Tăng sinh lần Dịch mẫu sau đồng đƣợc ủ tủ ủ 37 oC1 oC / 61 (đối với sản phẩm đông lạnh) 41.5 oC 1 oC / 61 (đối với sản phẩm tƣơi, khô ƣớp muối) 8.1.3 Tăng sinh lân Sau ủ hút ml vào ống nghiệm có chứa 10ml APW ủ 41.5 oC1 oC / 181 8.1.4 Phân lập Giai đoạn phân lập đƣợc thực đồng thời hai môi trƣờng thạch TCBS CC agar TSAT Từ dịch mẫu 8.1.2.2 8.1.2.3, dùng que cấy vịng, cấy ria dịch mẫu sang hai mơi trƣờng thạch TCBS CC agar Lật ngƣợc đĩa ủ tủ ủ 37.01.0 0C 24 + Sau ủ 24 + xem xét diện khuẩn lạc điển hình 55 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Trên môi trƣờng TCBS: Vibrio spp tạo khuẩn lạc màu xanh màu vàng Trên môi trƣờng CC agar: Vibrio spp tạo khuẩn lạc màu tím xanh 8.1.5 Khẳng định Trên đĩa có khuẩn lạc điển hình chọn khuẩn lạc điển hình cấy ria sang mơi trƣờng T1N1agar Ủ đĩa qua đêm 37.0 oC, sau thực hiệc phản ứng sinh hóa sau: 8.1.5.1 Phản ứng oxidase a) Thực hiện: Dùng vòng cấy, chuyển sinh khối từ đĩa T1N1agar sang giấy lọc tẩm ƣớt thuốc thử oxidase (1% N,N,N,N’- tetramethyl-pphenylenediamine.2HCl) b) Kết quả: Dƣơng tính màu xanh tía xuất vịng 10 giây, âm tính khơng xuất màu xanh tía Vibrio spp cho kết oxidase dƣơng tính 8.1.5.2 Kiểm tra dƣới kính hiển vi 8.1.5.2.1 Nhuộm Gram Cố định mẫu Đối với sinh khối môi trƣờng rắn: dùng vịng cấy vơ trùng lấy lƣợng nhỏ sinh khối khuẩn lạc môi trƣờng thạch không chọn lọc ủ 18-24 giờ, để lên miếng lam vô trùng chứa giọt nƣớc muối vơ trùng Dùng vịng cấy trải dịch mẫu tâm lam Hơ nhẹ lửa cách đƣa miếng lam qua lại vài lần đầu lửa Đối với sinh khối môi trƣờng lỏng: lấy sinh khối từ dịch mẫu ủ 18-24 trải hơ lửa nhƣ Nhuộm Nhỏ dung dịch crystal violet phủ khắp mẫu cố định miếng lam Để yên phút Rửa lam nƣớc cất khoảng giây Để khô tự nhiên hơ nhẹ lửa nhƣ mục cố định mẫu Nhỏ dung dịch Lugol phủ khắp dịch mẫu Để yên khoảng phút Rửa miếng lam nƣớc cất khoảng giây Để khô tự nhiên hơ nhẹ lửa nhƣ mục cố định mẫu Để nghiêng miếng lam Nhỏ giọt dung dịch khử màu Dừng lại không cịn thấy chất màu trơi theo dung dịch khử màu vùng dịch mẫu cố định có màu xanh-hơi xám Rửa miếng lam nƣớc cất khoảng giây Để khô tự nhiên Phủ dung dịch Safranin lên vùng dịch mẫu cố định Để yên phút Rửa miếng lam nƣớc cất khoảng giây Để khô tự nhiên hơ nhẹ lửa nhƣ mục cố định mẫu 56 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Nhỏ giọt dầu nhúng chìm xem dƣới kính hiển vi vật kính 100X Kết Vibrio spp có đặc điểm Gram âm, mỏng, hình dấu phẩy 8.1.5.2.2 Xem di động Từ khuẩn lạc đĩa TCBS, chuyển sinh khối sang ống nghiệm chứa khoảng ml APW Ủ tủ ủ 37 oC/ – Sau ủ, nhỏ giọt dịch lên miếng lam Đậy miếng lamelle kiểm tra di động dƣới kính hiển vi Dƣơng tính có di động 8.1.5.3 Sử dụng glucose a) Thực hiện: dDùng que cấy vòng, lấy lƣợng nhỏ sinh khối T1N1agar, cấy ria mặt nghiêng ống thạch TSI Sau dùng que cấy nhọn, lấy sinh khối đâm sâu xuống đáy ống (tránh chạm đáy) Ủ ống tủ ủ 37,0  10C /24 + b) Kết Sự chuyển màu TSI sau 24 ủ đƣợc mô tả nhƣ sau Đáy ống Vàng … ……… Glucose dƣơng tính Đỏ ………… Glucose âm tính Đen ………… Hình thành H2S Có bọt khí nứt mặt thạch sinh khí từ glucose Mặt nghiêng Vàng …………… Lactose Sucrose dƣơng tính Đỏ ……………… Lactose Sucrose âm tính 8.1.5.4.Thử nghiệm hoạt tính kháng khuẩn O 129 a) Thực hiện: dùng que cấy vòng, lấy lƣợng nhỏ sinh khối T1N1 agar cấy ria đĩa TSA % NaCl, sau đặt đĩa O 129 150µl đĩa O 129 10µl lên vùng cấy Ủ các đĩa tủ ủ 37.0  1.0 0C /18-24 b) Kết quả: dƣơng tính xuất vùng ức chế, âm tính khơng xuất vùng ức chế 57 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com PHỤ LỤC 5: Phƣơng pháp khoanh giấy kháng sinh khuếch tán PHẠM VI ÁP DỤNG Phƣơng pháp dùng để thử nghiệm tính kháng kháng sinh vi sinh vật thủy sản môi trƣờng nuôi thủy sản NGUYÊN TẮC Kháng sinh tẩm khoanh giấy khuếch tán vào thạch Meuler-hinton có chứa chủng vi khuẩn thử nghiệm Mức độ nhạy cảm vi khuẩn với kháng sinh đƣợc biểu đƣờng kính vịng vơ khuẩn xung quanh khoanh giấy kháng sinh KIỂM SỐT CHẤT LƢỢNG Các mơi trƣờng, hóa chất dùng cho giai đoạn thử nghiệm tính kháng kháng sinh phải đƣợc làm ấm trƣớc cách để tủ ủ nhiệt độ phân tích trƣớc thực Các đĩa kháng sinh phải đƣợc bảo quản lọ tối màu phải để khô trƣớc phân tích Phải thực phân tích chủng dƣơng với mẫu KHUYẾN CÁO VỀ AN TOÀN 4.1 Các mơi trƣờng sau ni cấy, hóa chất bị nhiễm khuẩn phải đƣợc hấp trùng (121oC/15 phút) trƣớc loại bỏ 1.1 Khi pha chế môi trƣờng nuôi cấy, phải đeo trang để tránh hít phải bụi môi trƣờng 1.2 Tránh để vật miệng (bút chì, bút mực, ngón tay…) tuyệt đối không đƣợc dùng miệng lấy mẫu pipette 1.3 Không đƣợc để vật dụng bị nhiễm vi sinh vật bàn nhƣ que cấy, đầu tip pipette thủy tinh… mà phải đƣợc trùng nhƣ hơ lửa que cấy để dung dịch khử trùng (đầu típ pipette thủy tinh) 1.4 Mặt bàn nơi phân tích phải đƣợc khử trùng cồn 70 o trƣớc sau thực 1.5 Nếu ống nghiệm chứa chủng vi sinh vật bị vỡ bị đổ mặt bàn sàn nhà Dùng khăn giấy phủ khắp lên nơi lau Sau lau, ngâm khăn giấy dung dịch khử trùng khoảng 15 phút trƣớc loại bỏ MƠI TRƢỜNG/ HỐ CHẤT/ THUỐC THỬ VÀ CHỦNG CHUẨN 5.1 Môi trƣờng thạch Muller Hinton Agar – MHA 5.2 Mơi trƣờng pha lỗng Saline peptone water – SPW 58 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 5.3 Độ đục chuẩn (McFarland): độ đục chuẩn 0,5 McFarland phải đƣợc chuẩn bị kiểm định chất lƣợng trƣớc làm thử nghiệm tính nhạy cảm kháng sinh Dịch độ đục chuẩn đƣợc hàn kín để chống bay bảo quản bóng tối để sử dụng vòng tháng Độ đục chuẩn McFarland đƣợc sử dụng để điều chỉnh độ đục huyền dịch ni cấy vi khuẩn cho thử nghiệm tính nhạy cảm kháng sinh Kiểm tra độ xác độ đục chuẩn 0,5 Mcfaland máy đo độ đục bƣớc sóng 625nm, số OD phải nằm khoảng 0,08-0,1 5.4 Khoanh giấy kháng sinh: sử dụng khoanh giấy có chứa loại kháng sinh nhƣ sau: FFC 30 µg, OTX 30 µg, ENR μg, NOR 10 μg, SXT 1.25/23.75 μg, SDM 10 μg, AMO 10 μg, AMO 30 μg GN 10 μg 5.5 Chủng chuẩn sử dụng: chủng vi khuẩn Escherchia coli ATCC 25922 THIẾT BỊ CHÍNH & VẬT DỤNG 6.1 Đĩa Petri, bao PE ống nghiệm vô trùng, viết lông kim 6.2 Micropipette 100 l – 1000 l, đầu tip vô trùng 6.3 Cồn 70o cồn tuyệt đối 6.4 Que cấy vòng que cấy trang 6.5 Tủ ủ 37.0  1,0 oC 6.6 Bể điều nhiệt 42.0  1.0 oC 45.0  1.0 oC QUY TRÌNH THỬ NGHIỆM TÍNH KHÁNG KHÁNG SINH 8.1 Chuẩn bị mẫu Các chủng vi khuẩn sau phân lập đƣợc giữ -20 0C mơi trƣờng BHI có chứa 20% glycerol thử nghiệm khả kháng kháng sinh Trƣớc sử dụng cấy kiểm tra lại đặc tính sinh hóa chủng Các chủng vi khuẩn sau phân lập, trƣớc thử nghiệm cần đƣợc cấy sang môi trƣờng TSA dƣới dạng đĩa hay thạch nghiêng (đối với Vibrio spp mơi trƣờng bổ sung thêm 1% NaCl) Ủ chủng tủ ủ 37oC 1oC/ 242 8.2 Pha loãng Sau ủ 8.1, dùng que cấy vơ trùng lấy khuẩn lạc hịa tan vào ml nƣớc muối sinh lý vô trùng trộn máy trộn vortex Độ đục dịch khuẩn đƣợc so sánh với độ đục chuẩn 0,5 McFarland dƣới giấy trắng có kẻ vạch đen Chú ý: Cần phải trộn ống đục chuẩn trƣớc dùng Nếu dịch vi khuẩn khơng có độ đục với độ đục chuẩn 0,5 McFarland, điều chỉnh độ đục cách cho thêm nƣớc muối sinh lý cho thêm vi khuẩn Pha loãng 100 lần dịch khuẩn có độ đục tƣơng đƣơng độ đục McFaland để đƣợc dịch khuẩn nồng độ 106 vi khuẩn /ml 59 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 8.3 Cấy chuyển sang MHA Chuyển 1ml dịch khuẩn nồng độ 106 vi khuẩn /ml 8.2 sang đĩa thạch MHA Trải dịch mẫu bề mặt thạch que cấy thủy tinh hình tam giác, hút dịch khuẩn thừa bỏ Để đĩa nhiệt độ phòng khoảng 15 phút để dịch mẫu hấp thụ vào bề mặt môi trƣờng Chú ý : luôn phải làm song song thử nghiệm với chủng dƣơng Escherichia coli ATCC 25922 để kiểm tra chất lƣợng qui trình 8.4 Đặt khoanh giấy tẩm kháng kháng sinh Lấy khoanh giấy tẩm kháng sinh khỏi tủ lạnh, không đƣợc mở nắp, để nhiệt độ phòng khoảng để ổn định làm giảm nƣớc tích tụ khoanh giấy kháng sinh Dùng kẹp đầu nhọn vô trùng để đặt nhẹ nhàng khoanh giấy kháng sinh lên đĩa thạch MHA (8.3.) Để đĩa thạch nhiệt độ phòng 30 phút cho kháng sinh từ khoanh giấy khuếch tán mặt thạch Chú ý:  Khoanh giấy kháng sinh đƣợc đặt sớm tốt, vòng 15 phút sau láng vi khuẩn lên đĩa thạch  Không nên đặt khoanh giấy lên đĩa thạch 90mm  Không di chuyển khoanh giấy tiếp xúc với mặt thạch để tránh vịng ức chế chồng chéo lên gây sai số đo vòng ức chế  Lộn ngƣợc đĩa thạch ủ ấm 370C vòng 18-20 8.5 Đọc kết Sau ủ (8.4), lấy đĩa thạch khỏi tủ ấm Đo ghi lại kích thƣớc vịng vơ khuẩn (dùng thƣớc đo từ mặt sau đĩa không đƣợc mở nắp) chủng chuẩn So sánh kết chủng chuẩn với bảng chuẩn Nếu phù hợp nghĩa qui trình thực đúng, tiếp tục đọc kết vịng vô khuẩn chủng thử nghiệm Nếu không phù hợp, qui trình thực chƣa hóa chất sinh phẩm hỏng, không phù hợp, cần phải tiến hành lại So sánh kích thƣớc vịng vơ khuẩn chủng thử nghiệm với vòng ức chế chuẩn (phụ lục 2), sau ghi lại kết loại kháng sinh đƣợc thử nghiệm nhƣ là: nhạy cảm (S), trung bình (I) kháng (R) Nếu có tƣợng khuẩn lạc mọc vịng ức chế xuất thay đổi tính kháng vi khuẩn huyền dịch vi khuẩn bị trộn lẫn vào với Các khuẩn lạc nên đƣợc nuôi cấy, phân lập thử nghiệm lại tính nhạy cảm với kháng sinh 60 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com TT Tên kháng sinh Hàm lƣợng (theo CLSI, 2010) E.coli + Salmonella spp Vibrio spp Aeromonas spp S R I S R I S R I (mm) (mm) (mm) (mm) (mm) (mm) (mm) (mm) (m m) Florphenicol 30 µg ≤14 15 - 18 ≥19 ≤14 15 - 18 ≥19 ≤14 15 - 18 ≥19 Oxytetracyline 30 µg ≤14 15 - 18 ≥19 ≤14 15 - 18 ≥19 ≤14 15 - 18 ≥19 Enrofloxacine μg ≤16 17 - 20 ≥23 ≤16 17 - 20 ≥23 ≤16 17 - 20 ≥23 Norfloxacin 10 μg ≤12 13 - 16 ≥17 ≤12 13 - 16 ≥17 ≤12 13 - 16 ≥17 Trimethoprimsulfamethoxazol e 1.25/23.75 μg ≤10 11 - 15 ≥16 ≤10 11 - 15 ≥16 ≤10 11 - 15 ≥16 Sulfadimidine 10 μg ≤10 11 - 15 ≥16 ≤10 11 - 15 ≥16 ≤10 11 - 15 ≥16 Ampicilline 10 μg ≤13 14 - 16 ≥17 ≤13 14 - 16 ≥17 ≤13 14 - 16 ≥17 Amoxycilline 30 μg ≤13 14 - 17 ≥18 ≤13 14 - 17 ≥18 ≤13 14 - 17 ≥18 Trimethoprim μg ≤10 11 - 15 ≥16 ≤10 11 - 15 ≥16 ≤10 11 - 15 ≥16 10 Gentamycine 10 μg ≤12 13 - 14 ≥15 ≤12 13 - 14 ≥15 ≤12 13 - 14 ≥15 61 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com ... ? ?nghiên cứu tình hình kháng kháng sinh vi khuẩn ao nuôi cá tra tỉnh Cần Thơ giai đoạn 20142 015”, với mục đích thống kê tần suất xuất số vi khuẩn thƣờng trú ao nuôi cá tra tỉ lệ kháng kháng sinh. .. TỰ NGHIÊN - VŨ TUẤN LONG NGHIÊN CỨU TÌNH HÌNH KHÁNG KHÁNG SINH CỦA VI KHUẨN TRONG AO NUÔI CÁ TRA TẠI TỈNH CẦN THƠ GIAI ĐOẠN 2014- 2015 Chuyên ngành: Vi sinh vật học Mã số: 60420107 LUẬN VĂN... ? ?nghiên cứu tình hình kháng kháng sinh vi khuẩn ao nuôi cá tra tỉnh Cần Thơ giai đoạn 2014- 2015? ?? cần thiết nhằm mục tiêu cung cấp thông tin cho vi? ??c sử dụng thuốc kháng sinh điều trị bệnh cá có