BỘ CÔNG THƢƠNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI KHOA HỌC KẾT QUẢ THỰC HIỆN ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌCCẤP TRƢỜNG Tên đề tài Tuyển chọn các chủng vi khuẩn có khả năng kh[.]
BỘ CÔNG THƢƠNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI KHOA HỌC KẾT QUẢ THỰC HIỆN ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌCCẤP TRƢỜNG Tên đề tài: Tuyển chọn chủng vi khuẩn có khả kháng nấm mốc Fusarium sp thực vật Mã số đề tài: 19.2TP07SV Chủ nhiệm đề tài: Nguyễn Thị Kim Huệ Đơn vị thực hiện: Viện Công nghệ Sinh học Thực phẩm Tp Hồ Chí Minh, 2021 LỜI CẢM ƠN Đề tài “Tuyển chọn chủng vi khuẩn có khả kháng nấm mốc Fusarium sp thực vật” nội dung chúng em chọn để thực đề tài nghiên cứu cấp trường Để thực tốt đề tài nghiên cứu này, chúng em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Ban giám hiệu, phịng Quản lí Khoa học Hợp tác Quốc tế trường Đại học Công nghiệp Thành phố Hồ Chí Minh tạo mơi trường học tập nghiên cứu thân thiện hỗ trợ mặt kinh phí chúng em phát huy khả nghiên cứu khoa học Chúng em xin gửi lời cảm ơn đến Ban lãnh đạo, Phòng Quản lý Phịng thí nghiệm, thầy Viện Cơng nghệ Sinh học Thực phẩm hỗ trợ, giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi sở trang thiết bị cho chúng em trình thực đề tài nghiên cứu Chúng em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến TS Nguyễn Ngọc Ẩn Cảm ơn Thầy bảo, hướng dẫn em tận tình, cung cấp cho chúng em kiến thức sâu rộng suốt trình thực đề tài nghiên cứu Chúng em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến TS Phạm Tấn Việt, TS Nguyễn Thị Diệu Hạnh ln cho em lời khun, lời góp ý hữu ích, giúp cho chúng em tích lũy thêm nhiều kiến thức, có nhìn sâu sắc vấn đề nghiên cứu sống, giúp chúng em hoàn thành tốt nghiên cứu Chúng em xin gửi lời cảm ơn ba mẹ ln u thương, quan tâm chăm sóc tạo động lực tiếp bước cho đường học vấn Chúng em xin gửi lời cảm ơn đến anh chị, bạn bè tập thể Công nghệ vi sinh ủng hộ, giúp đỡ chúng em suốt khoảng thời gian thực đề tài nghiên cứu Mặc dù cố gắng hoàn thành nghiên cứu phạm vi cho phép khả kinh nghiệm thân có hạn, nên nghiên cứu chắn không tránh khỏi tồn tại, hạn chế thiếu sót Chúng em mong nhận thơng cảm, góp ý tận tình bảo q thầy bạn PHẦN I THƠNG TIN CHUNG I Thông tin tổng quát 1.1 Tên đề tài: Tuyển chọn chủng vi khuẩn có khả kháng nấm mốc Fusarium sp gây bệnh thực vật 1.2 Mã số: 19.2TP07SV 1.3 Danh sách chủ trì, thành viên tham gia thực đề tài Họ tên TT (học hàm, học vị) TS Nguyễn Ngọc Ẩn Nguyễn Thị Kim Huệ Lê Thị Ngọc Ly Vai trị thực đề tài Đơn vị cơng tác Viện Công nghệ Sinh học Thực phẩm Cố vấn khoa học ĐHSH13B, Viện Công nghệ Sinh học Thực phẩm Chủ nhiệm đề tài ĐHSH13B, Viện Công nghệ Sinh học Thực phẩm Chủ nhiệm đề tài 1.4 Đơn vị chủ trì: Viện Cơng nghệ Sinh học & Thực phẩm 1.5 Thời gian thực hiện: 1.5.1 Theo hợp đồng: từ tháng 10 năm 2019 đến tháng 10 năm 2020 1.5.2 Gia hạn (nếu có): 06 tháng 1.5.3 Thực thực tế: từ tháng 10 năm 2019 đến tháng năm 2021 1.6 Những thay đổi so với thuyết minh ban đầu (nếu có): Có Bổ sung thêm thí nghiệm khảo sát khả ức chế nấm mốc Fusarium sp dịch nuôi cấy vi khuẩn với phương pháp trãi đĩa Bổ sung thêm thí nghiệm khảo sát khả sinh tổng hợp chitinase chủng vi khuẩn đối kháng mạnh 1.7 Tổng kinh phí đƣợc phê duyệt đề tài: 05 triệu đồng (bằng chữ: Năm triệu đồng) II Kết nghiên cứu Đặt vấn đề Người Việt coi trọng nghề nông, minh triết người Việt coi nông nghiệp gốc thứ xã hội, „canh nông vi bản‟ Ngày nông nghiệp không giúp ổn định sống cho phần lớn người nơng dân Việt, mà cịn tảng cho phát triển kinh tế-xã hội ổn định trị, tạo tiền đề để thực hóa khát vọng cơng nghiệp hóa, đại hóa đất nước từ quốc gia có nơng nghiệp cịn chưa phát triển Bên cạnh đó, Việt Nam nằm khu vực khí hậu nhiệt đới gió mùa, mưa nhiều, độ ẩm cao, đất đai màu mỡ, nguồn nước dồi đa dạng sinh học điều kiện quan trọng để sau 40 năm “Đổi mới” thực cải cách kinh tế, ngành nông nghiệp Việt Nam phát triển theo hướng thương mại đa dạng, đáp ứng nhu cầu nước giới Những năm gần ngành nông nghiệp nước ta đạt thành tựu to lớn Từ đất nước bị nạn đói đe dọa, Việt Nam đứng thứ Đông Nam Á thứ 15 toàn cầu xuất nông sản [1] Kim ngạch xuất nông sản tăng vọt từ 4,2 tỷ đô la Mỹ năm 2004 [2] lên 41,3 tỷ đô la Mỹ năm 2019, chiếm 15,68% tổng kim ngạch xuất quốc gia [3] Các nông sản xuất hàng đầu Việt Nam gạo, cà phê, hạt tiêu, chè, hạt điều, cao su, sắn, thủy sản,… [4] Thị trường xuất nông sản Việt Nam chủ yếu Trung Quốc, Châu Âu, Mỹ, ASEAN, Nhật Bản Hàn Quốc [5] Tuy nhiên, trước tác động biến đổi khí hậu xu cạnh tranh kinh tế thị trường, ngành nông nghiệp Việt Nam gặp khơng khó khăn thiên tai, dịch hại sâu bệnh, nấm bệnh, … làm giảm suất chất lượng nông sản Hiện nay, nấm bệnh xuất ngày nhiều công nghiệp gây tổn thất to lớn cho sản xuất nơng nghiệp Tính đến năm 2005, có khoảng 14% khoản thiệt hại giới hoàn toàn từ bệnh hại trồng gây ra, 50% bệnh hại trồng nấm gây với hàng tỷ Euro thiệt hại năm (Agrios, 2005) Ở Việt Nam, bệnh Fusarium sp gây vấn đề quan trọng (gây thối dưa hấu, thối củ khoai tây, thối bắp, thối họ đậu ) Vì lồi nấm Fusarium sp nghiên cứu từ khoảng đầu kỷ XIX Đến có nhiều cơng trình nghiên cứu nấm Fusarium sp cơng bố có ý nghĩa lớn phát triển khoa học kỹ thuật Một số cơng trình nghiên cứu như: - Theo Binder Hutchinson (1959) cà chua bị bệnh héo vàng nấm Fusarium sp chết nhanh thiệt hại lớn bị tuyến trùng (Meloidogine incognita) xâm nhập tuyến trùng làm giảm tính chống bệnh cà chua nấm Fusarium sp - Theo Nguyễn Văn Viên (1997) cho biết vụ đông xuân 1994 Tiên Dương – Đông Anh tỷ lệ nhiễm bệnh héo vàng trung bình 4.0%, cà chua trồng đất phèn tỷ lệ nhiễm bệnh 5.8%, chân đất cao tỷ lệ nhiễm bệnh 2.2% Trên môi trường PDA thuốc Benlate 0.1% có tác dụng ức chế phát triển tản nấm Fusarium oxysporum Tuy nhiên, cơng trình nghiên cứu nấm mốc Fusarium sp chưa ứng dụng rộng rãi chưa đưa lại hiệu cao Vì người nông dân thường sử dụng loại thuốc bảo vệ thực vật hóa học nơng nghiệp gây ảnh hưởng tiêu cực đến môi trường, dẫn đến cân quần thể vi sinh vật đất có ích, tạo mơi trường bất lợi sinh vật có ích phát triển, tạo điều kiện để nấm bệnh, lồi trùng có hại kháng thuốc hơn, đồng thời tiêu diệt lồi thiên địch có ích Chính vậy, để hạn chế tác hại dịch bệnh đảm bảo an toàn cho hệ sinh thái, mơi trường sức khỏe người việc nghiên cứu tạo sản phẩm có nguồn gốc sinh học cần thiết Hiện có số cơng trình nghiên cứu vi sinh vật có lợi để tiêu diệt bệnh hại cây, sử dụng vi khuẩn ức chế nấm gây bệnh hướng nghiên cứu góp phần bảo vệ suất trồng thân thiện với môi trường Vi khuẩn có nhiều tiềm phong phú, đa dạng phân bố rộng rãi tự nhiên có khả sản sinh chất kháng nấm mạnh lý chúng tơi lựa chọn đề tài nghiên cứu: “Tuyển chọn chủng vi khuẩn có khả kháng nấm mốc Fusarium sp thực vật” Mục tiêu nghiên cứu Phân lập tuyển chọn chủng vi khuẩn có khả kháng nấm mốc Fusarium sp thực vật Nội dung nghiên cứu Phân lập chủng vi khuẩn từ nguồn khác Xác định khả đối kháng nấm mốc Fusarium sp gây bệnh chủng vi sinh vật phân lập tuyển chọn chủng vi sinh vật có hoạt tính đối kháng mạnh với nấm mốc Fusarium sp Khảo sát đặc điểm kháng mốc Fusarium sp vi khuẩn nảy mầm hệ sợi tơ nấm Phƣơng pháp nghiên cứu 4.1 Phương pháp lấy mẫu Chọn điểm thu mẫu đất: mẫu đất lấy khu vực khác (đất gị cao, khu vực có nhiều gỗ bị hoai mục, đất khu vực ẩm ướt, bờ ruộng, khu vực xung quanh chuồng gà, chuồng lợn, …) thuộc tỉnh Bình Dương Thành phố Hồ Chí Minh Cách lấy mẫu: dùng dao lấy khoảng 10-15 g đất độ sâu 10-15 cm vị trí trên, cho vào túi nylon khử trùng, buộc kín, ghi ngày vị trí lấy mẫu Mẫu đất bảo quản 4°C, sau ngày tiến hành phân lập vi khuẩn [6] 4.2 Phân lập vi khuẩn từ đất [7] Cân g đất cho vào ống nghiệm chứa ml nước cất vô trùng (hoặc nước muối sinh lý), mix máy Vortex Tiến hành pha lỗng thập phân: dùng pipette vơ trùng hút ml dịch đất sang ống nghiệm có chứa ml nước vơ trùng tiếp tục pha lỗng đến nồng độ thích hợp Chọn nồng độ pha loãng liên tiếp 10-3 đến 10-5, hút 0.1 ml chuyển sang đĩa petri chứa môi trường LB agar Dùng que trang trải đều, đậy đĩa petri, gói lại lật sấp đặt vào tủ ấm nhiệt độ 30 48 Chọn khuẩn lạc đặc trưng, cấy chuyền phương pháp cấy ria có chủng vi khuẩn khiết Tiến hành quan sát phân biệt khuẩn lạc vi khuẩn với loại vi sinh vật khác Các chủng vi khuẩn phân lập giữ giống Glycerol 50% -80 4.3 Quan sát đặc điểm hình thái vi khuẩn Quan sát đại thể: Vi khuẩn cấy ria môi trường Luria Bertani (LB), ủ nhiệt độ phòng, quan sát đặc điểm đại thể sau ngày nuôi cấy (kích thước, hình dạng, đặc điểm bề mặt, rìa, màu sắc khuẩn lạc mặt trên, mặt dưới) Quan sát vi thể: Vi khuẩn nuôi cấy môi trường LB theo phương pháp nhuộm Gram, nhuộm bào tử quan sát kính hiển vi quang học với độ phóng đại 1000 lần [7] 4.4 Sàng lọc, tuyển chọn chủng vi khuẩn có khả đối kháng với nấm mốc Fusarium sp Nguyên tắc: Hoạt tính đối kháng dịch nuôi cấy vi khuẩn nấm Fusarium oxysporum thể thông qua khả ức chế lan tơ nấm bệnh tạo nên vùng ức chế Cách tiến hành: Nuôi cấy vi khuẩn ml mơi trường LB broth, lắc 150 vịng/phút 24 nhiệt độ phòng thu nhận dịch ni cấy Sau đó, nấm Fusarium sp (đường kính d=5 mm) cấy lên đĩa thạch Potato Glucose Agar (PGA) (cách mép đĩa petri cm) 48 nhiệt độ phịng Nhỏ µl dịch vi khuẩn vào mơi trường PGA cấy nấm bệnh vào phía đối diện vị trí cấy nấm Để nhiệt độ phòng, sau ngày tiến hành kiểm tra kết dựa vào kích thước vịng đối kháng [8] Tỷ lệ phần trăm khả vi khuẩn ức chế phát triển nấm Fusarium sp (PIRG) tính sau [9]: PIRG = x 100 R1: trung bình độ lan hệ sợi tơ nấm đĩa đối chứng R2: trung bình độ lan hệ sợi tơ nấm ni cấy chung với vi khuẩn Thí nghiệm bố trí lặp lại lần 4.5 Phương pháp khảo sát ảnh hưởng vi khuẩn lên nảy mầm bào tử phát triển hệ sợi tơ nấm Fusarium sp [10] Dịch vi khuẩn nuôi cấy môi trường LB broth 24 giờ, nhiệt độ phòng ly tâm tốc độ 13,000 rpm 4°C 10 phút Lọc qua màng lọc với kích thước lỗ lọc 0,22 µm để loại bỏ bào tử vi khuẩn Khảo sát tác động dịch nuôi cấy vi khuẩn lên bào tử nấm Fusarium oxysporum: Nấm F oxysporum sau ngày cấy môi trường PGA thu nhận bào tử PGB Que cấy vơ trùng sử dụng với mục đích giúp bào tử thoát khỏi hệ sợi tơ Phần dịch huyền phù thu nhận ly tâm với tốc độ 5,000 rpm 4°C phút, thu nhận phần dịch chứa bào tử mốc Dịch bào tử nấm F oxysporum với mật độ 106 bào tử/ml ủ với dịch vi khuẩn, lơ đối chứng bào tử nấm F oxysporum ủ với môi trường LB broth Quan sát phát triển bào tử nấm F oxysporum nghiệm thức từ 024 kính hiển vi quang học với độ phóng đại 1000X Sau tiến hành đánh giá khả tác động dịch nuôi cấy vi khuẩn lên nảy mầm bào tử nấm Đồng thời cấy trải dịch lên môi trường PGA ủ 48 nhiệt độ phòng để xác định số lượng khuẩn lạc nấm mốc phát triển mẫu có trộn dịch vi khuẩn so với đối chứng 4.6 Phương pháp định danh vi khuẩn Mẫu vi khuẩn gửi đến Công ty Trách nhiệm hữu hạn Nam Khoa để giải trình tự Sau có trình tự gene chủng vi khuẩn nghiên cứu, tiến hành xây dựng phát sinh lồi cách so sánh với trình tự gene tương đồng ngân hàng liệu NCBI Sắp giống trình tự gene chủng vi khuẩn nghiên cứu với trình tự gene tương đồng ngân hàng liệu Cây phát sinh loài xây dựng dựa thuật toán Neighbor-Joining với bootstrap 1000 lần lặp lại phần mềm Mega phiên 5.0 4.7 Khảo sát khả sinh chitinase ngoại bào vi khuẩn Nguyên tắc: Chitin bị phân hủy thành N-acetyl glucosamine có diện chitinase N-acetyl glucosamine có cấu trúc mạch ngắn chitin nên không bắt màu với thuốc thử Lugol Xác định hoạt tính chitinase thơng qua kích thước vịng phân giải (vùng khơng bắt màu với Lugol) Cách tiến hành: Cấy chấm điểm vi khuẩn mơi trường LB chitin Tiến hành xác định hoạt tính chitinase sau ngày cấy cách đo vòng phân giải chitin sau nhuộm thuốc thử Lugol [11], [12] 4.8 Phương pháp xử lí số liệu Sử dụng phần mềm Excel để tổng hợp tính tốn số liệu từ kết thu nhận trình thực thí nghiệm Sử dụng phương pháp phân tích phương sai (ANOVA) phần mềm thống kê Statgraphic phiên 15.1 để đánh giá khác biệt yếu tố điều kiện khảo sát Tổng kết kết nghiên cứu Đề tài “Tuyển chọn chủng vi khuẩn có khả kháng nấm mốc Fusarium sp thực vật” số kết sau: 50 chủng vi khuẩn phân lập làm 26/50 chủng vi khuẩn có khả đối kháng với nấm Fusarium sp Đánh giá kết đạt đƣợc kết luận Các chủng vi khuẩn có khả đối kháng với nấm Fusarium sp gây bệnh thực vật có tiềm ứng dụng việc sản xuất hợp chất đối kháng có nguồn gốc từ tự nhiên, ứng dụng rộng rãi lĩnh vực đời sống Bên cạnh đó, chủng vi khuẩn có khả sinh tổng hợp chitinase ngoại bào cao sở để ứng dụng sản xuất enzyme thương mại có nguồn gốc từ vi sinh vật, đáp ứng nhu cầu sử dụng enzyme Tóm tắt kết Tóm tắt: Fusarium sp chi nấm gây bệnh phổ biến nhiều đối tượng trồng động vật thủy sản Việc lạm dụng loại thuốc bảo vệ thực vật hóa học để hạn chế dịch bệnh bảo vệ sản xuất ảnh hưởng tiêu cực tới hệ sinh thái, môi trường sức khỏe người Chính vậy, để hạn chế tác hại dịch bệnh đảm bảo an toàn cho hệ sinh thái, mơi trường sức khỏe người việc nghiên cứu tạo sản phẩm có nguồn gốc sinh học cần thiết Trong nghiên cứu này, phân lập thành công 50 chủng vi khuẩn từ mẫu đất thu nhận tỉnh Bình Dương Thành Phố Hồ Chí Minh Kết thử nghiệm “in vitro” cho thấy 26/50 chủng phân lập có tác dụng ức chế sinh trưởng nấm Fusarium sp Trong số đó, chủng: D5, D7, D15, N14 TL2 thể khả ức chế mạnh nảy mầm bào tử phát triển hệ sợi tơ nấm Fusarium sp Chủng D5 thể khả đối kháng hiệu định danh phương pháp giải trình tự 16S-rRNA xác định có quan hệ gần gũi với loài Bacillus subtilis Những kết cho thấy chủng vi khuẩn (đặc biệt D5) tác nhân kiểm soát sinh học đầy tiềm cần khảo sát khả kiểm soát sinh học đối tượng trồng làm sở để tuyển chọn sản xuất chế phẩm vi sinh vật Abstract: The genus Fusarium sp is common pathogens of plants and aquatic animals The use of fungicides to limit disease and improve production has several negative impact on ecosystems and human health We have successfully isolated 50 strains of Gram-positive bacteria from soil samples collected in Binh Duong province and Ho Chi Minh city “In vitro” antifungal test showed that 26/50 isolates have inhibitory effects on the growth of Fusarium sp Among them, strains: D5, D7, D15, N14 and TL2 showed the strongest inhibition of spore germination and mycelial growth of Fusarium sp The strain D5, which exhibited the highest antagonistic effect, was identified by 16S rRNA sequencing and was determined to be closely related to Bacillus subtilis These results show that these bacteria strains (especially D5) are potential biological control agents and further investigation should be done on plants model to so as to select and produce effective biocontrol products Sản phẩm đề tài, công bố kết đào tạo Yêu cầu khoa học hoặc/và tiêu kinh tế - kỹ thuật TT Tên sản phẩm Đăng ký Đạt đƣợc + Đã phân lập làm 50 chủng vi khuẩn + Phân lập 50 đăng kí + Đã sàng lọc, tuyển chọn chủng vi khuẩn Giống vi khuẩn + Thu chủng vi chủng vi khuẩn kháng khuẩn có khả kháng mốc mạnh + Định danh chủng vi mốc khuẩn Tình hình sử dụng kinh phí TT A Nội dung chi Kinh phí đƣợc Kinh phí Ghi duyệt thực (triệu đồng) (triệu đồng) Chi phí trực tiếp Th khốn chun mơn ... kháng nấm mốc Fusarium sp gây bệnh chủng vi sinh vật phân lập tuyển chọn chủng vi sinh vật có hoạt tính đối kháng mạnh với nấm mốc Fusarium sp Khảo sát đặc điểm kháng mốc Fusarium sp vi khuẩn. .. Đề tài ? ?Tuyển chọn chủng vi khuẩn có khả kháng nấm mốc Fusarium sp thực vật? ?? số kết sau: 50 chủng vi khuẩn phân lập làm 26/50 chủng vi khuẩn có khả đối kháng với nấm Fusarium sp Đánh giá kết... làm 50 chủng vi khuẩn + Phân lập 50 đăng kí + Đã sàng lọc, tuyển chọn chủng vi khuẩn Giống vi khuẩn + Thu chủng vi chủng vi khuẩn kháng khuẩn có khả kháng mốc mạnh + Định danh chủng vi mốc khuẩn