Tạo dòng gene mã hóa Polysaccharide Monooxygenase (PMO) trên vector pEX2B hướng tới biểu hiện trong Aspergillus oryzae.pdf

NTTƯ-NCKH-04 CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Độc lập - Tự - Hạnh phúc Đơn vị chủ trì: Trường Đại học Nguyễn Tất Thành BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐÈ TÀI NCKH DÀNH CHO CÁN Bộ - GIẢNG VIÊN 2019 Tên đề tài: Tạo dịng gene mã hóa Polysaccharide Monooxygenase (PMO) vector pEX2B hướng tói biểu Aspergillus oryzae Sổ hợp đồng: 2019.01.07/HĐ-KHCN Chú nhiệm đề tài: Hồ Tá Giáp Đơn vị công tác: Viện Kỳ thuật Công nghệ cao NTT Thời gian thực hiện: tháng TP Hồ Chí Minh, ngày 25 thảng 09 năm 2019 CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Độc lập - Tự - Hạnh phúc Đon vị chii trì: Trường Đại học Nguyễn Tất Thành BÁO CÁO TÓNG KẾT ĐỀ TÀI NCKH DÀNH CHO CÁN Bộ - GIẢNG VIÊN 2019 Tên đề tài: Tạo dòng gene mã hóa Polysaccharide Monooxygenase (PMO) vector pEX2B hướng tói biểu Aspergillus oryzae Số hợp đồng: 2019.01.07/HĐ-KHCN Chù nhiệm đề tài: Hồ Tá Giáp Đơn vị công tác: Viện Kỳ thuật Công nghệ cao NTT Thời gian thực hiện: tháng Các thành viên phối họp cộng tác: STT Họ tên Chuyên ngành Cơ quan công tác Hồ Tá Giáp Sinh học Viện Kĩ thuật Công nghệ cao NTT TP Hồ Chí Minh, ngày 25 tháng 09 năm 2019 11 Ký tên MỤC LỤC PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỪ VIẾT TẮT V PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH VI PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC BẢNG BIẾU VII TÓM TẮT KẾT QUẢ NGHIÊN cứu VIII MỞ ĐÀU CHƯƠNG TÒNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 CỊNG NGHỆ SINH HỌC VÀ NGHÀNH CƠNG NGHIỆP NÀNG LƯỢNG TÁI CHÊ 1.2 Tinh 1.3 Enzyme hoạt tính tinh bột BỘT 1.3.1 Endoamylase exoamylases 1.3.2 Các enzyme cắt nhảnh 1.3.3 Transferase 1.3.4 Starch-active polysaccharide monooxygenases DNA TÁI TÓ Hộp 1.4 CÒNG NGHẸ 1.5 CÁC phương pháp chuyên gene vào nám sợi .7 CHƯƠNG NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cứu 2.1 Thời gian địa điêm nghiên cúư 2.2 Vật liệu phương pháp nghiên cúư 2.2.1 Cách tiếp cận 2.2.2 Vật liệu 2.3 Phương pháp nghiên cúư 10 2.3.1 Polymerase chain reaction (PCR) 10 2.3.2 Nuôi cấy tế bào 11 2.3.3 Phương pháp tạo dòng DNA 12 CHƯƠNG KẾT QUA VÀ THẢO LUẬN 13 3.1 Thiét ké cặp primer nhân NCU08746 .13 3.2 Kha hoạt động phản ưng PCR với cập mói nhân NCU08746 15 iii 3.3 Tạo dòng NCU08746 LÊN VECTOR PEX2B 15 3.4 Giải trình Tự sản phẩm vector tái tỏ hợp 17 3.5 Tạo chủng a TUMEFACIENS MANG PLASMID PEX2B-NCƯ08746 20 CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 22 TÀI LIỆU THAM KHẢO .23 PHỤ LỤC 3: DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH ĐẢ CÒNG Bố ERROR! BOOKMARK NOT DEFINED PHỤ LỤC (hợp địng, thut minh đè cng) 27 IV PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT -PMO Polysaccharide monooxygenase -CAZy Carbohydrate-Active enZYmes -PCR Polymerase Chain Reaction -NCBI National Center for Biotechnology Information -DNA Deoxyribonucleic acid -dNTP deoxyribonucleotide triphosphate -TAE Tris-acetate-EDTA - AA Auxiliary Activities - RE Restriction enzyme - NCBI National Center for Biotechnology Information V PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH Hình Cấu trúc tinh bột: từ mức hạt đến mức nguyên từ Hình Các loại enzyme hoạt động tinh bột Hình Hoạt tính AA13 PMO tinh bột Hình Các bước cơng nghệ DNA tái tổ hợp Hình Vi khuẩn A tumefaciens chuyển gene vào thực vật Hình Phuong pháp PCR 11 Hình Bản đồ pEX2B marker 13 Hình Các vị trí cắt đặc hiệu cho RE NCU08746 14 Hình Kết điện di NCU08746 15 Hình 10 DH5a biến nạp nuôi LB agar 16 Hình 11 Kết điện di sản phẩm colony PCR chủng DH5a 17 Hình 12 So sánh trình tự sản phẩm với trình tự NCU08746 19 Hình 13 Các chủng A tumefaciens biến nạp nuôi LB agar 20 Hình 14 Ket điện di Sản pham colony PCR chủng A tumefaciens 21 Hình 15 Quy trình chuyển gene vào A.oryzae AƯT1-PID nhờ A tumefaciens 22 VI PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC BẢNG BIẾU Bảng Danh sách hóa chất Bảng Danh sách thiết bị dụng cụ 10 Bảng Các primer cho phản ứng PCR 14 vii TÓM TÁT KÉT QUẢ NGHIÊN cứu Sán phẩm đăng ký thuyết Sản phẩm thực đạt minh Bài báo đăng tạp chí Khoa học Cơng nghệ Nguyễn Tất Bài báo đăng tạp chí Khoa học Cơng nghệ Nguyễn Tất Thành Thành Thời gian đăng ký : từ ngày 01/2019 đến ngày 09/2019 Thời gian báo cáo: 02/10/2019 viii MỞ ĐẦU Polysaccharide monooxygenase (PMO) hệ thống enzyme tống họp tiết vi khuẩn vi nấm Dựa vào khả phân hủy polysaccharide phản ứng oxy hóa khử liên kết glycosidic, enzyme biết đến với ba nhóm bao gồm: chitin, cellulose tinh bột Không giống cấu trúc đồng chitin cellulose, cấu trúc bậc cao cùa tinh bột phức tạp Tinh bột hỗn họp amylose amylopectin với tỷ lệ tương đối khác tùy thuộc vào nguồn gốc Ngoài phức tạp cấu trúc amylose amylopectin, xoắn kép hình thành amylose amylopectin tinh bột, làm phức tạp cấu trúc Do đó, việc phân giải tinh bột enzyme truyền thống có hiệu suất thấp PMO khám phá với tiềm hồ trợ việc phân giải tinh bột kiểm chứng, cụ thể, sử dụng PMO vào sản xuất p-amylase maltose từ tinh bột tăng suất lên tới 100 lần Năm 2014, hoạt tính NCU08746, họ enzyme PMOs (AA13), chứng minh có khả phân giải amylose, amylopectin tinh bột AA13 tính đến họ PMOs có hoạt tính a,l-6 glucosidic Hiện nay, PMO đối tượng hấp dần nhà Cơng Nghệ Sinh Học đặc tính quan trọng mở nhiều hướng nghiên cứu Do đó, việc tạo dịng biểu PMO nghiên cứu quan trọng việc cung cấp PMO phục vụ thí nghiệm Điển hình, Vu vv cộng (2013) biếu thành công loại PMO đặc hiệu tinh bột hệ thống nấm sợi Neurospora crassa Tuy nhiên, đề tài tiếp cận hệ thống biếu bang Aspergillus oryzae số lý do: thứ A oryzae chủng an toàn cho người, chúng sử dụng rộng rãi để sản xuất loại thực phẩm lên men truyền thống; thứ hai A oryzae có khả tiết lượng lớn protein mơi trường, chúng sử dụng để sản xuất nhiều loại enzyme công nghiệp amylase, protease, lipase phytase, ; thứ ba liệu genomic có sằn dề dàng truy cập CHƯƠNG TĨNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Cơng nghệ sình học nghành công nghiệp lượng tải chế Hiện nay, phát triên xà hội đại đòi hỏi mức tiêu thụ lượng ngày tăng Song song đó, vấn đề ô nhiễm môi trường biến đổi khí hậu khí thải CO2 thúc đẩy việc tìm kiếm nguồn lượng thay từ nguồn phế thải tái tạo thành lượng.1 Các loại sinh khối thực vật tái sử dụng bao gồm để sản xuất thực phẩm, vật liệu nghành công nghiệp khác chuyển đổi thành lượng Thêm vào đó, kinh tế sinh học đại đối mắt với nhiều thách thức tính bền vũng cùa nguyên liệu sinh khối thực vật, hiệu sử dụng sinh khối thực vật có mang lại lợi ích nhiều nghành khác khơng vấn đề kinh tế triển khai chuyển đoi sinh khối thực vật thành lượng.2’3 Sinh khối thực vật nguyên liệu có nguồn gốc thực vật làm nguyên liệu sản xuất xăng sinh học, lượng sinh học chế phẩm sinh học Dựa vào sinh khối thực vật, chia xăng sinh học thành hai loại: xăng sinh học hệ thứ hệ thứ hai Xăng sinh học hệ thứ sản xuất từ nguyên liệu mía, ngủ cốc, dầu thực vật, loại củ Đây giải pháp giúp cải thiện ô nhiễm CO2 an ninh lượng quốc gia Một vấn đề xăng sinh học hệ thứ nguyên liệu sản xuất liên quan đến thực phẩm Do đó, nguồn nguyên liệu để sản xuất chủ yếu phế thải từ nhà máy bia, vỏ loại củ từ nhà máy.1-4 Một giải pháp thay cho vấn đề thay xăng sinh học hệ thứ hai Đây giải pháp đánh giá cao nguyên liệu sừ dụng cellulose, chủ yếu tàn dư sau thu hoạch cùa nghành nông nghiệp rơm, bã mía Mặc dù đánh giá cao nhiên nhiên chi phí để chuyển đối sinh khối chủ yếu cellulose thành lượng khó khăn phí sản xuất cao.1-5 Ngồi ra, hai loại xăng sinh học hệ thứ ba thứ tư nghiên cứu.6 Hiện nay, để xử lý sinh khối thực vật với cấu trúc polysaccharide phương pháp sử dụng phương pháp hóa học sử dụng nhiệt Một phương pháp khác đầy hứa hẹn sử dụng enzyme đe phân giải sinh khối.7 Enzyme cơng cụ tiềm tính an tồn, khơng gây ô nhiễm nên thường ứng dụng ứng dụng cơng nghệ sinh học xanh.7 Ngồi ra, enzyme có tính chọn lọc cao điều kiện phản ứng đơn giản phụ thuộc nhiệt độ pH.7 vấn đề đặt cần phải nghiên cứu ... TÀI NCKH DÀNH CHO CÁN Bộ - GIẢNG VIÊN 2019 Tên đề tài: Tạo dịng gene mã hóa Polysaccharide Monooxygenase (PMO) vector pEX2B hướng tói biểu Aspergillus oryzae Số hợp đồng: 2019.01.07/HĐ-KHCN Chù... pháp tạo dịng DNA Phương pháp tạo dịng DNA đóng vai trò quan trọng đề tài này, vật liệu chuẩn bị cho phản ứng tạo dòng bao gom vector, đoạn gene NCU08746 enzyme cắt nối Trong nghiên cứu này, vector. .. đề tài hướng đến biểu NCƯ08746 nấm sợi A Oryzae 1.5 Các phương pháp chuyến gene vào nấm sợi Hiện nay, số phương pháp chuyển gene sử dụng chuyển gene vào tế bào trần (protoplast), chuyền gene xung