Tạo dòng gene Benchwarmer (BNCH) mang đột biến Glutamic acid 164 thành Lysine (E164K) trên vector pcDNA3.1

NTTU-NCKH-05 CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Độc lập - Tự - Hạnh phúc Đơn vị chủ trì: Trường Đại học Nguyễn Tất Thành BÁO CÁO TƠNG KẾT ĐÈ TÀI NCKH DÀNH CHO CÁN Bộ - GIẢNG VIÊN 2019 - 2020 Tên đề tài: Tạo dòng gene Benchwarmer (BNCH) mang đột biến Glutamic acid 164 thành Lysine (E164K) vector pcDNA3.1 Sổ hợp đồng: 2020.01.002 Chủ nhiệm đề tài: Nguyễn Hồng Danh Đơn vị cơng tác: Viện kĩ thuật công nghệ cao Nguyễn Tất Thành Thời gian thực hiện: 02/2020 - 08/2020 TP Hồ Chí Minh, ngày 01 thảng 12 năm 2020 MỤC LỤC MỞ ĐẦU (ABSTRACT) CHƯƠNG TÓNG QUAN TÀI LIỆU Tổng quan Ly some Chức cùa lysosome Lysosomal storage disease (LSD) - Bệnh liên quan đen rối loạn tích trữ Lysosome Tồng quan gene Benchwarmer (BNCH) 10 Đột bien E164 K gene Benchwarmer 12 CHƯƠNG NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỬU VẬT LIỆU NGHIÊN cửu 14 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cứu .14 2.1 Tạo đột bien E164K gene BNCH phương pháp gây đột biến định hướng diem (Site-directed mutagenesis) 14 2.2 Tạo dòng gene BNCH* 16 2.3 Kiểm tra dòng biến nạp PCR khuẩn lạc 17 2.4 Kiểm tra dòng biến nạp phản ứng enzyme giới hạn 18 2.5 Kiếm tra đột biến phương pháp giải trình tự Sanger 19 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN KÉT QUẢ 20 1.1 Plasmid pcDNA3.1 20 1.2 Tạo đột biến E164K gene BNCH 20 1.3 Tạo dòng gene BNCH chùng vikhuẩn E.coli OmniMAX 21 THẢO LUẬN 23 CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ KIÉN NGHỊ KÉT LUẬN 25 KIÉNNGHỊ 25 TÀI LIỆU THAM KHẢO 26 PHỤ LỤC 1: DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHŨ VIẾT TÁT Benchwarmer BNCH DNA E164K Deoxyribonucleic acid Biến đổi Axit glutamic vị trí 164 thành Lysine LSD Lysosomal storage disease MFS Major Facilitator Superfamily Mammalian target of rapamycin mTOR PCR Polymerase chain reaction RNA Ribonucleic acid PHỤ LỤC 2: DANH MỤC CÁC HÌNH ANH Hình Dự đoán cấu trúc cùa protein thành viên thuộc nhóm MFS khơng điển hình 10 Hình Cấu tạo amino axit lysine axit glutamic 12 Hình Vị trí đột biến trình tự axit amin cùa protein BNCH từ loài đại diện: chuột (mouse rat), người ruồi giấm Vị trí axit glutamic 164 (màu đỏ) báo ton loài 13 Hình Sơ đồ tạo đột biển bang phương pháp gây đột biến định hướng diem 15 Hình Cấu trúc plasmid pcDNA3.1 20 Hình Hình điện di sân phẩm PCR cùa phàn ứng 21 Hình Ket điện di sàn phàn Colony PCR khuẩn lạc .22 Hình Kiểm tra pcDNA3.1/ BNCH enzyme Ndel Xhol 22 Hình Ket giải trình tự plasmid DNA bang moi CMV-F 23 TÓM TẮT KẾT QUẢ NGHIÊN cứu Sản phẩm thực đạt Sản phẩn đăng ký thuyết minh Một báo đăng tạp chí Khoa học Cơng nghệ Trường Đại học Nguyền Tầt Thành Một báo đăng tạp chí Khoa hoc Cơng nghệ Trường Đại học Ngun Tầt Thành Quy trình tạo dịng gene Bench warmer (BNCH) mang đột biên E164K vector pcDNA3.1 trình bày chi tiêt báo Quy trình tạo dịng gene Benchwarmer (BNCH) mang đơt biên E164K vector pcDNA3.1 Thòi gian đăng ký: từ ngày 02/2020 đến ngày 11/2020 Thòi gian nộp báo cáo: ngày 01/12/2020 MỞ ĐẦU (ABSTRACT) Lysosome, bào quan có mặt hầu hết tế bào nhân thật, đóng vai trị quan trọng q trình tiêu hóa nội bào, tự thực chết theo chương trình nhờ sở hữu trăm enzyme thủy phân khác hoạt động môi trường pH thấp (pH ~ 4.5) bên lysosome ' Những enzyme thủy phân không tham gia vào trình phân giải đại phân từ sinh học protein, lipid carbohydrate mà đóng vai trò định tiêu hủy tác nhân gây bệnh đưa den lysosome đại thực bào hệ thong miền dịch2 Những năm gần đây, lysosome cịn biết đen trung tâm phát tín hiệu cho hoạt động trao đối chất nội bào thơng qua q trình điểu khiến thức hoạt động cũa hai phức hệ mTORCl mT0RC2 Đây hai phức hệ điều hịa hầu het chức sống cùa te bào thơng qua hoạt tính kinase cúa protein TOR (targets of rapamycin) Hai hệ thong gần chửng minh có khả di trú den lysosome nhận biết tín hiệu phát từ lysosome, mà sản phẩm thủy phân thông qua hàng loạt protein vận chuyển lưu trú màng lysosome Ví dụ protein vận chuyến Solute Carrier 38A9 (SLC38A9) xác định kênh vận chuyến axit amin không thay the từ lysosome trực tiếp tín hiệu cho phức hệ mTORC từ điều hịa biểu gene mã hóa cho trình sinh tổng hợp protein K.ết quà cho thấy lysosome không đơn giàn chi bào quan tiêu hóa mà cịn nơi thực chức truyền tín hiệu điều khiển hoạt động trao đổi chất cùa tế bào Sự có mặt đa dạng protein vận chuyến màng lysosome cho thấy khơng chì axit amin mà sản phẩm thúy phân lipid carbohydrate có the đóng vai trị chất dẫn truyền tín hiệu điều hịa hoạt động song bàn te bào Đáng ý hơn, nhiều ket quà nghiên cứu cho thấy, protein màng lysosome đối tượng hướng đích quan trọng điều trị khối u tăng sinh kiểm soát te bào ung thư Đối tượng nghiên cứu đề cương gene BNCH (hay có tên loại khác Spinier) người, BNCH mã hóa cho protein vận chuyển có mặt màng lysosome, chưa mô tả ve mặt chức phân tứ Tuy nhiên, đột biển chức gene BNCH dịng tế bào mơ hình sinh vật khác ruồi giấm (Drosophila Melanogaster) cá ngựa van (zebrafish, Danio rerio) cho thấy protein BNCH có xuất màng lysosome đóng vai trị quan trọng bào quan việc thực chức chuyển hóa nội bào carbohydrate lipid; liên kểt chặt chẽ với trình hình thành cấu trúc vận chuyển nội bào endosome, autolysosome lysosome Ngoài ra, nhiều nghiên cứu rang, chức BNCH ành hưởng lớn đến hoạt động tập tính chức thần kinh sinh vật Mặc dù chất protein vận chuyển chưa biết đen Một nghiên cứu ruồi giấm mang đột bien BNCH gây tích lũy lượng lớn sphingolipid (ceramide sphingosine) thể ấu trùng ruồi cho thấy BNCH có vai trị quan trọng điều hịa q trình trao đổi chất loại lipid kể Các nghiên cứu chưa công bố rang chức BNCH dần đen điêu hòa nhiều protein xuyên màng vận chuyển chất dinh dưỡng (glucose, lactate axit amin) từ ảnh hường lớn đến sức sống cùa sinh vật đặc biệt giai đoạn sớm q trình phát triển phơi Đáng ý hơn, kênh vận chuyển dinh dường chịu tác động điều hòa phức hệ mT0RC2 hoạt động sinh tổng hợp ceramide Các quan sát dần đen già thuyết ve vai trò BNCH kênh vận chuyền chất quan trọng từ môi trường bên lysosome tế bào chất chất được nhận biết phức hệ mT0RC2 nham thúc đẩy chức tế bào sinh tổng hợp lipid, protein điều tiết kênh vận chuyển chất dinh dưỡng càn thiết để đáp ứng với nhân tố môi trường tác động lên te bào Chúng đặt mục tiêu xác định chất cùa BNCH để hiểu chức cũa BNCH chế gây kiểu hỉnh quan sát tế bào thể sinh vật mang đột biến chức BNCH Với bước đau thực đe cương nghiên cứu tạo dòng gene BNCH người có mang đột biến biến đổi axit glutamic vị trí 164 thành lysine (E164K) Vị trí axit amin glutamic 164 cùa protein BNCH người bảo ton nhiều sinh vật khác ruồi giấm, nấm men, cá ngựa vằn chuột; thể đột biến E164K chứng minh đột biến chức gene BNCH Chúng tơi tạo dịng đột biến E164K gene BNCH người nhằm tạo nguyên liệu cho nghiên cứu chức phân từ tìm hiểu chất protein BNCH CHƯƠNG TÓNG QUAN TÀI LIỆU Tổng quan Lysome Lysosome nhà khoa học Christian de Duve (nhà tế bào học hóa sinh người Bì) nghiên cứu, mơ tà đau tiên vào năm 1949 đặt tên vào năm 1955 Lysosome “túi” chuyên biệt te bào, chúng tiêu hóa đại phân từ (như carbohydrate, lipid, protein axit nucleic) thông qua việc sứ dụng enzyme thủy phân chứa bên bào quan Lysosome có hầu het te bào động vật đơn bào đa bào; te bào người chứa khoảng 300 lysosome Đặc biệt lysosome có mặt với so lượng nhiều có kích thước lớn te bào miền dịch, đại thực bào bạch cầu Khơng tiêu hóa đại phân tữ, lysosome cịn phá hủy giúp “tiêu hóa” bào quan bị hư hỏng, suy thoái hay chất thải cùa te bào thơng qua q trình tự thực (autophagy)7 Kích thước hình dạng cùa lysosome rat đa dạng phụ thuộc vào chất khác mà lysosome thu thập để phân giải Lysosome thường có hình cầu với đường kính từ 0.2 - 0.4 pm, nhiên chúng có the đạt tới kích thước lớn den - pm Màng lysosome màng sinh chất cấu tạo từ protein màng kép lipid Lysosome hình thành cách “nảy chồi” từ máy Golgi enzyme thũy phân bên chúng hình thành mạng lưới nội chất Các enzyme gắn phân tữ mannose-6-phosphate, vận chuyến đen máy Golgi túi nội bào, sau đưa vào lysosome Trong lysosome có chứa nhiều enzyme thủy phân như: phosphatase, lipase, protease, DNase, RNase, glucosidase, collagenase cathepsine9 Đen nay, nhà khoa học xác định xác 60 loại enzyme khác có lysosome l0 Những enzyme hoạt động môi trường pH thấp (khoảng pH ~ 4.5 - 5.0), enzyme thũy phân cùa hoạt động tốt độ pH thay độ pH trung tính cũa phan lại cùa te bào 11 Chức lysosome Lysosome bào quan tham gia vào q trình tiêu hóa nội bào Lysosome tiêu húy dị vật xâm nhập vào te bào, tiêu hóa bào quan thối hóa, hư hỏng khơng cịn hoạt động Các enzyme lysosome phá vỡ phân tứ khác thơng qua q trình thũy phân, đó, phân tứ nước tách thành nhóm H OH' gan vào chất, khiến chúng bị phân cắt Từ đó, lysosome phân giải đại phân tử carbohydrate, lipid, protein, DNA, RNA, thành đơn phân glucose, amino axit, Các sản phấm lysosome phân giải phần có the te bào tái sứ dụng, cịn chất có hại cho te bào bị thài khỏi te bào tích lũy lysosome dạng hạt lipofucsin Vì vậy, lysosome coi thành phần hệ thống tiêu hóa cùa te bào 12 Ngồi ra, lysosome tham gia vào đường tự thực (autophagy) qua phá húy bào quan hư hỏng hoạt động không chức 12’13 Khi nhận tín hiệu trinh tự thực bắt đầu với việc hình thành cấu trúc autophagosome để bao quanh bào quan cần tiêu húy Sau autophagosome dung hợp với lysosome tạo thành autophagolysosome Cuối trình tiêu húy thành phần bên autophagolysosome enzyme thũy phân bên Tương tự, lysosome cịn đóng vai trị q trình thực bào (phagocytosis)14 Gần đây, chức quan trọng mô tà lysosome trung tâm truyền tín hiệu, chuyển hóa kiểm sốt chất lượng thơng qua phức hệ mTORC (bao gồm mTORCl mT0RC2)l2 Các sàn phẩm bên lysosome vận chuyển te bào chất thòng qua kênh vận chuyển màng lysosome, đây, phức hệ mTORC nhận diện các tín nội bào nham điều hịa hoạt động trao đoi chất cùa te bào thông qua phức hệ mTORC 3’12,15 Vì the chức cùa kênh vận chuyển lysosome không gây tích tụ chất lysosomne mà cịn che gây hàng loạt bệnh tiểu đường, tăng sinh khối u, thông qua phức hệ mTORC 12’16 Lysosomal storage disease (LSD) - Bệnh liên quan đến rối loạn tích trữ lysosome Bất thường hoạt động cùa enzyme dị hóa lysosome biết đen nguyên nhân dấn đến bệnh rối loạn tích trữ lysosome (LSD) Một số hội chứng điển hình biét đến bệnh Gaucher, Faber, hay NPC 17 Ve mặt bệnh học tất cà bệnh LSD chia sẻ chế bệnh sinh tích tụ chất chuyển hố khác lysosome Q trình tích tụ sàn phẩm lysosome gây ảnh hưởng đến chức lysosome, dần tới phá huỳ cấu trúc chức tế bào gây lên chức quan, tổ chức khác the 18 Các nhóm bệnh lớn bao gom MPS, GM2 gangliosidose, neutral glycosphingolipidose, glycoproteinose, mucolipidose, hội chứng loạn dưỡng chất trắng não, bệnh tích trữ glycogen, rối loạn mờ trung tính rối loạn protein vận chuyển rối loạn phân bo protein te bào 18 Chấn đoán bệnh LSD thường gặp nhiều khó khăn biểu triệu chứng lâm sàng đa dạng Quy mô nghiêm trọng cũa bệnh thường không đong với nhau, chí bệnh nhân gia đình biểu khác có bệnh nhân kiểu gene lại khác biệt kiểu hình Biểu bệnh khác tuổi khới phát, mức độ phức tạp cùa chất lysosome, ti lệ chất tích tụ phân bố quan tổ chức cũa l9 Ngoài ra, yếu tố di truyền, yếu tố môi trường thiểu hụt sàn phẩm cuối cùa đường chuyển hố ảnh hưởng đến biểu bệnh Tuy nhiên, Việt Nam nghiên cửu hạn che đe cập cách tồn diện đến nhóm bệnh LSD, dần đến bị sót, chẩn đốn muộn, chẩn đốn sai, khơng điều trị kịp thời Tổng quan gene Benchwarmer (BNCH) Như đe cập trên, đối tượng nghiên cứu gene BNCH Gene Benchwarmer lần phát Kania năm 1996 ruồi giấm {Drosophila) 20 Đen nay, Benchwarmer chứng minh kênh vận chuyển màng endosomal muộn/ lysosome ty thể 21'22 Tuy nhiên, chất cúa kênh vận chuyển hoạt động tương tác protein te bào đen vần chưa làm rõ Benchwarmer protein màng endosomal muộn/ lysosome, bao gom trình tự 512 axit amin với kích thước 56,63 kDa 21 BNCH thuộc họ protein MFS (Major facilitator superfamily), protein màng với 12 mien xuyên màng thuộc nhóm protein vận chuyển thứ cấp (khơng sừ dụng ATP)23 (hình 1) («) N-domain C-domain MFS loop Hình Dự đốn cấu trúc cùa protein thành viên thuộc nhóm MFS khơng điển hình (trong có BNCH 24 Chú thích: (a) Tô pô học cùa protein MFS, tất cà protein thành viên MFS có cấu trúc phần N c noi với loop nội bào dài (MFS loop), tạo thành chuồi polypetide với 12 vùng xuyên màng (TMS) Ba đại diện đặc trưng họ protein MFS người Trong đó, BNCH có trình tự axit amin tương đong với SPNS2 10 Ớ Drosophila (ruồi giấm), đột biến gene BNCH gây giảm tuổi thọ cá trưởng thành, khiem khuyet hành vi giới tính thối hóa thần kinh 23 Đột biến gene BCNH the phát triển mức cùa synap than kinh co tăng độc tính qua trung gian Tau 23 Ớ cá ngựa van (zerafish), đột biến chức gene BNCH dẫn đen tượng chết phôi gây tích tụ chất dẫn đen tượng mờ đục phôi25 Đặc biệt, đột biến gene BNCH biểu khiếm khuyết nội tiết, tích lũy carbohydrate lysosome thay đổi hình dạng lysosome 21 Tuy nhiên, hiểu biết chế dẫn đến tích tụ liên quan đen đột biến gene BNCH Trên nghiên cứu cá ngựa vần cho thấy BNCH liên quan đen hoạt động điều hịa pH cùa lysome Mơi trường pH thấp cùa lysosome chữ yếu trì bơm proton vacuolar-type H+-ATPase (v-ATPase, ATP6V0A4) 26 Mất chức BNCH dẫn đến hai quan sát quan trọng Một tích lũy cùa tien chat lipofucine te bào đột biến BNCH cho thấy protein vận chuyển màng BNCH ngăn chặn q trình chuyển hóa tiền chất lysosome Hai đột biến BNCH giám pH cùa lysosome so với lysosome te bào bỉnh thường Thay đoi pH lysosome ngun nhân gây kiều hình bất thường quan sát cá ngựa vằn mang đột biến BNCH Đáng ý, kiểu hình bất thường thể đột biển BNCH hồi phục v-ATPase bị bất hoạt đồng thời Điều giải thích việc pH cùa lysosome tái thiết lập phần cà v-ATPase (bơm proton vào lysosome) BNCH (đẩy proton ngoài) lúc bị bất hoạt Từ quan sát trên, BNCH đe xuất protein vận chuyển màng lysosome có hoạt động vận chuyền chất gắn liền với việc bơm proton H khói lysosome Vì thế, chức protein BNCH chịu tác động cùa pH lysosome26 Dựa phân tích thành phần lipid cho thay ấu trùng ruồi giấm mang đột biến chức BNCH xuất lượng ceramide sphingosine lớn gấp hàng trăm lần so với thể ấu trùng không mang đột bien 27 Ket quà gợi ý cho khả BNCH kênh vận chuyển sphingolipid đơn giản sphigosine từ bên lysosome bên để tái sứ dụng cho sinh tồng hợp sphingolipid phức tạp sphingosine tiết từ lysosome cảm ứng mTOR cần thiết để hoạt hóa phức hệ Trên thực tế, mT0RC2 trực tiếp tham gia vào sinh tổng họp lipid đặc biệt sphingolipid28 Từ thông tin với phân tích bước đầu cùa nghiên cứu thay đổi biểu gene tế bào chức gene BNCH, đặt mục tiêu tìm hiểu chức protein BNCH chất vận chuyển cùa chúng 11 Sau khi, kiểm tra plasmid pcDNA3.1/5jVC77* biến nạp vào tế bào E.coli OmniMAX Nhóm tiến hành giải trình tự plasmid từ số khuấn lạc đe kiểm tra đột biến Mầu gửi giài trình tự bang primer CMV-F Ket trình bày sau: Hình Kết giải trình tự plasmid DNA mồi CMV-F (A) - pcDNA3.1/Z?.'VC77* (gene BNCH mang đột biến E164K); (B) - pcDNA3.1/.£LVC7/(gene BNCH không mang đột biến) Như vậy, nhóm nghiên cứu tạo dịng thành cơng plasmid pcDNA3.1/5NC7/ mang đột biến vị trí mong muốn hệ thống vi khuẩn E coli OmniMAX Điều chứng minh qua kết quâ phản ứng enzyme cat, kểt PCR khuẩn lạc giải trình cùa gene BNCH THẢO LUẬN Gene mã hóa cho protein BCNH nằm nhiễm sắc thể 16 (NC_000016.10), hay biết đến với tên gọi Spinster! Spin ruồi giấm 23’25’34 Protein BCNH thuộc họ protein Major Facilitator Superfamily (MFS) với cấu trúc điển hình gồm 12 vùng xun màng có trình tự axit amin tương đong gan với SPNS2 24’35 Vai trò sinh học chất cùa protein BNCH chưa làm rõ Tuy nhiên, phân tích te bào ni cấy mơ hình động vật ruồi giấm (Drosophila melanogaster) cá ngựa van (Danio rerio) cho thấy BNCH biểu bào quan endosome muộn (Late Endosome), lysosome 36, bề mặt ty the“ Việc suy giảm chức gene BNCH cho thấy protein quan trọng trình apotosis 22, nhập bào (endocytosis), tự thực (autophagy) chức cùa lysosome 26,36 Hơn nữa, BNCH với kênh vận chuyển v-ATPase đóng vai trị quan trọng việc trì cân nồng độ H+ lysosome 26 Ngồi ra, BNCH kênh vận chuyển sphingolipid đơn giàn sphigosine từ bên lysosome bên để tái sư dụng cho sinh tổng hợp sphingolipid phức tạp hơn26 23 Đột biến E164K gene Benchwarmer lần mô tả nghiên cứu Dermaut công (2005) 21 Trong nghiên cứu này, mức độ biểu cùa protein BNCH khảo sát mơ hình ruồi giấm (Drosophila) Ngồi ra, chúng tơi nhận thấy vị trí axit amin glutamic 217 (E217) gene BNCH loài ruồi giam (Drosophila), bảo ton loài khác nhau; điều cho thấy axit amin cần thiết ve mặt chức Trong nghiên cứu Dermaut công (2005), đột biến E217 thành lysine (E217K) dẫn đen chức hoạt động vận chuyển carbohydrate ruồi giấm từ tác động đen q trình hồi phục lysosome sau tham gia vào đường tự thực ALR (autophagosome lysosome reformation)21’29 Vì vậy, vị trí axit amin gluctamic 164 gene BNCH người (tương ứng với axit amin gluctamic 217 ruồi giấm) đóng vai trị quan trọng chức vận chuyển chất qua màng lysosome cùa BNCH Trong nghiên cứu này, chúng tơi thực việc tạo dịng gene BNCH người mang đột biến E164 K vào vector biểu pcDNA3.1 Phương pháp đột biến gây định hướng điểm sữ dụng để tạo đột biến E164K Phương pháp chù yểu dựa phản ứng PCR nên phương pháp dễ thực đơn giản đe tạo đột biển so vị trí định Chùng E coli OmniMAX dùng làm chùng biến nạp cho bước dịng hóa Cuối cùng, vi khuẩn E coli OmniMAX mang vector pcDNA3 VBNCH* tạo dịng thành cơng, điêu chứng minh qua kết cùa phản ứng enzyme giới hạn, PCR khuẩn lạc giái trình tự plasmid pcDNA3.1/57VC/7* Ngồi ra, nhóm nghiên cứu thành công xây dựng phương pháp đơn giản, dễ áp dụng việc tạo đột biển gene mong muốn Bằng phương pháp đột biến gây định hướng điểm nên quy trình dễ thực tiết kiệm so với phương pháp khác (như kỳ thuật CRISPR/Cas9) 24 CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN Những kết cho thấy tạo thành cơng đột bien E164K gene BNCH Cùng với đó, nhóm nghiên cứu tạo dịng thành cơng chủng vi khuẩn E coli OmniMAX mang plasmid tái tổ họp pcDNA3.1/5jVC7/* Đây nguồn nguyên liệu ban đau cho nghiên cứu tương lai nhằm xác định vai trò, chức kênh vận chuyển BNCH KIẾN NGHỊ Từ kết quà đạt đuợc nhóm tiến hành so kiến nghị cho nghiên cứu sau: - Biểu plasmid pcDNA3 Ỉ/BNCH* plasmid pcDNA3 Ỉ/BNCH té bào HEK293 Từ đó, phân tích so sánh cùa te bào không mang đột biến te bào mang đột biến chức BNCH, từ xác định vị trí protein ảnh hưởng mứcn độ te bào dựa kiểu hình te bào - Phân tích so sánh mức độ biểu protein bị tác động BNCH kỳ thuật qRTPCR, western blot tế bào kiểu dại tế bào đột biến gene BCNH Chủ nhiệm đề tài (Ký ghi rõ họ tên) Nguyễn Hoàng Danh 25 TÀI LIỆU THAM KHẢO de Duve, c Structure and functions of lysosomes, in Funktionelle und morphologische Organisation der Zelle 209-218 (Springer, 1963) Hipolito, V E B., Ospina-Escobar, E & Botelho, R J Lysosome remodelling and adaptation during phagocyte activation Cellular Microbiology vol 20 1-8 (2018) Lamming, D w & Bar-Peled, L Lysosome: The metabolic signaling hub Traffic 20, 2738 (2019) Wyant, G A et al mTORCl Activator SLC38A9 Is Required to Efflux Essential Amino Acids from Lysosomes and Use Protein as a Nutrient Cell 171, 642-654.el2 (2017) Carroll, B et al Persistent mTORCl signaling in cell senescence results from defects in amino acid and growth factor sensing J Cell Biol 216, 1949-1957 (2017) Hebbar, s et al Lipid metabolic perturbation is an early-onset phenotype in adult spinster mutants: a Drosophila model for lysosomal storage disorders Mol Biol Cell 28, 37283740 (2017) Liillmann-Rauch, R History and morphology of the lysosome, in Lysosomes 1-16 (Springer, 2005) Kuhnel, w Color Atlas of Cytology, Histology and Microscopic Anatomy (Georg Thieme Verlag, 2003) Lodish, H et al Molecular cell biology 4th edition Natl Cent Biotechnol Information, Bookshelf (2000) 10 Xu, H & Ren, D Lysosomal physiology Annu Rev Physiol 77, 57-80 (2015) 11 Ohkuma, s & Poole, B Fluorescence probe measurement of the intralysosomal pH in living cells and the perturbation of pH by various agents Proc Natl Acad Sci 75, 3327-3331 (1978) 12 Lawrence, R E & Zoncu, R The lysosome as a cellular centre for signalling, metabolism and quality control Nature Cell Biology (2019) doi: 10.1038/s41556-018-0244-7 13 Matile, p Biochemistry and function of vacuoles Annu Rev Plant Physiol 29, 193-213 (1978) 14 Yim, w w Y & Mizushima, N Lysosome biology in autophagy Cell Discovery (2020) doi: 10.1038/S41421 -020-0141-7 15 Panic, B et al mTORCl Senses Lysosomal Amino Acids 678-684 (2011) 26 16 Masui, K., Cavenee, w K & Mischel, p s MT0RC2 in the center of cancer metabolic reprogramming Trends Endocrinol Metab 25, 364-373 (2014) 17 Solomon, M & Muro, s Lysosomal enzyme replacement therapies: Historical development, clinical outcomes, and future perspectives Adv Drug Deliv Rev 118, 109— 134 (2017) 18 Rosenbloom, B E & Weinreb, N J Gaucher disease: a comprehensive review Crit Rev Oncog 18, (2013) 19 Carmona-Gutierrez, D., Hughes, A L., Madeo, F & Ruckenstuhl, c The crucial impact of lysosomes in aging and longevity Ageing Res Rev 32, 2-12 (2016) 20 Kania, A Mutations in neuromusculin and benchwarmer affect early nervous system development and neuronal survival (1996) 21 Dermaut, B et al Aberrant lysosomal carbohydrate storage accompanies endocytic defects and neurodegeneration in Drosophila benchwarmer J Cell Biol 170, 127-139 (2005) 22 Yanagisawa, H., Miyashita, T., Nakano, Y & Yamamoto, D HSPIN1, a transmembrane protein interacting with BCL-2/BCL-X L, induces a caspase-independent autophagic cell death Cell Death Differ 10, 798-807 (2003) 23 Sweeney, s T & Davis, G w Unrestricted synaptic growth in spinster—a late endosomal protein implicated in TGF-p-mediated synaptic growth regulation Neuron 36, 403-416 (2002) 24 Perland, E., Bagchi, s., Klaesson, A & Fredriksson, R Characteristics of 29 novel atypical solute carriers of major facilitator superfamily type: evolutionary conservation, predicted structure and neuronal co-expression Open Biol 7, 170142 (2019) 25 Young, R M et al Zebrafish yolk-specific not really started (nrs) gene is a vertebrate homolog of the Drosophila spinster gene and is essential for embryogenesis Dev Dyn an Off Publ Am Assoc Anat 223, 298-305 (2002) 26 Sasaki, T et al Autolysosome biogenesis and developmental senescence are regulated by both Spnsl and v-ATPase Autophagy 13, 386-403 (2017) 27 Hebbar, s et al Lipid metabolic perturbation is an early-onset phenotype in adult spinster mutants: a Drosophila model for lysosomal storage disorders Mol Biol Cell 28, 3728- 3740 (2017) 28 Guri, Y et al mTORC2 Promotes Tumorigenesis via Lipid Synthesis Cancer Cell 32, 807- 823.el2 (2017) 27 29 Rong, Y et al Spinster is required for autophagic lysosome reformation and mTOR reactivation following starvation Proc Natl Acad Sci 108, 7826 LP - 7831 (2011) 30 Hutchison, c A et al Mutagenesis at a specific position in a DNA sequence J Biol Chern 253,6551-6560(1978) 31 Mikaelian, I & Sergeant, A A general and fast method to generate multiple site directed mutations Nucleic Acids Res 20, 376 (1992) 32 Ishii, T M et al [4] Site-directed mutagenesis, in Methods in enzymology vol 293 53-71 (Elsevier, 1998) 33 Kim, Y.-G & Maas, s Multiple site mutagenesis with high targeting efficiency in one cloning step Biotechniques 28, 196-198 (2000) 34 Nakano, Y et al Mutations in the Novel Membrane Protein Spinster Interfere with Programmed Cell Death and Cause Neural Degeneration inDrosophila melanogaster Mol Cell Biol (2001) doi:10.1128/mcb.21.11.3775-3788.2001 35 Fukuhara, s etal The sphingosine-1-phosphate transporter Spns2 expressed on endothelial cells regulates lymphocyte trafficking in mice J Clin Invest (2012) doi:10.1172/JCI60746 36 Yanagisawa, H et al L-leucine and SPNS1 coordinately ameliorate dysfunction of autophagy in mouse and human Niemann-Pick type c disease Sei Rep (2017) doi: 10.1038/s41598-017-15305-9 28 PHỤ LỤC 3: DANH MỤC CÁC SẢN PHÁM CỦA ĐỀ TÀI 3ÍV11.Omul - M|I bé Upp rH M Ik»: MỀ oârg nghệ - ŨH hợt: Nyiiyir TỂI Tbểrt* Gmal Danh Nguyờn ã-anhh&angi4@gmaii.coôn> Np bi Khoa hc công nghệ - Đại học Nguyền Tắt Thánh thừ 16:41 tháng 11, 2020 Danh Mguyé-n Tới: tapchkhcnữtntt edu Cc VO Minh Thiết Kính gút HỘI Đỏng Tạp chl KHRCN - Đại học Nguyên Tầt Thanh Em ten ta Nguyên Hoang Danh, em »n gin hàn tháo há han * Clnnng human fieicTtA'arrtiergcnc |BNCH| hartonng I IMK In vecnr PC0NA3 by sce-anecsed mutagenesis methocT đẻ nghộm thu đè 'ál RAt mnng nhạn đirục phan hịi tứ Hu Đèng Trân vọng! Nguyỉn Hồng Danh Viện Kĩ Thuật Cống Nghệ Cao Tnmng Dạ học Nguyên Tát Thanh tệp đinh kem ) Phteu dang ki nop bai - Vu Minh Thletdocx 22K , MS_2020.01.002-Nguyen Hoang Danti.docx - * 1377K - Ptueu dang kí nop bai - vu Minh Thletpdt - 249K Tap cm, KHCN Tr danhhoang 1804đgmaii corn 16:41 mang 11, 2020 Ban Biên l$c> tap chi' Khoa hộc vả Cồng ogltệ dã nhận thúng tin Tràn ‘.rong cấm ơn BBT TẠP CHÍ KHOA HỌC rl CỎNG NGHÉ JouruJ of Sdeace aid TtchaologT 300A Ngưyèri Tốí Thânh, P13.04, TPHCM - (tầu X P.407) Bc 028.3941^45« (Zxc 185) - Fu 023.3940.47«) Tap cm, KHCN