Nghiên cứu diễn tiến sạch ký sinh trùng plasmodium vivax sau điều trị thuốc chloroquine phosphate và một số chỉ điểm phân tử tiềm năng liên quan kháng thuốc tại tỉnh gia lai

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC QUY NHƠN HOÀNG LƯƠNG GIANG NGHIÊN CỨU DIỄN TIẾN SẠCH KÝ SINH TRÙNG Plasmodium vivax SAU ĐIỀU TRỊ THUỐC CHLOROQUINE PHOSPHATE VÀ MỘT SỐ CHỈ ĐIỂM PHÂN TỬ TIỀM NĂNG LIÊN QUAN KHÁNG THUỐC TẠI TỈNH GIA LAI Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 8420114 Người hướng dẫn: TS.BS HUỲNH HỒNG QUANG i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng tơi với nghiên cứu viên đồng thực thực địa huyện Đăk Đoa, tỉnh Gia Lai La bô Khoa Nghiên cứu Điều trị Khoa Xét nghiệm Sinh học phân tử, Viện Sốt rét - Ký sinh trùng - Côn trùng Quy Nhơn Các số liệu kết nêu luận văn hoàn tồn trung thực chưa cơng bố cơng trình khác Tác giả luận văn Hoàng Lương Giang ii LỜI CẢM ƠN Luận văn hồn thành khơng có giúp đỡ Q thầy cơ, bạn đồng nghiệp gia đình Với lịng kính trọng biết ơn sâu sắc, tơi xin trân trọng cảm ơn: TS.BS Huỳnh Hồng Quang Thầy giáo - Hướng dẫn khoa học dành nhiều thời gian, tận tình hướng dẫn, truyền đạt kiến thức, giúp đỡ, chỉnh sửa toàn đề cương luận văn, động viên tơi q trình học tập làm luận văn Trân trọng cảm ơn đến Trường Đại học Quy Nhơn, Ban Giám hiệu Nhà trường, Phòng Đào tạo sau đại học giúp cho hoàn thiện hồ sơ dự tuyển chương trình cao học, đồng thời dành điều kiện cho học tập nghiên cứu Xin trân trọng cảm ơn đến Quý thầy cô, đồng nghiệp công tác Khoa Sinh - Kỹ thuật Nông nghiệp, Đại học Quy Nhơn, Khoa Nghiên cứu Điều trị, Khoa Xét nghiệm - Sinh học phân tử, Viện Sốt rét - Ký sinh trùng - Côn trùng Quy Nhơn tạo điều kiện thực hành tốt nhất, đóng góp ý kiến sâu sắc để luận văn hoàn chỉnh Chân thành cảm ơn đến Quý cán y tế từ TTYT huyện đến Trạm y tế xã, y tế thôn buôn giúp đỡ suốt thời gian tham gia thực đề tài thực địa Kính trân trọng cảm ơn cha mẹ - người ln mong muốn tiến bộ, động lực mạnh mẽ, thay gánh vác việc gia đình cho tơi n tâm học tập, nghiên cứu khoa học Cuối cùng, xin cảm ơn đến tất người dân chia sẻ thông tin mẫu bệnh phẩm để số liệu xét nghiệm nghiên cứu cách đầy đủ Tác giả luận văn Hoàng Lương Giang iii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN … .i CÁM ƠN … ii MỤC LỤC iii DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT iv DANH MỤC CÁC BẢNG TRONG LUẬN VĂN v DANH MỤC CÁC HÌNH TRONG LUẬN VĂN vi ĐẶT VẤN ĐỀ Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Sốt rét loài Plasmodium vivax người 1.2 Sốt rét kháng thuốc từ liệu từ Mạng lưới kháng thuốc toàn cầu 1.3 Một số khó khăn thách thức loại trừ sốt rét P vivax 1.4 Điểm đặc biệt chu kỳ sinh học loài Plasmodium vivax 1.5 Nghiên cứu Plasmodium vivax kháng chloroquine 11 1.6 Nghiên cứu điểm phân tử để đánh giá kháng P vivax 18 1.7 Một số yếu tố thuận lợi cho ký sinh trùng sốt rét hình thành kháng 23 1.8 Một số đặc điểm khu vực nghiên cứu 24 Chương ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 27 2.1 Đối tượng nghiên cứu 27 2.2 Địa điểm thời gian nghiên cứu 29 2.3 Phương pháp nghiên cứu 29 2.4 Quy trình theo dõi bệnh nhân trước, sau điều trị 30 2.5 Phác đồ thay thuốc thất bại điều trị 31 2.6 Thuốc dùng đồng thời nghiên cứu 31 2.7 Kỹ thuật áp dụng nghiên cứu 31 2.8 Quy trình bước thực theo dõi bệnh nhân 33 2.9 Đánh giá kết hiệu lực thuốc theo hướng dẫn TCYTTG 2009 34 2.10 Phân tích xử lý số liệu 35 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN 37 3.1 Đặc điểm chung nhóm bệnh nhân tham gia nghiên cứu 37 3.2 Diễn tiến làm ký sinh trùng P vivax sau điều trị 42 3.3 Một số điểm phân tử tiềm liên quan kháng P vivax 47 KẾT LUẬN 54 KHUYẾN NGHỊ 55 TÍNH KHOA HỌC, TÍNH MỚI VÀ KHẢ THI CỦA ĐỀ TÀI 56 MỘT SỐ HẠN CHẾ CỦA ĐỀ TÀI LUẬN VĂN 57 TÀI LIỆU THAM KHẢO 58 PHỤ LỤC iv DANH MỤC CÁC TỪ VIÊT TẮT CDC Centers for Disease Control and Prevention CQ Chloroquine phosphate G6PD Glucose-6- Phosphate Dehydrogenase HC Hồng cầu KSTSR Ký sinh trùng sốt rét LTSR Loại trừ sốt rét PCSR Phòng chống sốt rét PCR Polymerase chain reaction_Phản ứng chuỗi trùng hợp P falciparum Plasmodium falciparum P vivax Plasmodium vivax PNMT Phụ nữ mang thai PQ Primaquine phosphate SR Sốt rét SRAT Sốt rét ác tính TCYTTG Tổ chức Y tế giới TES Therapeutic Efficacy Study_Nghiên cứu hiệu lực thuốc WHO World Health Organization v DANH MỤC CÁC BẢNG TRONG LUẬN VĂN Bảng 2.1 Liều thuốc Primaquine phosphate sử dụng dùng theo nhóm tuổi 26 Bảng 2.2 Cỡ mẫu tối thiểu dựa tỷ lệ thất bại lâm sàng 29 Bảng 2.3 Quy trình bước thực theo lịch nghiên cứu in vivo 35 Bảng 2.4 Phân loại hiệu điều trị theo tiêu chuẩn TCYTTG (WHO, 2009) 33 Bảng 3.1 Một số đặc điểm chung quần thể bệnh nhân nghiên cứu 38 Bảng 3.2 Một số nguyên nhân loại khỏi nghiên cứu phác đồ điều trị 39 Bảng 3.3 Một số đặc điểm dân số học nhóm bệnh nhân nghiên cứu 40 Bảng 3.4 Một số đặc điểm lâm sàng tiền sử sốt bệnh nhân nghiên cứu 41 Bảng 3.5 Một số đặc điêm ký sinh trùng bệnh nhân nghiên cứu 42 Bảng 3.6 Phân loại hiệu lực phác đồ chloroquine P vivax 43 Bảng 3.7 Hiệu lực cắt sốt làm KSTSR P vivax CQ 46 Bảng 3.8 Sự tái xuất ký sinh trùng P vivax thời gian nghiên cứu 47 Bảng 3.9 Diễn tiến làm tải lượng ký sinh trùng P vivax theo thời gian 47 Bảng 3.10 Chỉ điểm phân tử tiềm liên quan kháng thuốc P vivax 48 Bảng 3.101 Tình trạng phân lập P vivax mang đơn điểm hay đa điểm 49 vi v DANH MỤC CÁC HÌNH TRONG LUẬN VĂN Hình 1.1 Chu kỳ phát triển ký sinh trùng sốt rét Plasmodium spp Hình 1.2 Một số vùng Plasmodium vivax kháng thuốc chloroquine báo 14 cáo Hình 2.1 Địa điểm nghiên cứu xã Hà Đông, huyện Đăk Đoa, tỉnh Gia Lai 27 ĐẶT VẤN ĐỀ Tính cấp thiết lý chọn đề tài luận văn Sốt rét tiếp tục vấn đề y tế công cộng dù số ca mắc tử vong giảm đáng kể từ năm 2018 đến - theo số liệu báo cáo sốt rét toàn cầu Tổ chức Y tế giới [42] Trong đó, phần lớn số ca mắc chủ yếu tập trung cao châu Phi, Nam Mỹ số khác châu Á-Thái Bình Dương, đặc biệt khu vực Tiểu vùng Sông Mê Kông Phần lớn số ca tử vong liên quan sốt rét tập trung khu vực cận sa mạc Sahara-châu Phi Tại Việt Nam, sốt rét bệnh ảnh hưởng đến sức khỏe cộng đồng, đặc biệt khu vực miền Trung-Tây Nguyên Mặc dù, đạt nhiều thành cơng tác phịng chống sốt rét, song số thách thức đối mặt tình trạng dân di biến động, giao lưu biên giới vùng sốt rét khó kiểm sốt, muỗi kháng với hóa chất ký sinh trùng sốt rét kháng thuốc dùng, thay đổi cấu ký sinh trùng nên đe dọa Chiến lược loại trừ sốt rét Do đó, cơng tác giám sát sốt rét nói chung giám sát thường quy tình hình nhạy kháng thuốc điểm then chốt để thay đổi sách thuốc phù hợp giai đoạn Khơng lồi Plasmodium falciparum đa kháng thuốc lan rộng nghiêm trọng khu vực Tây Thái Bình Dương trở ngại kỹ thuật cho việc lựa chọn thuốc, mà loài Plasmodium vivax giảm đáp ứng kháng với chloroquine nhiều nước Campuchia, Thái Lan, Myanmar, Indonesia, Đông Timor Thuốc chloroquine dùng Việt Nam với đa mục đích dự phịng điều trị sốt rét Plasmodium falciparum Plasmodium vivax thời gian gần 60 năm, dù chưa có báo cáo kháng chloroquine Plasmodium vivax miền Trung-Tây Nguyên, song nhiều nghiên cứu quốc gia Đông Nam Á cho thấy nhiều tỷ lệ kháng khác Tại số vùng sốt rét lưu hành Việt Nam, theo dõi tính nhạy-kháng thuốc phát P vivax giảm nhạy kháng với chloroquine Bình Thuận [14], Bình Phước Quảng Nam Tỉnh Gia Lai số năm tỉnh có số ca mắc sốt rét cao nước số nghiên cứu thực hàng năm Viện Sốt rét - Ký sinh trùng - Côn trùng Quy Nhơn xác định có tình trạng lồi P falciparum kháng thuốc phối hợp dihydroartemisininpiperaquine phosphate (DHA-PPQ) loài P vivax có dấu hiệu giảm nhạy chloroquine số trường hợp theo dõi Huyện Đăk Đoa, tỉnh Gia Lai có tình hình sốt rét ổn định với số ca hàng năm giảm đáng kể vòng năm qua (2015-2020) chưa thấy tình trạng kháng thuốc đây, số ca mắc P falciparum P vivax xuất không nhiều chủ yếu bệnh nhân mắc sốt rét giao lưu vùng biên giới với Campuchia làm rừng, rẫy địa bàn huyện Do đó, để sử dụng thuốc hiệu quả, theo dõi diễn tiến nhạy-kháng thuốc sốt rét nói chung hiệu lực thuốc chloroquine phosphate dùng điều trị bệnh nhân sốt rét Plasmodium vivax cần thiết, đồng thời nhận định diễn biến kháng thuốc loài ký sinh trùng này, góp phần bổ sung liệu sở cho việc thay đổi sách thuốc sốt rét tương lai Trên sở đó, tơi thực đề tài “Nghiên cứu diễn tiến ký sinh trùng Plasmodium vivax sau điều trị thuốc chloroquine phosphate số điểm phân tử tiềm liên quan kháng thuốc tỉnh Gia Lai” Mục tiêu nghiên cứu - Đánh giá diễn tiến làm ký sinh trùng Plasmodium vivax sau điều trị phác đồ chloroquine phosphate điểm nghiên cứu; - Mô tả số điểm phân tử tiềm liên quan đến kháng thuốc quần thể loài Plasmodium vivax điểm nghiên cứu Đối tượng phạm vi nghiên cứu - Đối tượng nghiên cứu gồm BNSR nhiễm đơn P vivax phân lập KST P vivax để phân tích phân tử tìm điểm tiềm kháng thuốc; - Phạm vi nghiên cứu đánh giá hiệu lực thuốc chloroquine phân tích tìm điểm phân tử liên quan kháng thuốc sốt rét quần thể P vivax Phương pháp luận phương pháp nghiên cứu - Trong chiến lược LTSR từ đến năm 2030 tập trung vào nghiên cứu khía cạnh liên quan đến làm điều trị tiệt P vivax; - Với hai mục tiêu từ đề tài nghiên cứu giải dựa thiết kế nghiên cứu phù hợp thử nghiệm đánh giá hiệu lực thuốc chloroquine & phân tích phịng thí nghiệm tìm điểm phân tử tiềm liên quan kháng thuốc triển khai lấy vào lam kính mẫu giấy nhỏ Nghiên cứu hiệu lực thuốc kéo dài 28/42 ngày Trong thời gian bạn điều trị TYT xã BVĐK huyện sau đến TYT xã ngày sau ngày điều trị Sau 28/42 ngày kết thúc theo dõi Người vấn: kiểm tra với cháu cháu hiểu qui trình …………………….(ký) Thuốc gây tác dụng ngoại ý hoa mắt chóng mặt nhẹ, buồn nơn, nôn Chúng theo dõi chặt chẽ tác dụng ngoại ý xem có xuất khơng Nếu có bất thường xảy với bạn, muốn biết Bạn cảm thấy thoải mái để gọi cho lúc để trao đổi thắc mắc bạn Nếu bạn thấy mệt có lo lắng mà khơng trùng vào lịch khám báo cho chúng tơi y tá biết Nếu bạn không chờ đến lịch Chúng cung cung cấp thông tin cho bố mẹ bạn cách sử trí bạn đau ốm tham gia nghiên cứu Người vấn: Tôi kiểm tra với cháu cháu hiểu nguy bất tiện …………………….(ký) Nếu bạn định tham gia nghiên cứu này, ốm đau liên quan đến sốt rét tới điều trị sốt rét điều trị miễn phí cho bạn Bạn tham gia giúp đánh giá hiệu thuốc sốt rét có lợi cho xã hội hệ tương lai Người vấn: Tôi kiểm tra với cháu cháu hiểu lợi ích …………………(ký) Vì bạn sống xa sở y tế, đưa tiền lại cho bố mẹ bạn người bảo trợ Chúng tơi khơng nói với người ngồi nhóm nghiên cứu tham gia bạn vào nghiên cứu Thông tin thu thập từ nghiên cứu giữ bí mật Các thơng tin mà bạn cung cấp có người tham gia nghiên cứu biết Tất thông tin mã số thay cho tên bạn Chỉ nhóm nghiên cứu biết số bạn Và thông tin bị khoá Khi kết thúc nghiên cứu, ngồi với bạn, bố mẹ bạn người bảo trợ để nói chúng tơi học Chúng ytôi cung cấp cho bạn kết Sau chúng tơi nói với nhiều người, nhà khoa học đối tượng khác kết giám sát thuốc chúng tơi phát Chúng chia sẻ cách viết bài, chia sẻ báo cáo số liệu tham dự hội nghị với người quan tâm vào công việc Nếu bạn tham gia vào nghiên cứu này, bạn cung cấp để bạn giữ Bạn nhờ bố mẹ giữ, bạn muốn Bạn hỏi tơi câu hỏi hay sau Bạn hỏi y tá Tơi cho số điện thoại địa để bạn liên hoặc, bạn gần đến chỗ chúng tơi Bạn trao đổi thêm với bạn biết thầy giáo, bác sĩ, dì PHÂN II: PHIẾU CHẤP THUẬN THAM GIA NGHIÊN CỨU Tôi mời tham gia nghiên cứu giám sát hiệu lực điều trị thuốc sốt rét Tôi hiểu uống chloroquine phosphate) để điều trị sốt rét không biến chứng Plasmodium vivax cần 28/42 ngày theo dõi điều trị Tôi thông báo nguy mức tối thiểu, kể đau đầu ngón tay Tơi biết rằng, thân tơi khơng lợi tơi khơng tiền lại Người ta cho tên nghiên cứu viên, người mà tơi dễ dàng liên hệ số điện thoại họ cho Tôi biết tơi chọn tham gia khơng tham gia nghiên cứu Tơi biết tơi ngừng lúc muốn………………… (ký) Tôi đọc thông tin (hoặc có người đọc cho tơi) tơi hiểu cả………………….(ký) Tôi hỏi câu hỏi trả lời biết sau tơi hỏi muốn…………… (ký) Tôi hiểu thay đổi nghiên cứu trao đổi với tôi……………(ký) Tôi đồng ý tham gia vào nghiên cứu ……………….(ký) không ý tham gia vào nghiên cứu không ký vào đồng ý dây……….(ký) Chữ ký trẻ (chỉ ký trẻ đồng ý) Họ tên trẻ:……………………………………… Chữ ký trẻ:………………………………… Ngày…….tháng…………năm………… Chữ ký người làm chứng: (Chữ ký người làm chứng điểm trẻ trẻ mù chữ Trường hợp này, người làm chứng đọc phải ký Nếu người phải bệnh nhân chọn phải khơng liên quan tới nhóm nghiên cứu) Tôi chứng kiến đọc đồng ý tự nguyện tham gia cho bệnh nhân Tất câu hỏi bệnh nhân trả lời Tôi khẳng định bệnh nhân đồng ý tự nguyện tham gia vào nghiên cứu Tên người làm chứng: _ Điểm trẻ Chữ ký người làm chứng: _ Ngày: _ Chữ ký người nghiên cứu: Tơi đọc chứng kíến đọc mẫu đồng ý tham gia cho bệnh nhân bệnh nhân có hội để hỏi tất câu hỏi Tôi khẳng định bệnh nhân đồng ý tự nguyện tham gia vào nghiên cứu Tên người nghiên cứu: Chữ ký người nghiên cứu: _ Ngày: Bệnh nhân cấp mẫu đồng ý tham gia nghiên cứu:……………… (chữ ký nghiên cứu viên trợ lý) Phụ lục PHIẾU ĐỒNG Ý THỬ NƯỚC TIỂU XÁC ĐỊNH CĨ THAI Tơi mời tham gia nghiên cứu hiệu lực điều trị thuốc sốt rét Nhóm nghiên cứu u cầu tơi lấy nước tiểu vào ngày ngày thứ 28/42 vào ngày không đồng ý tham gia nghiên cứu, mẫu nước tiểu xét nghiệm để xác định tơi có thai hay khơng Tơi hiểu kết xét nghiệm giữ kín khơng điền tên Tơi hiểu tơi phải tránh có thai thời gian nghiên cứu thuốc tơi uống ảnh hưởng đến thai nhi Tôi thảo luận với bác sĩ biện pháp tránh thai họ yêu cầu sử dụng bao cao su Tôi hiểu xét nghiệm dương tính tơi khơng tham gia nghiên cứu Chữ ký người tham gia: Tôi đồng ý thử: _(chữ ký người tham gia) không đồng ý lấy máu xét nghiệm không ký vào mẫu đồng ý (chữ ký người tham gia) Tên người tham gia Chữ ký người tham gia Ngày (Ngày/tháng/năm) Chữ ký người làm chứng: Chỉ cần chữ ký người làm chứng điểm của tham gia, người tham gia chữ Trong trường hợp người làm chứng biết chữ cần phải ký Nếu có thể, người tham gia chọn người làm chứng khơng liên quan với nhóm nghiên cứu) Tơi xác nhận đọc xác mẫu đồng ý tham gia nghiên cứu cho người tham gia nghiên cứu họ có điều kiện để hỏi kỹ Tôi khẳng định người tham gia tự nguyện tham gia nghiên cứu Tên người làm chứng: Điểm người tham gia: Chữ ký người làm chứng Ngày: Chữ ký người điều tra: Tôi đọc xác /người làm chứng đọc xác mẫu đồng ý tham gia nghiên cứu cho người tham gia nghiên cứu, người tham gia có hội hỏi Tôi xác định người tham gia hoàn toàn tự nguyện Tên người điều tra: Chữ ký người điều tra: Ngày: Một phô tô mẫu đồng ý tham gia nghiên cứu đưa cho người tham gia _ (Chữ ký chủ trì đề tài điều tra viên Phụ lục BẢN MÔ TẢ QUYỀN LỢI VÀ NGHĨA VỤ VỚI ĐỐI TƯỢNG THAM GIA Khi tiến hành nghiên cứu, bệnh nhân đủ điều kiện tiêu chuẩn bác sĩ trưởng nhóm nghiên cứu giải thích kỹ quyền lợi nghĩa vụ bệnh nhân mắc sốt rét tham gia nghiên cứu Bệnh nhân đưa vào nghiên cứu họ tình nguyện cam kết tham gia nghiên cứu Họ khám bệnh, cặp nhiệt độ, lập phiếu theo dõi, lấy lam máu làm xét nghiệm, uống thuốc nghiên cuứ đề (thuốc sốt rét số thuốc bổ trợ khác) theo quy trình đề cương nghiên cứu tất chi phí điều trị (thuốc sốt rét, thuốc điều trị triệu chứng, vitamin, xét nghiệm,…) suốt thời gian nghiên cứu miễn phí Tất bệnh nhân khám bệnh kỹ, bác sĩ trực tiếp cho uống thuốc, theo dõi sát thời gian nghiên cứu, giải thích chu đáo, quyền rút khỏi nghiên cứu lúc họ không muốn hợp tác Đồng thời, ngày lấy lam máu làm xét nghiệm, đếm ký sinh trùng sốt rét, họ bồi dưỡng thù lao đầy đủ Thực tế nhóm nghiên cứu muốn giá trị thù lao cao nữa, kinh phí đề tài hạn hẹp nên nhóm nghiên cứu chưa thể đáp ứng Về phần nghĩa vụ, họ phải đến khám bệnh, uống thuốc làm xét nghiệm theo lịch hẹn mà cán nghiên cứu hướng dẫn, trả lời trung thực câu hỏi mà thầy thuốc cán nghiên cứu hỏi theo dõi tác dụng ngoại ý lâm sàng (nếu có) loại thuốc nghiên cứu ……, ngày … tháng ……năm … Chủ nghiệm đề tài (Đã ký) Phụ lục BẢN CAM KẾT THỰC HIỆN THEO ĐÚNG NGUYÊN TẮC VỀ ĐẠO ĐỨC TRONG NGHIÊN CỨU Chủ nhiệm đề tài người chịu trách nhiệm cao suốt trình thực nghiên cứu trưởng nhóm nghiên cứu có trách nhiệm giải thích rõ ràng đầy đủ vấn đề mà bệnh nhân nghiên cứu hỏi liên quan đến thuốc nghiên cứu, liên quan đến quyền lợi nghĩa vụ họ Tất thành viên nhóm nghiên cứu hiểu thử nghiệm in vivo nghiên cứu đặc biệt, cần phải thận trọng nghiêm túc nghiên cứu trực tiếp người, người bệnh sốt rét Nhóm nghiên cứu trân trọng cảm ơn bệnh nhân sốt rét, người tình nguyện tham gia nghiên cứu khoa học Các thành viên nhóm nghiên cứu ln nêu cao tinh thần phục vụ bệnh nhân nghiên cứu: tận tình, chu đáo, niềm nở, lắng nghe điều than phiền từ phía người bệnh sẵn sàng chia sẻ với họ Trước tiến hành nghiên cứu, trưởng nhóm nghiên cứu phải giải thích kỹ quyền lợi nghĩa vụ bệnh nhân để họ hiểu lựa chọn cách hoàn toàn tự nguyện Điều quan trọng không không ép buộc bệnh nhân phải tham gia vào nghiên cứu khoa học Những bệnh nhân nghiên cứu, hoàn tồn bệnh nhân tình nguyện hợp tác nghiên cứu, nghiên cứu lý mà họ muốn rút khỏi nghiên cứu, nhóm nghiên cứu phải hồn tồn tơn trọng ý nguyện Đối với bệnh nhân bị sốt rét mà không đủ điều kiện để đưa vào nghiên cứu điều trị theo phác đồ quy định Bộ Y tế Nhóm nghiên cứu cam kết thực theo nguyên tắc đạo đức nghiên cứu, theo đề cương nghiên cứu khoa học Hội đồng Đạo đức Nghiên cứu Y sinh học Viện Sốt rét-KST-CT Quy Nhơn duyệt Quy Nhơn, ngày … tháng……năm Chủ nhiệm đề tài (Đã ký) Phụ lục QUY ĐỊNH TỔ CHỨC Y TẾ THẾ GIỚI TRONG NGHIÊN CỨU Đánh giá hiệu điều trị Phân loại hiệu điều trị Phân loại hiệu điều trị dựa đánh giá đáp ứng lâm sàng KST với thuốc theo hướng dẫn TCYTTG (2009) Theo đó, tất bệnh nhân phân loại như: Thất bại điều trị sớm (ETF_Early Treatment Failure), thất bại lâm sàng muộn (LCF_Late Clinical Failure), thất bại ký sinh trùng muộn (LPF_Late Parasitological Failure) Đáp ứng lâm sàng KST đầy đủ (ACPR_Adequate Clinical and Parasitological Response) Sạch KST mục tiêu điều trị, bệnh nhân thất bại điều trị thay loại khỏi nghiên cứu Độ an toàn Tần suất tác dụng ngoại ý ghi nhận Tất bệnh nhân hỏi thường xuyên triệu chứng cũ xuất từ đến khám q trình theo dõi Khi có triệu chứng lâm sàng xuất hiện, bệnh nhân đánh giá xử trí kịp thời Tất tác dụng ngoại ý ghi lại CRFs Các tác dụng ngoại nghiêm trọng phải ghi nhận báo cáo Đánh giá lâm sàng Đánh giá lâm sàng thực tất đối tượng thực khám thực thể: quy trình khám thực thể chuẩn thực vào thời điểm bắt đầu nghiên cứu (Do) vào ngày D1, 2, 3, 7, 14, 21, 28 Một bệnh sử, thông số nhân chủng học, địa liên hệ đầy đủ ghi lại chi tiết CRFs Đo thân nhiệt Đo nhiệt độ nách thực vào thời điểm bắt đầu nghiên cứu (D0) vào ngày từ D1, 2, 3, 7, 14, 21, 28 Nhiệt độ đo nhiệt kế có độ xác 0.1°C.Nếu kết đo < 36.0°C, phải đo lặp lại Xét nghiệm soi kính hiển vi Xét nghiệm lam máu giọt dày mỏng, đếm KSTSR để sàng lọc vào ngày D0 xác định tiêu chuẩn chọn bệnh tiêu chuẩn loại trừ Lam giọt dày kiểm tra vào ngày từ D2, 3, 7, 14, 21 D28 ngày khác BN quay trở lại tự phát nên đánh giá lại KSTSR Những lam máu đánh dấu, dán nhãn cẩn thận theo quy đinh trước (số sàng lọc, số nghiên cứu, ngày theo dõi lấy máu,…) Dung dịch nhuộm pha lỗng chuẩn bị ngày lần tùy thuộc vào số lam máu làm Lam giọt mỏng dày nhuộm giêm sa soi KHV độ phóng đại 1000 lần để xác định chủng loại KSTSR xác định mật độ MĐKSTSR Ba lam máu (2 lam giọt dày lam giọt mỏng) cho bệnh nhân, lam nhuộm nhanh (giêm sa 10% 10–15 phút) sàng lọc ban đầu, lam khác nhuộm bình thường Vì đủ tiêu chuẩn chọn vào nghiên cứu, nhuộm lam thứ cẩn thận (nồng độ giêm sa 2.5-3.0% 45-60 phút) Phương pháp nhuộm chậm sử dụng cho lam máu khác suốt trình theo dõi Lam máu giọt dày cho sàng lọc ban đầu kiểm tra đếm thể vơ tính so với số bạch cầu (BC) đếm số vi trường MĐKSTSR đủ tiêu chuẩn đưa vào KST so với BC, khoảng 200 thể vơ tính/ µl (đối với vùng lan truyền cao); KST cho BC, tương ứng xấp xỉ 1.000 thể vơ tính/µl (đối với vùng lan truyền bệnh thấp vừa) Lam máu thứ dùng để đếm MĐKSTSR cho tất bệnh nhân Các lam máu lấy suốt thời gian theo dõi BN với quy định MĐKST tính cách đếm số lượng thể vơ tính so với số lượng bạch cầu - điển hình 200 300 lam giọt dày, sử dụng bàn đếm tay Nếu 500 KST đếm trước đến số 200 bạch cầu, trình đếm dừng lại sau đọc vi trường cuối MĐKSTSR diễn tả số lượng thể vơ tính µl máu tính cách chia số thể vơ tính cho số BC đếm nhân với mật độ BC (cụ thể 6.000 BC/µl) MĐKSTSR/µl = Số lượng KSTSR đếm x 6.000 Số lượng BC đếm Hoặc kỹ thuật giống ứng dụng thiết lập đếm KSTSR lam máu KSTSR máu tính cách đếm thể vơ tính so với số BC lam giọt dày, số thể vơ tính 10 200 bạch cầu lam theo dõi, đếm 500 bạch cầu (chẳng hạn, hoàn thành số vi trường với 500 bạch cầu) Một lam máu xem (-) soi đủ 1000 BC mà không thấy KST Sự xuất giao bào lam trình theo dõi phải ghi chú, thông tin không góp phần vào đánh giá thử nghiệm Ngồi ra, 100 vi trường lam giọt dày thứ kiểm tra loại trừ nhiễm phối hợp có Trong trường hợp nghi ngờ, lam giọt mỏng kiểm tra để xác định lại; kiểm tra lam giọt mỏng không xác định được, BN bị loại khỏi nghiên cứu sau hồn tất q trình điều trị Hai XNV chuyên KHV soi độc lập tất lam máu đếm MĐKSTSR số trung bình hai người Các lam máu có kết không tương ứng (khác hai XNV chủng loại KSTSR khác MĐKSTSR 50% khác có mặt KSTSR) xét nghiệm lại lần thứ XNV độc lập MĐKSTSR tính số trung bình hai người có giá trị gần tương đương Phân tích gen học KSTSR kháng thuốc Có thể thực không vùng sốt rét lan truyền từ thấp đến trung bình bắt buộc phải thực vùng lan truyền cao để phân biệt tái phát (cùng dòng KSTSR) tái nhiễm (khác dòng KSTSR), phân tích kiểu gen dựa đa dạng di truyền Tỷ lệ tính khơng đồng kiểu gen xác định PCR-RFLP với đoạn lặp lại circumsporozoite protein (Pvcsp) Các DNA tách chiết máu tồn phần Trước phân tích gen, mẫu máu phải soi KHV có P vivax (+) làm nested PCR Để hạn chế phiền hà đến BN lấy máu lại, nên lấy 2-3 giọt máu vào giấy thấm Whatmann BN theo quy trình sàng lọc thời điểm thất bại lấy lam máu theo đề cương sau D7 Các mẫu giấy thấm đánh mã, bảo quản hộp nhựa cá nhân túi bóng có khóa với chất chống ẩm, tránh ánh sáng, độ ẩm nhiệt độ cao, giữ nhiệt độ thường thực địa 4-80C phịng thí nghiệm tách chiết DNA Kỹ thuật PCR làm để so sánh cặp mẫu giấy thấm để tách chiết DNA KSTSR phân tích kiểu gen ca thất bại điều trị Những mẫu mã hóa trước giải trình tự để nhân viên la bô không cần quan tâm đến hiệu lâm sàng Thử xem bệnh nhân có mang thai không: Những phụ nữ độ tuổi mang thai thử nước tiểu xem có thai hay không trước chọn đưa vào nghiên cứu Kiểm tra chất lượng thuốc nghiên cứu Thuốc sử dụng đánh giá hiệu lực phải đạt chất lượng Ở đây, thuốc lấy từ nguồn Chương trình quốc gia PCSR đạt tiêu chuẩn thực hành sản xuất thuốc tốt Đánh giá độ an toàn thuốc Độ an toàn thuốc thu thập ghi nhận cách tự nhiên tần số xuất tác dụng ngoại tác dụng ngoại ý nghiêm trọng Dấu hiệu đánh giá thông qua bảng câu hỏi Tất triệu chứng, hội chứng bệnh gây liên quan đến thuốc không liên quan đến thuốc phải ghi nhận Tác dụng ngoại ý nghiêm trọng xác định xảy liều dẫn đến tử vong, đe dọa mạng sống, đòi phải nhập viện Phụ lục QUY TRÌNH THỰC HIỆN TRONG ĐÁNH GIÁ NGHIÊN CỨU Quy trình sàng lọc chọn bệnh nhân đủ tiêu chuẩn Tất bệnh nhân đủ tiêu chuẩn vào nghiên cứu, có mặt triệu chứng sốt rét mà sốt rét ác tính, khơng có suy dinh dưỡng, khơng mang thai,….trong suốt trình sàng lọc liên tục đánh giá kỹ bác sĩ lâm sàng Theo dõi đặc biệt cần có để phát dấu hiệu sớm bệnh lý có sốt khác sốt rét loại trừ khỏi nghiên cứu Trong số nhóm trẻ em, tình trạng gây nhiễu hay gặp viêm đường hơ hấp dưới: ho, khó thở, thở nhanh điểm để phát loại trừ (thở nhanh tần số thở > 50 lần /phút trẻ nhỏ 12 tháng > 40 lần/ phút trẻ từ 12–59 tháng tuổi Các tình trạng khác liên quan đến sốt viêm tai giữa, viêm hầu họng, áp xe Các bệnh nhân không đưa vào tiêu chuẩn mà phải điều trị sốt rét bệnh nhiễm khuẩn khác đồng thời có KSTSR máu Quy trình theo dõi bệnh nhân Những bệnh nhân đủ tiêu chuẩn đưa vào nghiên cứu cho mã số riêng nhận điều trị sau giải thích đầy đủ nghiên cứu cam kết Bất kỳ đối tượng định không tham gia nghiên cứu khám điều trị sốt rét thường quy hướng dẫn Bộ Y tế Lịch trình theo dõi BN chuẩn bị sẵn có thẻ hẹn rõ ràng giải thích cho bệnh nhân Ngày BN bắt đầu đưa vào nghiên cứu cho uống thuốc liều gọi ngày D0 Tất điều trị sốt rét phải thành viên nhóm nghiên cứu cho uống giám sát vịng 30 phút sau điều trị để đảm bảo thuốc thuốc không bị nôn Nếu BN nơn thuốc vịng 30 phút sau điều trị, cho lại liều tương tự Điều trị bổ sung thuốc khác hạ sốt nên ghi nhận vào CRFs Nếu BN nôn bị loại khỏi nghiên cứu hỗ trợ nhân viên chăm sóc y tế Tiếp đó, lịch trình theo dõi đánh giá lại số lâm sàng KST tiến hành vào ngày D1, 2, D7, tuần theo dõi trở lại vào D14, 21 D28 Các BN khuyên nên quay trở lại gặp đoàn nghiên cứu vào ngày trình theo dõi có triệu chứng khác thường xảy mà không cần đợi đến lịch Đánh giá lâm sàng đầy đủ nhằm theo dõi độ an toàn đánh giá khơng thất bại điều trị mà cịn ghi nhận phản ứng ngoại ý tiềm tàng xảy thuốc Ngoài ra, lam máu lấy để đánh giá KSTSR CBYT để nhà lâm sàng xem xét độ an toàn thuốc Vì nhiều thuốc địi hỏi uống nhiều liều ngày, nên thăm khám ban đầu cần thiết khơng đánh giá hiệu lực mà cịn đánh giá độ an toàn, bỏ giai đoạn khơng tn thủ đủ liệu trình điều trị có nguy nguy hiểm lâm sàng Nên giai đoạn thật cố gắng để hoàn thành điều trị Trong BN khuyến khích quay trở lại theo lịch hẹn họ, phải đến khám lấy lam máu nhà họ khơng đến Liệu trình điều trị lịch theo dõi cho đề cương phải chặt chẽ để đảm bảo số liệu xác Những BN lỡ khơng theo dõi D1, D2 lỡ không uống liều điều trị rút khỏi nghiên cứu Sau D3, BN thất bại D7 quay lại theo dõi tiếp vào D8 (cũng vào D14/15, D21/22 D28/29) quy vào nhóm nghiên cứu Sự khác biệt đề cương ngày không cho phép độ an tồn BN tính xác số liệu khơng cịn Quản lý số liệu Trưởng nhóm nghiên cứu đảm bảo đề cương chặt chẽ, liệu thu thập ghi lại CRFs Dữ liệu lâm sàng KSTSR ghi lại hàng ngày vào CRFs thiết kế sẵn Dữ liệu thu từ nguồn tài liệu để giải thích bàn luận Bất kỳ thay đổi sửa chữa liên quan đến CRFs nên ghi ngày giải thích khơng nên làm khó hiểu tối nghĩa nguyên nơi liệu đưa vào Tất CRF phải kiểm tra hoàn chỉnh Sau nghiên cứu hoàn thành, số liệu đưa vào liệu dùng mẫu nhập liệu độc lập Số liệu bảo quản liệu máy tính cách cẩn trọng Trưởng nhóm nghiên cứu chịu trách nhiệm lưu giữ mẫu sàng lọc, CRF tài liệu liên quan Các phương pháp thống kê học 5.1 Cỡ mẫu tối thiểu Nếu tỷ lệ thất bại thuốc sốt rét vùng khơng biết, 20% chọn để ước tính tỷ lệ thất bại điều trị Mức tin cậy 95% độ xác dao động (d) khoảng 10%, cỡ mẫu 61 bệnh nhân cần đưa vào nghiên cứu Nếu tăng 20% cho phép hoặt rút khỏi theo dõi suốt trình nghiên cứu 28 ngày, cần cỡ mẫu 73 BN 5.2 Tính tốn cỡ mẫu tối thiểu Trong cấu KSTSR điểm nghiên cứu, phần lớn P falciparum chiếm ưu thế, tỷ lệ P vivax thấp, đồng thời điểm nghiên cứu chưa thấy báo cáo P vivax kháng với CQ Do đó, chọn tỷ lệ thất bại điều trị thuốc CQ điểm nghiên cứu khoảng 10% hay tỷ lệ thất bại lâm sàng quần thể ước tính (p) 10%, với khoảng tin cậy 95%, độ xác (d) 10% Khi cỡ mẫu tối thiểu cần đánh giá hiệu lực là: 35 bệnh nhân Cỡ mẫu tối thiểu dựa tỷ lệ thất bại lâm sàng quần thể Tỷ lệ ước tính quần thể (p), độ tin cậy (CI) 95% d (%) 0.05 0.10 0.15 0.20 0.25 0.30 0.35 0.40 0.45 0.50 0.05 73 138 196 246 288 323 350 369 380 384 0.10 18 35 49 61 72 81 87 92 95 96 Cỡ mẫu phải điều chỉnh để theo dõi số rút khỏi nghiên cứu mẫu (ước tính 20% nghiên cứu theo dõi 28 ngày) Phân tích số liệu Số liệu thu thập đựợc tổng hợp phân tích theo bảng cập nhật Excel phiên 7.1 Pascal Ringwald (WHO, 2017) Số liệu phân tích theo hai phương pháp: phân tích đề cương, sau loại trừ số BN rút khỏi nghiên cứu phân tích số BN theo dõi đủ liệu trình phân tích Nested-PCR/ PCR cho kết thất bại tái nhiễm với P falciparum loại Phân tích cuối bao gồm: ▪ Mơ tả tất bệnh nhân sàng lọc phân bố lý khơng tham gia NC được; ▪ Mô tả tất bệnh nhân tham gia vào nghiên cứu; ▪ Tỷ lệ phần trăm tác dụng ngoại ý dấu chứng, triệu chứng nghiêm trọng tất bệnh nhân bao gồm nghiên cứu; ▪ Tỷ lệ phần trăm tất bệnh nhân trình theo dõi rút khỏi nghiên cứu với CI 95% liệt kê lý loại ra; ▪ Tỷ lệ phần trăm ETF, LCF, LPF ACPR vào ngày D28 với khoảng tin cậy 95% sử dụng hai phương pháp phân tích Dự kiến hoạt động phối hợp để chuyển giao kết Nhóm nghiên cứu Viện Sốt rét-KST-CT Quy Nhơn, cán nghiên cứu Trung tâm CDC tỉnh Kết thúc nghiên cứu, NCV báo cáo chia sẻ cho Trung tâm CDC tỉnh để thiết lập phân bố sốt rét kháng thuốc địa bàn phụ trách, chuyển giao cho CTQGPCSR Việt Nam Bộ Y tế để xây dựng kế hoạch đạo điều trị sốt rét P vivax vùng kháng thuốc khác Phụ lục KHÁM VÀ ĐÁNH GIÁ ĐỘ LÁCH SƯNG THEO HACKETT (WHO, 1963) Khám lâm sàng phân độ lách sưng đây: + Lách số 0: Khơng thể sờ chạm được, hít sâu vào; + Lách số 1: Có thể sờ chạm hít vào, khơng q bờ sườn; + Lách số 2: Sờ chạm thở bình thường, bờ sườn đường rốn; + Lách số 3: Sờ chạm ngang rốn; + Lách số 4: Sờ chạm rốn; + Lách số 5: Sờ chạm lách xuống gần xương mu Phụ lục 10 HƯỚNG DẪN PHÂN TÍCH KẾT QUẢ THỬ NGHIỆM (Phân tích sau hiệu chỉnh PCR) Ngày chấm dứt đến thời điểm X (X = 28 hay 42 ngày) Đáp ứng đầy đủ LS KST Kết sau hiệu chỉnh PCR Tần suất thành công/ Tỷ lệ thất bại (Kaplan-Meier) (phân tích protocol) Thành cơng Thành công Thất bại điều trị sớm Thất bại Thất bại Thất bại LS muộn trước ngày Thất bại Thất bại Tái phát P falciparum Thất bại Thất bại Tái nhiễm P falciparum Loại khỏi phân tích Loại khỏi phân tích Thất bại Thất bại Ngày xác định tái nhiễm Loại khỏi phân tích Ngày xác định bị nhiễm Loại khỏi phân tích vào ngày X Thất bại LS muộn thất bại KST muộn vào sau ngày Nhiễm phối hợp với tái phát P falciparum Nhiễm phối hợp với tái nhiễm P falciparum Nhiễm loại KSTSR khác (P.v, P.m, P.o, P.k) Ngày xác định cuối Không tiếp tục theo dõi theo dõi tùy thuộc vào Loại khỏi phân tích lịch Ngày xác định cuối Loại khỏi nghiên cứu vi phạm đề cương nghiên cứu theo dõi tùy thuộc vào lịch trước loại khỏi nghiên cứu vi phạm đề cương nghiên cứu Loại khỏi phân tích Phụ lục 11 Khía cạnh đạo đức nghiên cứu 11.1 Sự chấp thuận Hội đồng Đạo đức Y sinh - Đề tài thông qua Hội đồng Đạo đức Y sinh Viện Sốt rét-KST-CT Quy Nhơn Hội đồng phê duyệt đề cương luận văn Đại học Quy Nhơn; - Thử nghiệm hiệu lực phác đồ điều trị tiến hành giám sát trực tiếp cán chun mơn Tất thời điểm, tính an tồn bồi hồn phải ln đảm bảo quản lý bệnh nhân ưu tiên cho thử nghiệm; - Bất kỳ thay đổi phải xin ý kiến chấp thuận Hội đồng Đạo đức Hội đồng khoa học trước thực thay đổi nghiên cứu; - Nghiên cứu viên có trách nhiệm tuân theo đánh giá Hội đồng y đức trình thực nghiên cứu xem thích hợp 11.2 Thực với Thực hành lâm sàng tốt - Nghiên cứu phải thực theo hướng dẫn Hội nghị hòa hợp tiêu chuẩn quốc tế/ Thực hành lâm sàng tốt ICH/GCPs (International Conference on Harmonisation/ Good Clinical Practices) thử nghiệm lâm sàng quy định Hội đồng Đạo đức y sinh học; - Các nghiên cứu viên tham gia thử nghiệm phải qua tham dự khóa tập huấn thực hành lâm sàng tốt (GCPs) Bộ Y tế, The Global Health Network tập huấn online cấp chứng chỉ; - Tất quy định địa phương cần phải tuân thủ, quy chế có ảnh hưởng lớn an toàn đối tượng tham gia 11.3 Cam kết tham gia nghiên cứu thông qua ký chấp thuận - BN người nhà đồng ý ký vào mẫu đơn chấp thuận theo phụ lục sau nhờ người chuyển dịch ngơn ngữ địa phương (do cán y tế địa phương phiên dịch) đọc cho BN thân nhân nghe trước tham gia nghiên cứu; - Các câu hỏi BN thân nhân phải nhóm nghiên cứu trả lời rõ ràng, cụ thể Nghiên cứu viên phải ghi nhận tất đồng ý trẻ em kèm theo chấp thuận người giám hộ cha mẹ; - Giải thích lợi ích, quyền lợi nguy xảy sau uống thuốc; - Việc xét nghiệm cho đối tượng độ tuổi sinh sản cần đồng ý BN Viết cam kết với BN thân nhân Nếu đối tượng nghiên cứu khơng biết chữ nhờ người địa phương nhân viên y tế làm chứng 11.4 Bảo mật thông tin số liệu nghiên cứu - Tất thông tin liên quan đến BN nghiên cứu bảo mật chia sẻ với thành viên nhóm nghiên cứu; - Trưởng nhóm nghiên cứu đảm bảo cất giữ tài liệu nguồn, hồ sơ giấy tờ liên quan, bệnh án sản phẩm nghiên cứu (lam, giấy thấm) giữ cẩn trọng 11.5 Dịch vụ chăm sóc y tế - Chăm sóc y tế hồn tồn miễn phí bệnh SR suốt trình nghiên cứu theo dõi BN, theo dõi tác dụng ngoại ý để nhập viện xử trí kịp thời; - Mọi bồi hồn phải thực khả nhóm nghiên cứu Nếu có vấn đề y tế khác khơng liên quan sốt rét, nghiên cứu viên có trách nhiệm chuyển cho bệnh nhân điều trị khả tốt nhất; - Nếu lý đó, bệnh nhân rút khỏi nghiên cứu vi phạm đề cương trước kết thúc nghiên cứu, nghiên cứu viên cần phải cho đủ liệu trình thuốc sốt rét theo hướng dẫn Bộ Y tế 2020 Phụ lục 12 MỘT SỐ HÌNH ẢNH THAM GIA NGHIÊN CỨU TẠI THỰC ĐỊA & VIỆN SỐT RÉT-KÝ SINH TRÙNG-CƠN TRÙNG QUY NHƠN Hình Địa điểm nghiên cứu Gia Lai Hình Nhà rẫy bệnh nhân sát bìa rừng Hình Cấu trúc chất liệu nhà dân Hình Tham gia làm lam máu nghiên cứu Hình Làm khơ lam máu thời tiết mưa Hình Lấy máu sàng lọc bệnh nhân nghi ẩm Gia Lai ngờ sốt rét Gia Lai Phụ lục 13 BẢNG KIỂM THEO MỤC LIÊN QUAN TRONG BỆNH ÁN ĐIỀU TRỊ Mã số: Tài liệu Hoàn chỉnh đầy đủ chấp thuận Tiêu chuẩn chọn bệnh hoàn tất Thử xem có thai hồn tất Liệu trình cho thuốc hoàn tất Đánh giá dung nạp thuốc hoàn tất Đánh giá nhiệt độ hoàn tất Đánh giá KSTSR hoàn tất Lấy mẫu phân tích PCR/ HPLC Có Khơng Ký ghi rõ họ tên trưởng nhóm nghiên cứu ... chloroquine phosphate số điểm phân tử tiềm liên quan kháng thuốc tỉnh Gia Lai? ?? Mục tiêu nghiên cứu - Đánh giá diễn tiến làm ký sinh trùng Plasmodium vivax sau điều trị phác đồ chloroquine phosphate điểm. .. gian nghiên cứu 47 Bảng 3.9 Diễn tiến làm tải lượng ký sinh trùng P vivax theo thời gian 47 Bảng 3.10 Chỉ điểm phân tử tiềm liên quan kháng thuốc P vivax 48 Bảng 3.101 Tình trạng phân lập P vivax. .. P vivax phân lập KST P vivax để phân tích phân tử tìm điểm tiềm kháng thuốc; - Phạm vi nghiên cứu đánh giá hiệu lực thuốc chloroquine phân tích tìm điểm phân tử liên quan kháng thuốc sốt rét