KHẢO SÁT QUY, TRÌNH THU NHẬN NACETYLDGLUCOSAMINE TỪ VỎ ĐẦU TÔM

Luận văn tốt nghiệp GVHD: Bùi Anh Võ LỜI CẢM ƠN Em xin chân thành cảm ơn quý thầy, cô tận tình dạy dỗ truyền đạt kiến thức cho em suốt năm em ngồi ghế nhà trường Xin cảm ơn ban giám hiệu thầy cô phụ trách Khoa Khoa học Ứng dụng tổ chức tạo điều kiện để em thực đề tài nghiên cứu Xin cảm ơn quý thầy phụ trách phịng thí nghiệm tạo điều kiện thuận lợi cho em thực nghiên cứu Đặc biệt em xin cảm ơn thầy Bùi Anh Võ, người tận tình hướng dẫn bảo em suốt thời gian thực đề tài Một lần xin gửi đến quý thầy cô lời tri ân sâu sắc, chúc quý thầy cô sức khỏe thành cơng đường giảng dạy Xin chân thành cảm ơn! TpHCM, ngày 10 tháng 02 năm 2011 Sinh viên thực Nguyễn Văn Huẩn SVTH: Nguyễn Văn Huẩn i Luận văn tốt nghiệp GVHD: Bùi Anh Võ TĨM TẮT NGUYỄN VĂN HUẨN, Đại Học Tơn Đức Thắng Tháng 10/2010 “KHẢO SÁT QUY TRÌNH THU NHẬN N-ACETYL-D-GLUCOSAMINE TỪ VỎ ĐẦU TÔM” GVHD: Th.S BÙI ANH VÕ Ở nước ta chế biến thủy sản đóng vai trị quan trọng kinh tế đất nước, đặc biệt chế biến tôm Tuy nhiên lượng phế thải từ ngành chế biến gây nhiều quan ngại cho vấn đề môi trường Xuất phát từ mong mỏi chung tay tìm phương pháp giải nguồn phế liệu này, tiến hành nghiên cứu phân hủy vỏ tôm enzyme chitinase từ nấm Trichoderma hazianum để thu nhận N-acetyl-D-glucosamine nhằm giải vấn đề môi trường tạo giá trị cao cho nguồn phế liệu vỏ đầu tôm Những nghiên cứu kết quả: - Khảo sát yếu tố pH, nồng độ chitin cảm ứng thời gian sinh tổng hợp enzyme chitinase Kết cho thấy với mơi trường có nồng độ chitin cảm ứng 1,0%; pH 5,5 ủ khoảng thời gian 120 cho hoạt tính enzyme cao nhất: 5,77 UI/ml - Khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến trình phân hủy vỏ tơm enzyme chitinase cách ủ, pH, thời gian phân hủy, cách xử lý vỏ tôm Qua khảo sát cho thấy tiến hành ủ vỏ tơm với dịch lọc chứa enzyme có tính khả thi cách ủ trực tiếp không thông qua lọc loại bỏ hệ sợi nấm, giá trị pH thuận lợi cho trình phân hủy 6,0 thời gian ủ phù hợp 48h Vỏ tôm cần sơ chế sử dụng để phân hủy cho hiệu suất thu hồi N-acetyl-D-glucosamine khoảng 46,1% Qua khảo sát cho thấy việc sử dụng enzyme chitinase phân hủy vỏ đầu tơm thu nhận N-acetyl-D-glucosamine có tính khả thi cao nghiên cứu sâu để đưa vào ứng dụng thực tế SVTH: Nguyễn Văn Huẩn ii Luận văn tốt nghiệp GVHD: Bùi Anh Võ MỤC LỤC Trang Lời cảm ơn i Tóm tắt ii Mục lục iii Danh sách chữ viết tắt vii Danh sách bảng .viii Danh sách hình ix CHƯƠNG 1: ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN 2.1 Thực trạng phế liệu tôm chế biến hướng xử lý 2.1.1 Thực trạng phế liệu từ ngành chế biến tôm 2.1.2 Hướng xử lý vỏ đầu tôm số sản phẩm 2.1.2.1 Sản xuất chitin 2.1.2.2 Sản xuất Chitosan 2.1.2.3 Muối tôm 2.1.2.4 Mắm tôm 2.1.2.5 Bột Chitofood 2.1.2.6 Bột đầu tôm 2.2 Cấu trúc hóa học, tính chất lý hóa N-acetyl-D- glucosamine 2.2.1.Cấu trúc hóa học, tính chất lý hóa 2.2.2 Một số muối glucosamine khác 2.2.2.1 Glucosamin hydroclorua 2.2.2.2 Glucosamin sulfat 2.2.3 Dược lý dược động học N-Acetyl-D- Glucosamine số muối Glucosamine 10 2.2.4 Chitin, polymer N-acetyl-D-glucosamine 12 SVTH: Nguyễn Văn Huẩn iii Luận văn tốt nghiệp GVHD: Bùi Anh Võ 2.2.4.1 Phân bố 12 2.2.4.2 Cấu trúc hoá học chitin 13 2.2.4.3 Tính chất lý hóa chitin 13 2.3 Enzyme chitinase thủy phân chitin tạo N-acetyl-D-glucosamine 14 2.3.1 Khái niệm 14 2.3.2 Phân loại chitinase 15 2.3.3 Phương pháp sản xuất chitinase 15 2.3.4 Chức phân hủy chitin tạo N-acetyl-D-glucosamine chitinase 16 2.3.5 Ứng dụng chitinase 16 2.3.5.1 Kiểm soát sâu hại 16 2.3.5.2 Bảo vệ chuyển gen trồng 17 2.3.5.3 Kiểm soát muỗi 17 2.4 Nấm Trichoderma nguồn sản xuất enzyme chitinase 17 2.4.1 Vị trí phân loại 17 2.4.2 Đặc điểm hình thái 18 2.4.3 Cấu tạo tế bào, sinh trưởng hình thành bào tử Trichoderma…… 19 2.4.3.1 Cấu tạo tế bào 19 2.4.3.2 Sự sinh trưởng 19 2.4.3.3 Sự hình thành bào tử mơi trường 20 2.4.4 Đặc điểm sinh thái sinh hóa 20 2.4.5 Khái quát chung nấm Trichoderma hazianum 21 2.4.5.1 Phân loại 21 2.4.5.2 Đặc điểm sinh lí, sinh hóa sinh thái 21 2.4.5.3 Các ứng dụng 22 CHƯƠNG VẬT LIỆU- PHƯƠNG PHÁP 3.1 Vật liệu 23 3.1.1 Nguyên liệu 23 3.1.2 Thiết bị- dụng cụ 23 3.1.3 Hóa chất 23 SVTH: Nguyễn Văn Huẩn iv Luận văn tốt nghiệp GVHD: Bùi Anh Võ 3.1.4 Mơi trường thí nghiệm 24 3.2 Nôi dung nghiên cứu 24 3.3 Phương pháp 25 3.3.1 Quy trình nghiên cứu điều chế N-acetyl-D-glucosamine từ vỏ đầu tôm 25 3.3.2 Phương pháp nuôi cấy nhân giống chủng Trichoderma hazianum 26 3.3.3 Nuôi cấy tạo chitinase thu nhận N-acetyl-D-glucosamine 27 3.3.3.1 Sinh tổng hợp enzyme chitinase 27 3.3.3.2 Khảo sát ảnh hưởng hàm lượng chitin đến tổng hợp chitinase 27 3.3.3.3 Khảo sát ảnh hưởng yếu tố pH đến sinh tổng hợp chitinase 28 3.3.3.4 Khảo sát ảnh hưởng yếu tố thời gian đến sinh tổng hợp chitinase 29 3.3.3.5 Khảo sát khả phân hủy chitin thô tạo N-acetyl-D-glucosamine cách ủ 29 3.3.3.6 Khảo sát ảnh hưởng pH đến khả phân hủy vỏ đầu tôm enzyme chitinase 30 3.3.3.7.Khảo sát ảnh hưởng thời gian ủ đến khả tạo N-acetyl-D-glucosamine 30 3.3.3.8 Khảo sát ảnh hưởng việc xử lý vỏ đầu tôm đến khả phân hủy tạo N-acetyl-D-glucosamine 31 3.3.4 Phương pháp xác định hàm lượng đường N-acetyl-D-glucosamine theo Elson-Morgan 31 3.3.5 Phương pháp xác định hoạt độ enzyme chitinase 32 3.3.6 Phương pháp xử lý vỏ đầu tôm 33 3.3.7 Phương pháp kiểm tra số lượng nấm Trichoderma hazianum 33 3.3.8 Tính hiệu suất thu hồi 36 CHƯƠNG KẾT QUẢ - THẢO LUẬN 4.1 Kết khảo sát ảnh hưởng hàm lượng chitin đến tổng hợp chitinas 37 4.2 Kết khảo sát ảnh hưởng yếu tố pH đến sinh tổng hợp chitinase 38 4.3 Kết khảo sát ảnh hưởng yếu tố thời gian đến sinh tổng hợp chitinas 39 4.4 Kết phương pháp ủ 41 SVTH: Nguyễn Văn Huẩn v Luận văn tốt nghiệp GVHD: Bùi Anh Võ 4.5 Kết khảo sát ảnh hưởng pH đến khả phân hủy vỏ đầu tôm enzyme chitinase 42 4.6 Kết khảo sát ảnh hưởng thời gian ủ đến khả tạo N-acetyl-D-glucosamine 43 4.7 Kết khảo sát ảnh hưởng việc xử lý vỏ đầu tôm đến khả phân hủy tạo N-acetyl-D-glucosamine 44 CHƯƠNG KẾT LUẬN - KIẾN NGHỊ 5.1 Kết luận 47 5.2 Kiến nghị 47 TÀI LIỆU THAM KHẢO 48 PHỤ LỤC 50 SVTH: Nguyễn Văn Huẩn vi Luận văn tốt nghiệp GVHD: Bùi Anh Võ DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT T.hazianum Trichoderma hazianum T.virens Trichoderma virens T.koningii Trichoderma koningii T.hamatum Trichoderma hamatum T longibacchiatum Trichoderma longibacchiatum T citrinovuride Trichoderma citrinovuride DMAB p-dimethylaminobenzaldehyde PGA Potato-Glucose-Agar SVTH: Nguyễn Văn Huẩn vii Luận văn tốt nghiệp GVHD: Bùi Anh Võ DANH SÁCH CÁC BẢNG Trang Bảng 2.1 Thành phần hóa học vỏ tơm Bảng 2.2 Một vài tính chất quan trọng chitin chitosan thương phẩm Bảng 2.3 Thành phần chitin số phế liệu thủy sản 12 Bảng 3.1 Thành phần môi trường TEL 24 Bảng 3.2 Khảo sát ảnh hưởng hàm lượng chitin đến sinh tổng hợp chitinase 28 Bảng 3.3 Khảo sát ảnh hưởng yếu tố pH đến sinh tổng hợp chitinase 28 Bảng 3.4 Khảo sát ảnh hưởng yếu tố thời gian đến sinh tổng hợp chitinase 29 Bảng 3.5 Khảo sát ảnh hưởng pH đến khả phân hủy vỏ đầu tôm enzyme chitinase 30 Bảng 3.6 Khảo sát ảnh hưởng thời gian ủ đến khả tạo N-acetyl-D-glucosamine 31 Bảng 4.1 Kết khảo sát ảnh hưởng hàm lượng chitin đến tổng hợp chitinase 37 Bảng 4.2 Kết khảo sát ảnh hưởng yếu tố pH đến sinh tổng hợp chitinase 38 Bảng 4.3 Kết khảo sát ảnh hưởng yếu tố thời gian đến sinh tổng hợp chitinase 39 Bảng 4.4 Kết phương pháp ủ 41 Bảng 4.5 Kết hảo sát ảnh hưởng pH đến khả phân hủy vỏ đầu tôm enzyme chitinase 42 Bảng 4.6 Kết khảo sát ảnh hưởng thời gian ủ đến khả tạo N-acetyl-D-glucosamine 43 Bảng 4.7 Kết khảo sát ảnh hưởng việc xử lý vỏ đầu tôm đến khả phân hủy tạo N-acetyl-D-glucosamine 44 SVTH: Nguyễn Văn Huẩn viii Luận văn tốt nghiệp GVHD: Bùi Anh Võ DANH SÁCH CÁC HÌNH Trang Biểu đồ 4.1 Hoạt tính chitinase theo nồng độ chitin 37 Biểu đồ 4.2 Hoạt tính chitinase theo giá trị pH 38 Biểu đồ 4.3 Hoạt tính chitinase theo thời gian 39 Biểu đồ 4.4 Biểu đồ kết phương pháp ủ 41 Biểu đồ 4.5 Ảnh hưởng pH đến khả phân hủy vỏ đầu tôm enzyme chitinase 42 Biểu đồ 4.6 Ảnh hưởng thời gian ủ đến khả tạo N-acetyl-D-glucosamine 43 Biểu đồ 4.7 Ảnh hưởng việc xử lý vỏ đầu tôm đến khả phân hủy tạo N-acetyl-D-glucosamine 45 Sơ đồ 2.1 Quy trình sản xuất chitin Sơ đồ 2.2 Quy trình sản xuất chitosan trường Đại học Thủy Sản Nha Trang Sơ đồ 3.1 Sơ đồ quy trình nghiên cứu điều chế N-Acetyl-D-glucosamine từ vỏ đầu tôm 25 Sơ đồ 4.1 Quy trình thu nhận N-acetyl-D-glucosamine 46 Hình 2.1 Vỏ đầu tơm Hình 2.2 Bệnh đau cột sống 10 Hình 2.3 Khớp nối 10 Hình 2.4 Enzyme chitinase 14 Hình 2.5 Nấm Trichoderma 21 Hình 3.1 Vỏ tôm xay 23 SVTH: Nguyễn Văn Huẩn ix Luận văn tốt nghiệp GVHD: Bùi Anh Võ CHƯƠNG ĐẶT VẤN ĐỀ Hiện nay, mặt hàng thủy sản đóng vai trị quan trọng tổng kim ngạch xuất nước, đáng ý sản phẩm chế biến từ tôm Hàng năm sản lượng tôm chế biến xuất khoảng 195,000 tấn, có khoảng 117,000 phế liệu Vì thế, để giải nguồn phế liệu khổng lồ quan trọng Nếu giải tốt vấn đề trên, khơng giúp gìn giữ bảo vệ mơi trường mà cịn góp phần tạo giá trị kinh tế từ nguồn phế liệu Tuy nhiên, không quan tâm mức gây ảnh hưởng lớn đến môi trường hoạt động sản xuất lâu dài người dân Điều thực tế chứng minh ô nhiễm nguồn nước trầm trọng khu vực chế biến tôm, tiếp tục chúng lan truyền gây ảnh hưởng lớn đến đời sống người dân Mặc dù năm gần có số hướng giải cụ thể thu nhận chitin, chitosan phương pháp hóa học hay chế biến thức ăn cho gia súc, gia cầm… hầu hết chưa triệt để Bên cạnh đó, giá trị sử dụng tạo từ nguồn phế liệu thấp số hướng tạo thêm vấn đề môi trường Vỏ đầu tôm chứa lượng lớn protein chitin, đặc biệt chitin chiếm khoảng 27,2% (trọng lượng khô) Chitin polymer tạo đơn phân tử Nacetyl-D-glucosamine, chúng chất có tính dược lý cao việc điều trị bệnh liên quan đến khớp sản phẩm có tính thực tế có giá trị cao Xuất phát từ thực tế tồn mong mỏi chung tay giải vấn đề ô nhiễm môi trường - vấn đề cấp bách kỷ Chúng suy nghĩ đến việc tìm hướng để giải triệt để nguồn phế liệu Một hướng nghiên cứu chúng tơi nghĩ đến “Khảo sát quy trình thu nhận N-acetyl-D-glucosamine từ vỏ đầu tôm” Với nghiên cứu này, mong muốn đưa hướng để giải vấn đề ô nhiễm môi trường vỏ đầu tôm theo phương pháp sinh học cách sử dụng enzym chitinase tổng hợp từ Trichoderma hazianum để phân giải SVTH: Nguyễn Văn Huẩn Luận văn tốt nghiệp GVHD: Bùi Anh Võ 4.4 Kết phương pháp ủ Bảng 4.4 Kết phương pháp ủ Phương pháp CN-acetyl-D-glucosamine (µg/ml) Gián tiếp Trực tiếp 4363,8±277,2 4454±2878,7 Biểu đồ 4.4 Biểu đồ kết phương pháp ủ  Nhận xét: Dựa vào kết phân tích cho thấy, ủ trực tiếp chitin thơ với dịch enzyme có chứa hệ sợi nấm (cách 1) cho kết tốt so với cách ủ với dịch lọc không chứa hệ sợi nấm (cách 2) Kết cho thấy hệ sợi nấm có ảnh hưởng đến việc phân hủy vỏ đầu tôm enzyme, ảnh hưởng hệ sợi nấm giúp giữ lơ lửng mảnh chitin dung dịch tốt so với dịch khơng có sợi nấm, mà enzyme có hội tiếp xúc phân hủy vỏ đầu tơm tốt Tuy nhiên nhìn vào số liệu ta thấy chênh lệch hàm lượng N-acetyl-Dglucossamine hai cách không lớn sai số cách trực tiếp (cách 1) lớn so với sai số cách ủ gián tiếp (cách 2) điều cho thấy độ xác lần lặp lại cách không cao Mặt khác, nhìn vào quy trình thu nhận ta thấy giữ hệ sợi nấm trình ủ thu nhận N-acetyl-D-glucossamine gặp khó khăn Hệ sợi nấm chuyển sang pha suy vong sau thời gian ủ hệ sợi nấm SVTH: Nguyễn Văn Huẩn 41 Luận văn tốt nghiệp GVHD: Bùi Anh Võ phân hủy tạo chất khác làm ảnh hưởng đến chất lượng sản phẩm Ngoài ra, ủ vỏ tôm chung với hệ sợi nấm làm giảm tổng thể tích dịch phân hủy đơn vị diện tích ủ (do chiếm thể tích hệ sợi) Do làm giảm hiệu suất thu N-acetyl-D-glucossamine  Từ kết phân tích trên, nhận thấy cách ủ gián tiếp (cách 2) khả thi cho quy trình thu nhận N-acetyl-D-glucossamine sử dụng cách khảo sát 4.5 Kết khảo sát ảnh hưởng pH đến khả phân hủy vỏ đầu tôm enzyme chitinase Bảng 4.5 Kết khảo sát ảnh hưởng pH đến khả phân hủy vỏ đầu tôm enzyme chitinase pH 4,5 5,0 5,5 6,0 6,5 CN-acetyl-Dglucosaminee 3205±625 3609,2±5833,3 3696,7±1927,1 4567,7±3237,6 3000,8±677,1 (µg/ml) Biểu đồ 4.5 Ảnh hưởng pH đến khả phân hủy vỏ đầu tôm enzyme chitinase SVTH: Nguyễn Văn Huẩn 42 Luận văn tốt nghiệp GVHD: Bùi Anh Võ  Nhận xét: Yếu tố pH mơi trường có ảnh hưởng lớn đến việc cảm ứng phản ứng enzyme Chúng ảnh hưởng đến mức độ ion hóa chất, enzyme đặc biệt đến độ bền enzyme Qua kết khảo sát cho thấy, giá trị pH 6,0 phân hủy vỏ đầu tơm cao enzyme chitinase Tại giá trị pH 4,5 pH 6,5 cho kết phân hủy thấp chúng tạo mức độ ion hóa bất lợi cho q trình phân hủy vỏ tôm Qua kết ta thấy, giá trị pH có ảnh hưởng rõ rệt đến khả phản ứng enzyme Vậy pH 6,0 giá trị cho khả phân hủy vỏ đầu tôm cao chọn để điều chỉnh pH dịch lọc q trình ủ vỏ đầu tơm 4.6 Kết khảo sát ảnh hưởng thời gian ủ đến khả tạo N-acetyl-Dglucosamine Bảng 4.6 Kết khảo sát ảnh hưởng thời gian ủ đến khả tạo N-acetyl-D-glucosamine Thời gian (h) 24 48 72 96 3842,1±1351,6 4584,8±275,8 4664,5±2479,8 4711,4±498 CN-acetyl-D-glucosamine (µg/ml) Biểu đồ 4.6 Ảnh hưởng thời gian ủ đến khả tạo N-acetyl-D-glucosamine SVTH: Nguyễn Văn Huẩn 43 Luận văn tốt nghiệp GVHD: Bùi Anh Võ  Nhận xét: Dựa vào kết khảo sát ta thấy, ủ qua khoảng thời gian khác hàm lượng N-acetyl-D-glucosamine tăng dần theo thời gian (24-96h) Tuy nhiên tăng hàm lượng N-acetyl-D-glucosamine tăng theo mốc thời gian khác Quan sát kết thấy rằng, sau ủ khoảng thời gian từ 24-48h hàm lượng Nacetyl-D-glucosamine có biến đổi cách rõ rệt, rõ rệt không xảy khoảng thời gian khảo sát lại từ 48-72h 72-96h Sau ủ vượt qúa 48h phân hủy enzyme vỏ đầu tơm khơng cịn mạnh, hàm lượng N-acetyl-Dglucosamine tạo đơn vị thời gian giảm dần Điều sản phẩm tạo cạnh tranh với chất ban đầu sản phẩm tạo làm thay đổi nồng độ ion ảnh hưởng đến pH môi trường, làm giảm khả phản ứng enzyme Cũng chất trung gian q trình tạo N-acetyl-D-glucosamine bị chất gắn vào làm chúng khơng thể chuyển hóa thành sản phẩm cuối Dựa vào kết lợi ích kinh tế tạo ra, thấy khoảng thời gian ủ 48h có tính khả thi trình ủ thu nhận N-acetyl-D-glucosamine Mặc dù sản phẩm tạo thấp so với 72h 96h, nhiên xét mặt thời gian dùng để ủ mẻ tổng sản phẩm tạo khoảng thời gian định ta thấy khoảng thời gian 48h cho lợi nhiều Mặc khác, độ sai lệch lần lặp lại thấp cho thấy mức độ xác cao Vậy khoảng thời gian 48h thời gian thích hợp cho trình ủ vỏ tơm tạo Nacetyl-D-glucosamine chitinase 4.7 Kết khảo sát ảnh hưởng việc xử lý vỏ đầu tôm đến khả phân hủy tạo N-acetyl-D-glucosamine Bảng 4.7 Kết khảo sát ảnh hưởng việc xử lý vỏ đầu tôm đến khả phân hủy tạo N-acetyl-D-glucosamine Phương thức Khơng xử lý vỏ đầu tơm Có xử lý vỏ đầu tơm C N-acetyl-D-glucosamine (µg/ml) 4606,6±513 4802,3±1102,4 SVTH: Nguyễn Văn Huẩn 44 Luận văn tốt nghiệp GVHD: Bùi Anh Võ Biểu đồ 4.7 Ảnh hưởng việc xử lý vỏ đầu tôm đến khả phân hủy tạo N-acetyl-D-glucosamine  Nhận xét: Sau khảo sát việc ủ vỏ tơm qua xử lý loại khống HCl 2N vỏ tôm không xử lý Nhận thấy ủ với vỏ tôm loại khoáng cho kết phân hủy tốt Kết xử lý vỏ đầu tơm để loại khống, phá vỡ liên kết phân tử chitin (vì tự nhiên chitin tồn dạng tự do, mà luôn nối cầu nối đẳng trị với protein, CaCO3 hợp chất hữu khác) làm giảm độ bền chặt cấu trúc, tạo điều kiện thuận lợi cho phản ứng phân hủy enzyme Sự thuận lợi giúp mẫu đầu tơm xử lý khử khống có kết tốt (khoảng 2%) so với mẫu không xử lý chênh lệch khơng lớn Từ mục đích đề tài nhằm tìm quy trình thân thiện với môi trường kết đạt Chúng nhân thấy việc sử dụng nguồn nguyên liệu khơng xử lý hóa học hướng có tính khả thi phù hợp với xu hướng thời đại Vậy nguyên liệu sử dụng trình thu nhận N-acetyl-D-glucosamine từ vỏ đầu tơm khơng cần xử lý hóa chất để loại khống  Với kết thu được, đưa quy trình thu nhận N-acetyl-Dglucosamine từ vỏ đầu tơm enzyme chitinase thu từ việc nuôi cấy nấm T.hazianum sau: SVTH: Nguyễn Văn Huẩn 45 Luận văn tốt nghiệp GVHD: Bùi Anh Võ Giống Nhân giống 1,0 % chitin thô pH 5,5 Cảm ứng tạo chitinase Thời gian 120h Lọc Ủ Vỏ đầu tôm pH 6,0 Thời gian 48h Lọc Cô đặc T = 50-60 0C Cồn 96 %; tỷ lệ 1/1 Tủa Ly tâm Sấy T = 50-60 0C N-Acetyl-DGlucosamine Sơ đồ 4.1 Quy trình thu nhận N-acetyl-D-glucosamine SVTH: Nguyễn Văn Huẩn 46 Luận văn tốt nghiệp GVHD: Bùi Anh Võ CHƯƠNG KẾT LUẬN - KIẾN NGHỊ 5.1 Kết quả: Với kết khảo sát, rút kết luận sau: - Enzyme chitinase cảm ứng từ nấm T.hazianum cho hoạt tính cao trường ni cấy có nồng độ chitin thô cảm ứng 1,0%,pH môi trường 5,5, khoảng thời gian 120h nhiệt độ phịng có kết hợp nuôi cấy máy lắc Hoạt lực enzyme thu sau cảm ứng 5,77 U/ml - Thủy phân vỏ đầu tôm enzyme chitinase cho hiệu suất thu hồi N-acetylD-glucosamine 46,1% điều kiện môi trường pH 6,0 khoảng thời gian 48h với nhiệt độ phịng có đặt máy lắc - Đã hồn thành mục tiêu đề tài, đưa quy trình thu nhận N-acetyl-Dglucosamine phương pháp sinh học vừa thân thiện với mơi trường lại tạo sản phẩm có giá trị kinh tế - Hồn tồn phân hủy vỏ đầu tôm enzyme chitinase thu nhận từ nấm T.hazianum để thu nhận N-acetyl-D-glucosamine 5.2 Kiến nghị: Với kết thu được, để đưa vào nghiên cứu ứng dụng xin kiến nghị số vấn đề sau: - Tiếp tục khảo sát yếu tố nhiệt độ trình sinh tổng hợp enzyme chitinase trình phân hủy vỏ đầu tơm enzyme, nhằm tối ưu hóa điều kiện cảm ứng tạo sản phẩm với hiệu suất thu hồi cao - Khảo sát phương pháp làm mịn vỏ đầu tơm nhằm tìm cách tạo diện tích bề mặt mảnh vỏ đầu tơm lớn nhất, tăng khả phản ứng với enzyme - Nghiên cứu thêm giai đoạn tinh chế sản phẩm để tạo sản phẩm có chất lượng giá trị kinh tế cao - Nghiên cứu để cải tiến quy trình theo hướng sản xuất liên tục SVTH: Nguyễn Văn Huẩn 47 Luận văn tốt nghiệp GVHD: Bùi Anh Võ TÀI LIỆU THAM KHẢO  Tài liệu tiếng Việt Phạm Lê Dũng, Trịnh Bình, Lại Thu Hiền cộng sự, “Vật liệu sinh học từ chitin”, Viện hóa học - Viện công nghệ sinh học, Trung tâm khoa học tự nhiên Công nghệ quốc gia Hà Nội, 1997 Phạm Thị Ánh Hồng, Kỹ thuật sinh hóa, Nhà xuất Đại học Quốc Gia TPHCM, 2003 Trần Thị Luyến, Huỳnh Nguyễn Duy Bảo cộng sự, “Hồn thiện quy trình sản xuất Chitin-Chitosan chế biến số sản phẩm công nghiệp từ phế liệu vỏ tôm, cua”, Báo cáo khoa học - Đề tài cấp bộ, Nha Trang, 2000 Nguyễn Đức Lượng, Nguyễn Thị Thùy Dương, Xử lý chất thải hữu tập 2, Nhà xuất Đại học Quốc Gia TPHCM, 2003 Nguyễn Đức Lượng, Cao Cường, Thí nhiệm cơng nghệ sinh học tập 1- Thí nghiệm hóa sinh học, Nhà xuất Đại học Quốc Gia TPHCM, 2003 Nguyễn Đức Lượng, Phan Thị Huyền, Nguyễn Ánh Tuyết, Thí nghiệm cơng nghệ sinh học tập - Thí nghiệm vi sinh vật học Nhà xuất Đại học Quốc Gia TPHCM, 2003 Đỗ Văn Nam cộng sự, 2005, Shahidi Synowiecki, 1991 Nguyễn Vĩnh Ngọc, Thuốc điều trị thối hóa khớp, Tạp chí Sức khỏe & đời sống số 964, 2006 Đỗ Đình Rãng, Phạm Đình Cường, Xác định hàm lượng chitin số loài thủy sản Việt Nam chuyển hóa thành glucosamin, Tạp chí khoa học, N0 4, tr 6671, 1990 10 Nguyễn Đức Ý (Texas-Hoa Kỳ), Dinh dưỡng với viêm khớp, Tạp chí sức khỏe đời sống, N0 344, tr 9-10, 2006 SVTH: Nguyễn Văn Huẩn 48 Luận văn tốt nghiệp GVHD: Bùi Anh Võ  Tài liệu nước 11 Ainsworth, G.S and Sussman, A.S., The fungi, an advance treatise, Vol III The fungal population, Acad press Inc, New York, 1968 12 Christian P Kabicek and Garye.Harm, Trichodserma and Gliocladium Volume 1, Taylor and Fancis Ltd, 1998 13 Esposito, E.G and Jack, J P, Molecular biotechnology principles and application of recombinant DNA 2nd edition, ASM press Washington, D.C, 1998 14 Harman, G.E and Kubicek, C.P, Trichoderma and Gliocladium, Vol I, basic biology, taxonomy and genetics, P.6-10, 46-69, 1998 15 Harman, G.E and Kubicek, C.P, Trichoderma and Gliocladium, Vol II Ezymes,biological control and commercial application P.131-142, 1998 16 Kim S S., Kim S H and Lee.Y M., Preparation, characterization and properties of β-Chitin and N-Acetylated β-Chitin, J.Polymer Sci., Part B: Polymer physics Vol 34, p.2367-2374, 1996 17 Papavizas, Trichoderma and Gliocladium: biology, ecology, and potential for control, Am Rev.phytophah 23: 23-54, 1985 18 Sydney London, Encyclopedia of polymer Sciene and Technology, Vol 3, p 605704, 1965 SVTH: Nguyễn Văn Huẩn 49 Luận văn tốt nghiệp GVHD: Bùi Anh Võ PHỤ LỤC Phụ lục Hình ảnh 0,25% 1,5% 0,5% 2,0% 1,0% 2,5% Hình khảo sát ảnh hưởng nồng độ chitin đến sinh tổng hợp chitinase 48h 120h 72h 96h 148h 168 Hình khảo sát ảnh hưởng thời gian đến sinh tổng hợp chitinase SVTH: Nguyễn Văn Huẩn 50 Luận văn tốt nghiệp GVHD: Bùi Anh Võ pH4,5 pH5,0 pH6,0 pH5,5 pH6,5 Hình khảo sát ảnh hưởng pH đến sinh tổng hợp chitinase Gián tiếp Trực tiếp Hình khảo sát phương pháp ủ tạo N-acetyl-D- glucosamine SVTH: Nguyễn Văn Huẩn 51 Luận văn tốt nghiệp GVHD: Bùi Anh Võ Phụ lục Biểu đồ đường chuẩn Biểu đồ đường chuẩn N-acetyl-D-glucosamin Phụ lục Kết khảo sát ảnh hưởng hàm lượng chitin đến tổng hợp chitinase Anova: Single Factor SUMMARY Groups 0,25% 0,5% 1,0% 1,5% 2,0% 2,5% ANOVA Source of Variation Between Groups Within Groups Total Count 3 3 3 Sum 5,5 12,51 15,94 13,33 12,16 9,6 Average 1,833333 4,17 5,313333 4,443333 4,053333 3,2 Variance 0,000933 0,0201 0,006533 0,013233 0,003733 0,0124 SS 21,37598 0,113867 21,48984 df 12 17 MS 4,275196 0,009489 F 450,5475 SVTH: Nguyễn Văn Huẩn P-value 3,22E-13 F crit 3,105875 52 Luận văn tốt nghiệp GVHD: Bùi Anh Võ Phụ lục Kết khảo sát ảnh hưởng yếu tố pH đến sinh tổng hợp chitinase Anova: Single Factor SUMMARY Groups Count 4,5 5,0 5,5 6,0 6,5 ANOVA Source of Variation Between Groups Within Groups Total Sum 9,08 12,72 16,32 13,49 7,72 SS df 16,05197333 0,46 16,51197333 10 14 Average Variance 3,026667 0,080933 4,24 0,0111 5,44 0,0325 4,496667 0,013233 2,573333 0,092233 MS F 4,012993 87,23899 0,046 P-value 9,83E08 F crit 3,47805 Phụ lục Kết khảo sát ảnh hưởng yếu tố thời gian đến sinh tổng hợp chitinase Anova: Single Factor SUMMARY Groups Count 48h 72h 96h 120h 144h 168h Sum 4,839449541 6,062691131 10,24847095 17,30122324 13,19189602 12,15978593 Average 1,61315 2,020897 3,416157 5,767074 4,397299 4,053262 Variance 0,003288 0,011081 0,00341 0,005967 0,034461 0,00341 MS F ANOVA Source of Variation Between Groups SS df 35,9816776 Within Groups Total 0,12323208 36,1049097 12 17 SVTH: Nguyễn Văn Huẩn P-value 2,31E7,196336 700,7593 14 F crit 3,105875 0,010269 53 Luận văn tốt nghiệp GVHD: Bùi Anh Võ Phụ lục Kết phương pháp ủ Anova: Single Factor SUMMARY Groups Count Gián tiếp Trực tiếp ANOVA Source of Variation Between Groups Within Groups Total Sum Average Variance 13091,5 4363,833 277,2233 13363,3 4454,433 2878,703 SS df MS F P-value F crit 12312,54 12312,54 7,802805 0,049144 7,708647 6311,853 18624,39 1577,963 Phụ lục Kết khảo sát ảnh hưởng pH đến khả phân hủy vỏ đầu tôm enzyme chitinase Anova: Single Factor SUMMARY Groups 4,5 5,0 5,5 6,0 6,5 Count 3 3 Sum Average Variance 9615 3205 625 10827,5 3609,167 5833,333 11090 3696,667 1927,083 13703,1 4567,7 3237,64 9002,5 3000,833 677,0833 ANOVA Source of Variation Between Groups Within Groups SS df MS 4378913 24600,28 10 1094728 2460,028 Total 4403513 14 SVTH: Nguyễn Văn Huẩn F P-value 3,25E445,0064 11 F crit 3,47805 54 Luận văn tốt nghiệp GVHD: Bùi Anh Võ Phụ lục Kết khảo sát ảnh hưởng thời gian ủ đến khả tạo N-acetyl-D-glucosamine SUMMARY Groups 24h 48h 72h 96h Count 3 3 Sum Average Variance 11526,3 3842,1 13516,81 13754,5 4584,833 275,7733 13993,6 4664,533 2479,773 14134,2 4711,4 498,01 ANOVA Source of Variation Between Groups Within Groups 1506225 33540,73 Total 1539765 11 SS df MS F P-value F crit 5,49E502074,9 119,7529 07 4,066181 4192,592 Phụ lục Kết khảo sát ảnh hưởng việc xử lý vỏ đầu tôm đến khả phân hủy tạo N-acetyl-D-glucosamine Anova: Single Factor SUMMARY Groups Khơng xử lý Có xử lý Count Sum Average Variance 13819,8 4606,6 513,03 14406,8 4802,267 1102,363 ANOVA Source of Variation Between Groups Within Groups 57428,16667 3230,786667 57428,17 71,10116 0,001083 7,708647 807,6967 Total 60658,95333 SS SVTH: Nguyễn Văn Huẩn df MS F P-value F crit 55 ... đơn vị N-Acetyl-β-Dglucosamine liên kết với liên kết ? ?-( 1-4 ) glucoside * Công thức cấu tạo chitin: Tên gọi: poly( 1-4 )-2 -acetamido-2-deoxy-β-D-glucose; poly( 1-4 )-2 -acetamido- 2- deoxy-β-D-glucopyranose... Anh Võ * Công thức cấu tạo: + Tên gọi khoa học: 2-Acetoamido-2-deoxy-D-glucopyranose; N-acetyl-D-(+)glucosamine; N-acetyl-β-D-glucosaminide; N-acetylchitosamine + Công thức phân tử: C8H15O6N... - Tủ sấy - Máy cô quay - Máy đo pH - Máy lắc - Nồi hấp vô trùng - Thiết bị gia nhiệt - Cân phân tích - Hệ thống lọc chân khơng - Bình định mức - Becher - Erlen - Ống đong - Ống nghiệm - Nhiệt