Ảnh hưởng của sự thay đỏi nông độ BA kết hợp với nông độ cổ định NAA lên khả năng nhân nhanh phôi và hình thành PLB từ phôi lan Hỗ Điệp (P amdbilis)

Lời cảm ơn Để hoàn thành luận văn tốt nghiệp này, em nhận nhiều giúp đỡ từ thầy, cô, anh chị, bạn gia đình Em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến: Ban giám hiệu trường Đại học Tôn Đức Thắng phòng ban tạo điều kiện tố t cho em thực khóa thực tập tốt nghiệp Quý Thầy Cô môn CNSH trường Đại học Đại Học Tôn Đức Thắng truyền đạt cho em kiến thức kinh nghiệm quý báu Thầy, PGS.TS Dương Tấn Nhựt, em xin gửi lời cảm ơn chân thành sâu sắc đến Thầy, người trực tiếp gợi ý đề tài, tận tình hướng dẫn chu đáo, truyền đạt kinh nghiệm quý báu, hết lòng giúp em hoàn thành trọn vẹn đề tài người dìu dắt em bước để tiếp cận đến với chân trời khoa học rộng lớn K hông truyền đạt kiến thức, Thầy dạy cho em lối sống, cách làm người Thầy gương lòng nhiệt huyết, cống hiến cho nghiệp khoa học, để chúng em học hỏi, noi theo Em gửi lời cảm ơn sâu sắc tới ThS Nguyễn Bá Nam người trực tiếp hướng dẫn, bảo tận tình tạo điều kiện cho em ngày thực tập tại viện suốt quá trình tiến hành thí nghiệm đề tài Ban lãnh đạo Viện Sinh học Tây Nguyên tạo điều kiện thuận lợi cho em suốt thời gian thực luận văn Các anh chị phòng Sinh học phân tử & Chọn tạo giống trồng (viện Sinh học Tây Nguyên): anh Bình, anh Nam, anh Luận, chị Hiền, chị Thu Ba, chị Phượng, chị Hằng Xin cảm ơn anh chị, bạn hướng dẫn giúp đỡ em suốt trình làm luận văn Cuối xin cảm ơn gia đình ủng hộ động viên lựa chọn Đặc biệt mẹ, người tin tưởng, cho nghị lực sức mạnh gặp khó khăn để vươn lên sống Một lần xin gửi lời cảm ơn chân thành đến tất người! DANH MỤC BẢNG Bảng 4.1 Ảnh hưởng thay đổi nồng độ BA kết hợp với nồng độ cố định NAA lên khả nhân nhanh phơi hình thành PLB từ phôi lan Hồ Điệp (P amabilis) Bảng 4.2 Ảnh hưởng loại môi trường nuôi cấy khác lên khả tái sinh chồi từ PLB lan Hồ Điệp (P ambilis) sau tuần nuôi cấy Bảng 4.3 Ảnh hưởng dịch chiết chuối lên sinh trưởng phát triển lan Hồ Điệp (P amabilis) in vitro sau 12 tuần nuôi cấy Bảng 4.4 Ảnh hưởng dịch chiết cà chua lên sinh trưởng phát triển lan Hồ Điệp (P amabilis) in vitro sau 12 tuần nuôi cấy Bảng 4.5 Ảnh hưởng nước dừa lên sinh trưởng phát triển lan Hồ Điệp (P amabilis) in vitro sau 12 tuần nuôi cấy Bảng 4.6 Ảnh hưởng casein hydrolase lên sinh trưởng phát triển lan Hồ Điệp (P amabilis) in vitro sau 12 tuần nuôi cấy Bảng 4.7 So sánh ảnh hưởng loại dịch chiết khác lên sinh trưởng phát triển lan Hồ Điệp (P amabilis) in vitro sau 12 tuần nuôi cấy Bảng 4.8 Ảnh hưởng giá thể lên khả sống sót có nguồn gốc từ phơi vơ tính giai đoạn vườn ươm DANH MỤC HÌNH Hình 2.1 Phalaenopsis amabilis Hình 2.2 Quy trình nhân giống lan Hồ Điệp Phalaenopsis amabilis Hình 4.1 Ảnh hưởng thay đổi nồng độ BA kết hợp với 0,5 mg/l NAA lên khả nhân nhanh phôi tạo PLB từ phơi lan Hồ Điệp (P amabilis Hình 4.2 Ảnh hưởng loại môi trường khác lên khả tái sinh chồi từ PLB lan Hồ Điệp (P ambilis) sau tuần ni cấy Hình 4.3 Ảnh hưởng dịch chiết chuối, cà chua lên sinh trưởng phát triển lan Hồ Điệp (P amabilis) in vitro sau 12 tuần nuôi cấy Hình 4.4 Ảnh hưởng nước dừa, casein hydrolase lên sinh trưởng phát triển lan Hồ Điệp (P amabilis) in vitro sau 12 tuần nuôi cấy Hình 4.5 Ảnh hưởng giá thể khác lên khả sống sót có nguồn gốc từ phơi vơ tính lan Hồ Điệp (P ambilis) giai đoạn vườn ươm DANH MỤC BIỂU ĐỒ Biểu đồ 4.1 So sánh trọng lượng mẫu thu nồng độ BA khác Biểu đồ 4.2 So sánh trọng lượng tươi mẫu loại môi trường nuôi cấy khác Biểu đồ 4.3 So sánh trọng lượng tươi mẫu loại môi trường nuôi cấy khác Biểu đồ 4.4 So sánh ảnh hưởng loại dịch chiết khác lên sinh trưởng phát triển lan Hồ Điệp (P amabilis) in vitro sau 12 tuần nuôi cấy Biểu đồ 4.5 So sánh ảnh hưởng loại giá thể khác lên khả sống sót có nguồn gốc từ phơi vơ tính giai đoạn vườn ươm DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT 2iP : N6-(2-isopentyl) adenine BA : 6-benzyl aminopurine NAA : α-naphthalenacetic acid IAA : 3-indol acetic acid IBA : 3-indole butyric acid Kinetin : 6-furfuryl aminopurine GA : Gibberellin A ABA : Abscisic acid VW : Vacin-Went (1969) MS : Murashige Skoog (1962) ½ MS : mơi trường MS có hàm lượng khống đa lượng giảm nửa PLB : Protocorm like body PEDC : Preembryogenic determined cell IEDC : Induced embryonic determined cell EC : Embryogenic cell (các cụm tế bào phát triển phôi) NT : Nghiệm thức TÓM TẮT LUẬN VĂN Lan Hồ Điệp (P.amabilis) loại lan khó nhân giống nay.Các p hương pháp nhân giống tạo chồi từ việc nuôi cấy phát hoa, tạo PLB từ nuôi cấy mẫu lá, nhân nhanh PLB qua nuôi cấy lát cắt ngang PLB… có hệ số nhân giốn g khơng cao nhiều thời gian sinh trưởng chậm Hiện nay, nhân giống lan Hồ Điệp quy mô thương mại nhiều nhà sản xuất quan tâm chúng đem lại lợi nhuận cao cho người trồng Khó khăn thường gặp sản xuất thương mại thời gian ngắn tạo số lượng giống có chất lượng tốt với mức chi phí thấp Thay chất điều hòa tăng trưởng loại dịch chiết hữu làm từ ngun liệu rẻ tiền, dể tìm có sẵn tự nhiên dồi hàm lượn g vitamin, acid amin, chất điều hòa sinh trưởng giải pháp khả thi góp phần tiết kiệm chi phí sản xuất hạ giá thành giống Trong đề tài nghiên cứu nhân nhanh phôi, hình thành PLB từ phơi, tái sinh chồi từ PLB ảnh hưởng dịch chiết hữu khác lên sự sinh trưởng phát triển lan Hồ Điệp in vitro Môi trường tối ưu cho nhân nhanh phôi tạo PLB từ phôi mơi trường MS có bổ sung mg/l BA + 0,5 mg/l NAA + 30 g/l đường sucrose + g/l than hoạt tính + 20% nước dừa điều chỉnh pH 5,7 Mơi trường thích hợp cho khả tái sinh chồi từ PLB lan Hồ Điệp (P amabilis) môi trường Vacin-Went bổ sung 0.5 mg/l NAA mg/l BA, 30 g/l đường sucrose + g/l than hoạt tính + 20% nước dừa điều chỉnh pH 5,3 Môi trường Vacin-Went bổ sung 50g/l dịch chiết chuối 30 g/l đường sucrose + g/l than hoạt tính điều chỉnh pH 5,3 môi trường phù hợp cho sinh trưởng phát triển Hồ Điệp in vitro so với mơi trường có bổ sung dịch chiết lại cà chua, nước dừa, casein hydrolase đối chứng.Chất lượng in vitro môi trường bổ sung dịch chiết chuối tốt bốn loại dịch chiết khảo sát Giá thể dớn trắng loại giá thể cho tỉ lệ sống giai đoạn vườn ươm cao (78,5%) so với loại giá thể lại dớn nâu (71,1 %) dớn nâu kết hợp với dớn trắng (75,8 %) Kết sở cho nghiên cứu khác lan Hồ Điệp nuôi cấy in vitro để đáp ứng cho quy mô sản xuất lớn phục vụ nhu cầu nước xuất MỤC LỤC Trang Lời cảm ơn Tóm tắt luận văn Danh mục chữ viết tắt Danh mục bảng Danh mục hình Danh mục biểu đồ Mục lục CHƯƠNG 1: MỞ ĐẦU 1.1 ĐẶT VẤN ĐỀ 1.2 MỤC ĐÍCH 1.3 YÊU CẦU CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN 2.1 KHÁI QUÁT VI NHÂN GIỐNG 2.1.1 Phương pháp nhân giống truyền thống trở ngại 2.1.1.1 Phương pháp nhân giống truyền thống 2.1.1.2 Các hạn chế phương pháp nhân giống truyền thống 2.1.2 Vi nhân giống 2.2 VAI TRỊ DỊCH CHIẾT HỮU CƠ ĐỐI VỚI NI CẤY MÔ THỰC VẬT 2.3 SƠ LƯỢC VỀ CHẤT ĐIỀU HÒA SINH TR Ư ỞNG VÀ VAI TRÒ CỦA CHÚNG TRONG VI NHÂN GIỐNG 2.3.1 Auxin 2.3.2 Cytokinin 2.4 GIỚI THIỆU VỀ CÂY LAN HỒ ĐIỆP (Phalaenopsis spp.) 2.4.1 Vị trí phân loại thực vật 2.4.2 Nguồn gốc phân bố 2.4.3 Đặc điểm thực vật học 2.4.3.1 Cơ quan sinh dưỡng 2.4.3.2 Cơ quan sinh sản 10 2.4.4 Giá trị kinh tế lan Hồ Điệp (P ambilis) 11 2.5 THUẬT NGỮ 12 2.6 NI CẤY PHƠI VƠ TÍNH 12 2.6.1 Sự phát sinh phôi từ tế bào sinh dưỡng 12 2.6.1.1 Định nghĩa 12 2.6.1.2 Các giai đoạn sinh phôi từ tế bào sinh dưỡng 12 2.6.2 Các giai đoạn q trình phát sinh phơi vơ tính 14 2.7 NHÂN TỐ TÁC ĐỘNG ĐẾN GIA TĂNG SỐ LƯỢNG PHÔI 14 2.8 CÁC GIAI ĐOẠN PHÁT TRIỂN CỦA PLB LAN HỒ ĐIỆP (P.amabilis) 15 2.9 ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT TÁI SINH TỪ CON ĐƯỜNG HÌNH THÀNH PHƠI VƠ TÍNH 15 2.10 THUẦN HÓA VÀ CHĂM SÓC CÂY CON NI CẤY MƠ NGỒI VƯỜN ƯƠM 16 2.10.1 Dụng cụ 16 2.10.2 Giá thể trồng lan 17 2.10.3 Yêu cầu giá thể trồng lan 17 2.10.4 Vườn lan 17 2.10.5 Các bước tiến hành 18 2.11 CÁC YÊU CẦU VỀ TRỒNG TRỌT VÀ CHĂM SÓC 21 CHƯƠNG 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 3.1 ĐỊA ĐIỂM VÀ THỜI GIAN TIẾN HÀNH ĐỀ TÀI 23 3.1.1 Địa điểm 23 3.1.2 Thời gian 23 3.2 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 23 3.3 VẬT LIỆU 23 3.3.1 Nguồn mẫu ban đầu 23 3.3.2 Môi trường 23 3.3.3 Điều kiện nuôi cấy 23 3.4 PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM 23 3.4.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng thay đổi nồng độ BA kết hợp với nồng độ cố định NAA lên khả nhân nhanh phơi hình thành PLB từ phơi lan Hồ Điệp (P amabilis) 23 3.4.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng loại môi trường nuôi cấy khác lên khả tái sinh chồi từ PLB lan Hồ Điệp (P ambilis) sau tuần nuôi cấy 24 3.4.3 Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng dịch chiết chuối lên sinh trưởng phát triển lan Hồ Điệp (P amabilis) in vitro sau 12 tuần ni cấy 25 3.4.4 Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hưởng dịch chiết cà chua lên sinh trưởng phát triển lan Hồ Điệp (P amabilis) in vitro sau 12 tuần ni cấy 26 3.4.5 Thí nghiệm 5: Khảo sát ảnh hưởng nước dừa lên sinh trưởng phát triển lan Hồ Điệp (P amabilis) in vitro sau 12 tuần nuôi cấy 26 3.4.6 Thí nghiệm 6: Khảo sát ảnh hưởng casein hydrolase lên sinh trưởng phát triển lan Hồ Điệp (P amabilis) in vitro sau 12 tuần ni cấy 27 3.4.7 Thí nghiệm 7: Nghiên cứu ảnh hưởng giá thể lên khả sống sót có nguồn gốc từ phơi vơ tính giai đoạn vườn ươm 28 3.5 XỬ LÝ SỐ LIỆU 28 CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng thay đổi nồng độ BA kết hợp với nồng độ cố định NAA lên khả nhân nhanh phơi hình thành PLB t phôi lan Hồ Điệp (P amabilis) 29 4.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng loại môi trường nuôi cấy khác lên khả tái sinh chồi từ PLB lan Hồ Điệp (P ambilis) sau tuần nuôi cấy 32 4.3 Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng dịch chiết chuối lên sinh trưởng phát triển lan Hồ Điệp (P amabilis) in vitro sau 12 tuần ni cấy 35 4.4 Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hưởng dịch chiết cà chua lên sinh trưởng phát triển lan Hồ Điệp (P amabilis) in vitro sau 12 tuần ni cấy 36 4.5 Thí nghiệm 5: Khảo sát ảnh hưởng nước dừa lên sinh trưởng phát triển lan Hồ Điệp (P amabilis) in vitro sau 12 tuần nuôi cấy 38 4.6 Thí nghiệm 6: Khảo sát ảnh hưởng casein hydrolase lên sinh trưởng phát triển lan Hồ Điệp (P amabilis) in vitro sau 12 tuần ni cấy 40 4.7 Thí nghiệm 7: Nghiên cứu ảnh hưởng giá thể lên khả sống sót có nguồn gốc từ phơi vơ tính giai đoạn vườn ươm 43 CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ TÀI LIỆU THAM KHẢO SVTH: Nguyễn Minh Nhật Hình 4.3 Ảnh hưởng dịch chiết chuối, cà chua lên sinh trưởng phát triển lan Hồ Điệp (P amabilis) in vitro sau 12 tuần nuôi cấy a: Sự sinh trưởng phát triển in vitro lan Hồ Điệp bổ sung dịch chiết chuối tương ứng nồng độ 0; 50; 100; 150; 200 g/l b: Sự sinh trưởng phát triển in vitro lan Hồ Điệp bổ sung dịch chiết cà chua tương ứng nồng độ 0; 50; 100; 150; 200 g/l 4.5 Thí nghiệm Khảo sát ảnh hưởng nước dừa lên sinh trưởng lan Hồ Điệp (P amabilis) in vitro sau 12 tuần nuôi cấy Sau 12 tuần nuôi cấy, khả sinh trưởng phát triển lan Hồ Điệp nuôi cấy in vitro nồng độ khác bổ sung nước dừa vào mơi trường ni cấy trình bày bảng 4.5 38 SVTH: Nguyễn Minh Nhật Bảng 4.5 Ảnh hưởng nước dừa lên sinh trưởng lan Hồ Điệp (P amabilis) in vitro sau 12 tuần nuôi cấy NT Trọng lượng tươi (g) E1 1,58 ± 0,14 E2 Số lượng Chiều dài (cm) Chiều rộng (cm) Số lượng rễ Chiều dài rễ (cm) 2,66 ± 0,33 3,46 ± 0,145 1,60 ± 0,57 2,30 ± 0,33 2,76 ± 0,15 1,93 ± 084 3,33 ± 0,33 3,50 ± 0,13 1,66 ± 0,88 2,60 ± 0,33 2,63 ± 0,18 E3 0,54 ± 0,09 2,33 ± 0,33 1,30 ± 0,57 1,10 ± 0,57 4,30 ± 0,57 2,26 ± 0,88 E4 0,88 ± 0,53 2,33 ± 0,33 1,56 ± 0,88 0,96 ± 0,12 2,30 ± 0,33 4,46 ± 0,08 ĐC 0,89 ± 0,33 2,33 ± 0,57 1,83 ± 0,88 0,86 ± 0,88 2,00 ± 0,59 2,53 ± 0,15 Sau 12 tuần nuôi cấy, khả sinh trưởng phát triển lan Hồ Điệp nuôi cấy in vitro nồng độ khác bổ sung nước dừa vào mơi trường ni cấy trình bày bảng 4.5 Kết cho thấy, việc bổ sung nước dừa vào môi trường nồng độ khác có ảnh hưởng khơng giống tới khả sinh trưởng in vitro Từ ta tìm hàm lượng nước dừa thích hợp bổ sung vào môi trường cho khả sinh trưởng tốt để tạo nguồn giống có chất lượng tốt, khỏe, đẹp trước đưa trồng vườn ươm Thông qua tiêu sinh trưởng, sinh trưởng phát triển vượt trội nghiệm thức E2 (bổ sung 200 ml/l nước dừa) so với nghiệm thức lại so với đối chứng Các thành phần có nước dừa acid aimin, IAA (Agampodi Jayawardena, 2009), myo-inositol có ảnh hưởng đến chất lượng con, kích thích phát triển chiều dài lẫn chiều rộng Lá lan Hồ Điệp có đường kính ( 1,66 ± 0,88 cm) chiều dài ( 3,50 ± 0,13 cm) đạt cao nghiệm thức E2 (bổ sung 200 ml/l nước dừa) giảm dần nghiệm thức cịn lại Nước dừa có vai trị quan trọng phát triển rễ, kích thích phát triển rễ thành phần nướ c dừa có chứa chất điều hịa sinh trưởng IAA Đối với tiêu chiều dài rễ số lượng rễ hình thành cây, số lư ợng rễ (4,30 ± 0,33 rễ/cây) đạt cao nghiệm thức E3 tiêu giảm dần nghiệm thức lại đạt thấp nghiệm thức E4 (bổ sung 400 ml/l nước dừa) Agampodi Jayawardena (2009) kết luận dịch chiết nước dừa có chứa 143 μM IAA giúp kích thích trình phát ển tri rễ D purplecompacta L Tuy nhiên, trình tác động nước dừa nồng độ khác 39 SVTH: Nguyễn Minh Nhật lên phát triển rễ số lượng lẫn chiều dài rễ không giống điều thể rõ nghiệm thức E3 E4 Với số lượng rễ 4,30 ± 0,33 rễ/cây đạt cao nghiệm thức E3 (bổ sung 300 ml/l nước dừa), nhiên chiều dài rễ đạt kết cao lại nghiệm thức E4 (4,46 ± 0,08 rễ/cây) (bảng 4.5, hình 4.4a) Qua thấy tác động không giống nước dừa nồng độ khác lên sinh trưởng, phát triển chất lượng lan Hồ Điệp.Trong thí nghiệm nước dừa có vai trị vừa kích thích phát triển rễ Bổ sung 200 ml/l nước dừa vào môi trường nuôi cấy giúp cho in vitro sinh trưởng phát triển tốt so với nồng độ cịn lại 4.6 Thí nghiệm 6: Khảo sát ảnh hưởng casein hydrolase lên sinh trưởng lan Hồ Điệp (P amabilis) in vitro sau 12 tuần nuôi cấy Sau 12 tuần nuôi cấy, tiêu đánh giá sinh trưởng trình bày bảng 4.6 Bảng 4.6 Ảnh hưởng casein hydrolase lên sinh trưởng lan Hồ Điệp (P amabilis) in vitro sau 12 tuần nuôi cấy NT Trọng lượng tươi (g) Số lượng Chiều dài (cm) Chiều rộng (cm) F1 0,37 ± 0,01 3,66 ± 0,33 1,90 ± 0,06 1,13 ± 0,15 4,00 ± 0,57 2,86 ± 0,12 F2 1,35 ± 0,70 2,33 ± 0,33 3,83 ± 0,15 1,30 ± 0,06 4,60 ± 0,33 4,16 ± 0,20 F3 0,73 ± 0,16 2,33 ± 0,33 2,20 ± 0,05 1,08 ± 0,08 5,30 ± 0,33 2,83 ± 0,08 F4 1,57 ± 0,70 4,33 ± 0,33 1,50 ± 0,05 1,00 ± 0,58 6,60 ± 0,88 4,56 ± 0,15 ĐC 0,89 ± 0,33 2,33 ± 0,57 1,83 ± 0,88 0,86 ± 0,88 2,00 ± 0,59 2,53 ± 0,15 Số lượng rễ Chiều dài rễ (cm) Khi bổ sung casein hydrolase nồng độ (50, 100, 150, 200 mg/l) tiêu sinh trưởng thấp.Về mặt hình thái, có số lượng rễ nhiều, nhỏ, mặt mép xuất sắc tố tím Số lượng rễ hình thành ảnh hưởng đến trình phát triển Số lượng rễ nhiều làm cho sinh trưởng kém, nhỏ chiều dài lẫn chiều rộng (hình 4.4) Điều thể rõ nghiệm thức F1 (bổ sung 50 mg/l casein hydrolase), với số lượng rễ ( 6,60 ± 0,88 rễ/cây) chiều dài rễ (4,56 ± 0,15 cm/rễ) đạt cao chiều dài (1,50 ± 0,05 cm/lá) chiều rộng (1,00 ± 0,58 cm/lá) đạt thấp so với nghiệm thức bổ sung casein hydrolase 40 SVTH: Nguyễn Minh Nhật Qua hình thái số liệu trình bày bảng 4.6 cho thấy việc bổ sung casein hydrolase nồng độ khác không thích hợp cho sinh trưởng phát triển in vitro lan Hồ Điệp Hình 4.4 Ảnh hưởng nước dừa, casein hydrolase lên sinh trưởng phát triển lan Hồ Điệp (P amabilis) in vitro sau 12 tuần nuôi cấy a: Sự sinh trưởng phát triển in vitro lan Hồ Điệp bổ sung nước dừa tương ứng nồng độ 0; 100; 200; 300; 400 ml/l b: Sự sinh trưởng phát triển in vitro lan Hồ Điệp bổ sung dịch chiết cà chua tương ứng nồng độ 0; 50; 100; 150; 200 mg/l 41 SVTH: Nguyễn Minh Nhật Bảng 4.7 So sánh ảnh hưởng loại dịch chiết khác lên sinh trưởng phát triển lan Hồ Điệp (P amabilis) in vitro sau 12 tuần nuôi cấy Dịch chiết hữu Trọng lượng tươi (g) Số lượng Chiều dài (cm) Chiều rộng (cm) Số lượng rễ Chiều dài rễ (cm) Nước dừa 1,93 ± 084 3,33 ± 0,33 3,50 ± 0,13 1,66 ± 0,88 3,60 ± 0,33 2,63 ± 0,19 Chuối 2,29 ± 0,82 4,00 ± 0,57 3,90 ± 0,17 1,80 ± 0,57 2,66 ± 0,33 3,13 ± 0,23 Cà chua 1,84 ± 0,27 4,00 ± 0,57 3,80 ± 0,11 1,63 ± 0,11 4,00 ± 0,57 3,50 ± 020 CH 1,57 ± 0,70 4,33 ± 0,33 1,50 ± 0,05 1,00 ± 0,58 6,60 ± 0,88 4,56 ± 0,15 Đối chứng 0,89 ± 0,33 2,33 ± 0,57 1,83 ± 0,88 0,86 ± 0,88 2,00 ± 0,59 2,53 ± 0,15 Chú thích: Ký hiệu CH Casein hydrolase 4,5 3,9 3,8 3.5 3,5 (cm) 2,5 1,66 1,8 1,63 1,5 1,83 1,5 1,03 0,5 nước dừa chuối cà chua CH ĐC Dịch chiết hữu chiều dài chiều rộng Biểu đồ 4.4 So sánh ảnh hưởng loại dịch chiết khác lên sinh trưởng phát triển lan Hồ Điệp (P amabilis) in vitro sau 12 tuần nuôi cấy Các số liệu trình bày bảng 4.7, biểu đồ 4.4 cho thấy tiêu chiều dài, chiều rộng trọng lượng tươi dịch chiết chuối cao so với dịch chiết cịn lại Trong chiều dài lá, chiều rộng hai tiêu quan trọng đánh giá khả sinh trưởng, phát triển chất lượng lan Hồ Điệp Về mặt hình thái, khỏe, phiến to, mặt có nhiều sắc tố tím, rễ khỏe mạnh có khả thích nghi cao chuyển điều kiện vườn ươm Qua kết luận bổ sung dịch chiết chuối vào môi trường nuôi cấy giúp cho lan Hồ Điệp sinh trưởng phát triển tốt thành phần chuối có nhiều vitamin (biotin, 42 SVTH: Nguyễn Minh Nhật vitamin B1, vitamin B2, vitamin C), acid amin (lysine, cysteine, methionine, arginine), chất điều hòa sinh trưởng GA (Khalifah, 1966a), IAA (Khalifah, 1966b), zeatin 2iP (Van Staden Stewart, 1975), khoáng chất K, P, Ca Fe (Tawaro, 2005; Askar, 1972), chất giải phóng q trình hấp khử trùng có vai trị kích thích phân chia thúc đẩy trình trao đổi chất tế bào đặc biệt kết hợp GA , zeatin 2iP có sẵn chuối giúp kích thích phát triển chiều dài lẫn chiều rộng Bên cạnh đó, IAA Fe (Tawaro, 2005) có chuối góp phần kích thích phát triển rễ Khi so sánh thành phần loại dịch chiết với nhận thấy chuối có hàm lượng vitamin, khoáng chất v đặc biệt chất điều hòa sinh trưởng nhiều so với dịch chiết khác, hỗ trợ cho hoạt động trình trao đổi chất tế bào tốt từ sinh trưởng phát triển tốt so với bổ sung dịch ch iết khác Kết phù hợp với nghiên cứu Kaewubon Meesawat thực Paphiopedilum niveum (Rchb.f) Pfitz Khi bổ sung dịch chiết chuối vào môi trường MS nồng độ 50 g/l cho khả tái sinh tốt 4.7 Thí nghiệm 7: Khảo sát ảnh hưởng giá thể lên khả sống sót có nguồn gốc từ phơi vơ tính giai đoạn vườn ươm sau 12 tuần nuôi cấy Lan Hồ Điệp xem lồi lan khó tính, đòi hỏi người trồng hoa phải đáp ứng yêu cầu sinh thái khắt khe nắm vững qui trình canh tác m ới thành cơng Lan Hồ Điệp đa số trồng từ cấy mô, nhiên tỉ lệ sống trồng điều kiện vườn ươm không cao ước tính khoảng 50% Có nhiều ngun nhân dẫ n đến tình trạng chẳng hạn như: chất trồng khơng phù hợp, bệnh hại vi khuẩn, nấm Trong đó, chất trồng không phù hợp làm giảm tỉ lệ sống Vì vậy, để khắc phục tượng trên, nhằm mục tiêu nâng cao tỉ lệ sống cùa lan Hồ Điệp giai đoạn vườn ươm thí nghiệm tiến hành trồng thử nghiệm loại giá thể sau: dớn trắng, dớn nâu, dớn trắng + dớn nâu (nghiệm thức T1, T2, T3) Các kết thu nhận trình bày bảng 4.8, hình 4.5 sau tuần trồng thử nghiệm loại giá thể kể 43 SVTH: Nguyễn Minh Nhật Bảng 4.8 Ảnh hưởng ảnh hưởng giá thể lên khả sống sót có nguồn gốc từ phơi vơ tính giai đoạn vườn ươm NT Dớn Tỷ lệ sống (cm) Tỷ lệ nhiễm bệnh (%) Chiều dài Chiều rộng (cm) (%) T1 Dớn nâu 2,14 ± 0,13 4,90 ± 0,36 27,6 71,1 T2 Dớn trắng 2,25 ± 0,04 5,15 ± 0,13 22,3 78,5 T3 Dớn nâu+ Dớn trắng 2,01 ± 0,06 4,47 ± 0,33 20,8 75,8 90 80 78,5 75,8 71,1 70 (%) 60 50 40 30 27,6 22,3 20,8 20 10 D ớn nâu D ớn tr ắng D ớn nâu + D ớn tr ắng Dớn Tỷ lệ nhiễm bệnh Tỷ lệ sống Biểu đồ 4.5 So sánh ảnh hưởng loại giá thể khác lên khả sống sót có nguồn gốc từ phơi vơ tính giai đoạn vườn ươm Qua kết thu nhận ta thấy tỉ lệ sống dao động từ 71,1-78,5 % tỷ lệ nhiễm bệnh từ 20,8-27,6 % 44 SVTH: Nguyễn Minh Nhật Hình 4.5 Ảnh hưởng giá thể khác lên khả sống sót có nguồn gốc từ phơi vơ tính lan Hồ Điệp (P ambilis) giai đoạn vườn ươm a: chuẩn bị chuyển giai đoạn vườn ươm, b: dớn, c trồng loại giá thể khác ( 1,2,3) tương ứng với loại giá thể dớn nâu, dớn trắng, dớn nâu + dớn trắng 45 SVTH: Nguyễn Minh Nhật Trong đó, chất trồng dớn trắng (nghiệm thức T2) loại giá thể có tỷ lệ sống cao đạt 78,5 % tỷ lệ nhiễm bệnh thấp (22,3 %) loại dớn kể Qua quan sát cho thấy với điều kiện chăm sóc nhau, với chất trồng dớn trắng bị thối rễ so với loại chất trồng lại Đây yếu tố quan trọng góp phần tăng tỉ lệ sống dớn trắng mang tính chất trung tính nên thích hợp cho việc trồng hoa lan Ngồi dớn trắng có khả giữ nước cao nên tốn cơng lao động cho việc tưới tiêu Độ bền dớn trắng cao, lâu mục qua thời gian, ảnh hưởng đến Dớn trắng có tính mềm, sát khuẩn, tốt cho rễ Ngồi ra, dớn trắng sử dụng thí nghiệm có nguồn gốc từ Trung Quốc có giá thành không cao so với dớn New Zeal and Chi Lê thích hợp cho việc sản xuất quy mơ thương mại Vì vậy, giá thể dớn trắng chất trồng tối ưu cho sinh trưởng lan Hồ Điệp giai đoạn vườn ươm Chất trồng giúp có tỉ lệ sống cao, tỉ lệ nhiễm bệnh thấp đồng thời giá thành lại rẻ so với chất trồng dớn nâu dớn nâu kết hợp với dớn trắng 46 SVTH: Nguyễn Minh Nhật PHẦN : KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận Từ kết thí nghiệm thực đề tài này, chúng tơi có số kết luận sau: Môi trường tối ưu cho nhân nhanh phôi tạo PLB từ phôi là: mơi trường MS có bổ sung mg/l BA + 0,5 mg/l NAA + 30 g/l đường sucrose + g/l than hoạ t tính + 20% nước dừa Mơi trường thích hợp cho khả t sinh ch i từ PLB lan Hồ Điệp ( P amabilis) môi trư ng Vacin -Went bổ sung ,5 mg/l NAA mg/l BA, 30 g/l đường sucrose + g/l than hoạt tính + 20% nước dừa Môi trường Vacin -Went bổ sung 50 g/l dịch chiết chuối môi trường phù hợp cho sinh trưởng phát tri ển Hồ Điệp so với mơi trường có bổ sung dịch chiết lại cà chua, nướ c dừa, casein hydrolase đối chứng Chất lượng in vitro môi trư ờng bổ sung dịch chiết chuối tốt loại dịch chiết khảo sát Giá thể dớn trắng loại giá thể cho ỉt lệ sống giai đoạn vườ n ươm cao nh ấ t so với loại giá thể lại dớn nâu dớ n nâu kết hợp với dớn trắng 5.2 Đề nghị Khảo sát ảnh hưởng loại dịch chiết peptone, gỗ bulô, khoai tây, lúa mạch, lúa mì loại dịch chiết khác lên khả nhân nhanh phôi tạo PLB từ phôi lan Hồ Điệp (P ambilis) Khảo sát loại môi trường rễ khác giúp có khả thích nghi chuyển vườn ươm Khảo sát hệ thống chiếu sáng đơn sắc giai đoạn hóa in vitro Tiếp tục khảo sát chế độ phân bón lên khả sinh trưởng phát triển giai đoạn vườn ươm 47 SVTH: Nguyễn Minh Nhật TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt Võ Văn Chi, Dương Đức Tiến , 1978 Phân loại thực v ật - Thực vật bậc cao NXB Đại học Trung học chuyên nghiệp Dương Công Kiên, 2002 Nuôi cấy mô thực vật NXB Đại học Quốc Gia - TP Hồ Chí Minh Dương Công Kiên, 2003 Nuôi cấy mô thực vật tập II NXB Đại học Quốc Gia -TP Hồ Chí Minh Dương Cơng Kiên, 2006 Ni cấy mơ tập III NXB Đại học Quốc Gia - TP Hồ Chí Minh Nguyễn Đức Lượng, Lê Thị Thủy Tiên, 2002 Công nghệ tế bào NXB Đại học Quốc Gia - TP Hồ Chí Minh Hồng Thị Sản, 2003 Phân loại học thực vật NXB Giáo Dục Dương Tấn Nhựt, 2007 Công nghệ sinh học thực vật tập NXB Nơng nghiệp TP Hồ Chí Minh Bùi Trang Việt (2000) Sinh lý thực vật đại cương, phần I: Dinh dưỡng NXB Đại học Quốc Gia - TP Hồ Chí Minh Bùi Trang Việt (2000) Sinh lý thực vật đại cương, phần II: Phát triển NXB Đại học Quốc Gia - TP Hồ Chí Minh Tài liệu tiếng Anh Arditti J., 1966 The effects of niacin, adenine, ribose and niacinamide coenzyme on germinating orchid seeds and young seedling American 35: 892 - 898 10 Agampodi V A and Jayawardena B., 2009 Effect of coconut (Cocos nucifera L.) water extracts on adventitious root development in vegetative propagation of Dracaena purplecompacta L Acta Physiol Plant 37: 279 - 284 11 Arditti J., 1968 Germination and growth of orchids on banana fruit tissue and some of its extracts American Orchid Society 37: 112 - 116 12 Chang J., Ding X Y., Bao S L., Liu D Y., He J., Tang F and Ding B Z., 2004 Studies on tissue culture of Dendrobium lituiflorum Zhongguo Zhong Yao Za Zhi 29: 313 - 317 13 Ichihashi S and Hiraiwa H., 1996 Effect of solidifier, coconut water, and carbohydrate source on growth of embryogenic callus in Phalaenopsis and allied genera Journal of Orchid Society 10: 81 - 88 14 Ichihashi S and Islam M O., 1999 Effects of complex organic additives on callus growth in three orchid genera, Phalaenopsis, Doritaenopsis and Neofinetia Journal of Japanese Society of Horticultural Science 68: 269 - 274 15 Ichihashi S., 1992 Micropropagation of Phalaenopsis through the culture of lateral buds from young flower stalks Lindleyana 7: 208 - 215 48 SVTH: Nguyễn Minh Nhật 16 Islam M O and Ichihashi, S., 1999 Effects of sucrose, maltose and sorbitol on callus growth and plantlet regeneration in Phalaenopsis, Doritaenopsis and Neofinetia Journal of Japanese Society of Horticultural Science 68: 1124 - 1131 17 Islam M O., Rahman A R M M., Matsui S., Prodhan A K M A., 2004 Effects of complex organic extracts on callus growth and PLB regeneration through embryogenesis in the Doritaenopsis orchid JARQ 37: 229 - 235 18 Khalifah R A., 1966a Gibberellin-like substances from the developing banana fruit Zeitschrift für Pflanzenphysiol 76: 280 - 283 19 Khalifah R A., 1966b Indolyl-3-acetic acid from the developing banana Nature 212: 1471 - 1472 20 Knudson L., 1946 A nutrient for germination of orchid seeds Orchid Society 15: 214 - 217 21 Lo S F., Nalawade S M., Kuo C L., Chen C L and Tsay H S., 2004 Asymbiotic germination of immature seeds, plantlet development and ex vitro establishment of plants of Dendrobium tosaense Makino- amedicinally important orchid In Vitro Cellular Developmental Biology - Plant 40: 528 - 535 22 Somporn P., Rosemina A., 2009 Effect of Additive Substances and Planting Substrate on Growth Development of Aerides houlletiana Rchb f.Seedling by Tissue Culture KKU Science Journal 37: 320 - 324 23 Tawaro S., 2005 Tissue Culture and Gene Transformation in Cymbidium findlaysonianum Lindl Orchid Master of Science Thesis, Walailak university, Nakhon Sri Thammarat, Thailand 24 Vyas S., Guha S., Bhattacharya M., and Rao I U., 2009 Rapid regeneration of plants of Dendrobium lituiflorum Lindl (Orchidaceae) by using banana extract Scientia Horticulturae 121: 32 - 37 49 SUMMARY EFFECT OF SOME MEDIUM FACTORS ON GROWTH, DEVELOPMENT AND QUALITY OF PHALAENOPSIS AMBILIS Up to date, Phalaenopsis amabilis is difficult to propagate by traditional methods In vitro propagation technologies in Phalaenopsis such as flower stalk-derived shoot, in vitro leaf segment-derived PLB, PLB multiplication via transverse thin section were succeeded, but multiplication rate of Phalaenopsis spp was still low Commercial orchid tissue culture holds value only if large number of plantlets is produced in a short period time and with minimum input expenses Hence, the time taken for plant regeneration becomes a crucial factor as far as economy of production for orchid commerce is concerned The use of expensive plant growth regulators can be cut down by replacing them with low cost natural additives that form a natural source of minerals as well as amino acids, vitamins, sugar and growth substances In this study, rapid propagation of embryo of Phalaenopsis, embryo formed PLB, shoot regeneration from PLB, effect of organic extract on growth and development were investigated MS medium supplemented with mg/l BA, 0.5 mg/l NAA, 30 g/l sucrose, g/l actived charcoal, 20% coconut water, pH 5.7 was optimum media culture for rapid propagation embryo P amabilis Vacin-Went medium supplemented with mg/l BA, 0.5 mg/l NAA, 30 g/l sucrose, g/l actived charcoal, 20% coconut water, pH 5.7 was optimum media culture for shoot regeneration from PLB P amabilis Among these, four extract (tomato, banana, coconut water, casein hydrolase), banana used at 50 g/l was the most suitable for growth and development of P.amabilis Planting substrate is an important for transplantation Seedling in Sphagnum Moss was more suitable than the other substrate After transfer to conditions greenhouse the plants showed 78.5% survival These results were basal for detail study of culture condition optimum in rapid propagation of this valuable orchid PHỤ LỤC Thành phần mơi trường khống Murashige Skoog (1962) Khống đa lượng mg l-1 mM NH NO KNO CaCl 2H O Mg SO 7H O KH PO 1650 1900 440 370 170 20,6 18,8 3,0 1,5 1,25 Khoáng vi lượng mg l-1 µM KI H BO MnSO 4H O ZnSO 7H O Na MoO 2H O CuSO 5H O CoCl 6H O Na EDTA FeSO 7H O 0,83 6,2 22,3 8,6 0,25 0,025 0,025 37,3 27,8 5,0 100 100 30 1,0 0,1 0,1 100 100 Vitamin chất hữu khác myo-Inositol Nicotinic acid Pyridoxine HCl Thiamine HCl Glycine 100 0,5 0,5 0,1 2,0 555 2,5 0,3 27 ... MỤC CHỮ VIẾT TẮT 2iP : N 6-( 2-isopentyl) adenine BA : 6-benzyl aminopurine NAA : α-naphthalenacetic acid IAA : 3-indol acetic acid IBA : 3-indole butyric acid Kinetin : 6-furfuryl aminopurine GA... IAA, IBA, 2,4-D, NAA Công thức hoá học NAA CH2 - COOH NAA 2.3.2 Cytokinin Gồm số loại như: kinetin (6-furfuryl aminopurine), 2iP (hay IPA), N6(2-isopentyl) adenine, BA (hay BAP, 6-benzyl aminopurine),... (3–indole acetic acid), IBA (3–indole butyric acid), 2,4-D (2,4-dichlorophenoxy acetic acid), NAA (α-naphthaleneacetic acid) SVTH: Nguyễn Minh Nhật + Đặc tính auxin: kích thích tăng trưởng kéo