NGHIÊN CỨU THU NHẬN BIOSURFACTANT TỪ VI KHUẨN bacillus subfilis

TỔNG LIÊN ĐOÀN LAO ĐỘNG VIỆT NAM TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÔN ĐỨC THẮNG KHOA KHOA HỌC ỨNG DỤNG  LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU THU NHẬN BIOSURFACTANT TỪ VI KHUẨN Bacillus subtilis Ngành : CÔNG NGHỆ SINH HỌC GVHD : TS TRẦN HOÀNG NGỌC ÁI SVTH : CHU NGỌC THÙY DUNG Niên khóa : 2007 - 2012 TP HỒ CHÍ MINH 06/2012 i TỔNG LIÊN ĐỒN LAO ĐỘNG VIỆT NAM TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÔN ĐỨC THẮNG KHOA KHOA HỌC ỨNG DỤNG ************ NGHIÊN CỨU THU NHẬN BIOSURFACTANT TỪ VI KHUẨN Bacillus subtilis Giáo viên hướng dẫn Sinh viên thực TS Trần Hoàng Ngọc Ái Chu Ngọc Thùy Dung Thành Phố Hồ Chí Minh 06/2012 ii LỜI CẢM ƠN Tôi xin chân thành cảm ơn - Ban Giám hiệu trường Đại Học Tôn Đức Thắng, ban chủ nhiệm Khoa Khoa Học Ứng Dụng Bộ Môn Công nghệ sinh học ,cùng tất quý thầy cô truyền đạt kiến thức cho tơi suốt q trình học trường - TS Trần Hồng Ngọc Ái hết lịng hướng dẫn, giúp đỡ tơi suốt thời gian hồn thành luận văn tốt nghiệp - Các cô phụ trách phịng thí nghiệm trường Đại Học Tơn Đức Thắng tận tình giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi cho thời gian làm luận văn tốt nghiệp - Các bạn làm luận văn tốt nghiệp đợt tháng 3/2012 phịng thí nghiệm trường Đại Học Tơn Đức Thắng hỗ trợ, giúp đỡ thời gian thực luận văn tốt nghiệp Sinh viên thực Chu Ngọc Thùy Dung iii TÓM TẮT Chu Ngọc Thùy Dung, Trường Đại Học Tôn Đức Thắng TP Hồ Chí Minh Đề tài nghiên cứu “ Nghiên cứu thu nhận biosurfactant từ vi khuẩn Bacillus subtilis”, thực phịng thí nghiệm Cơng nghệ sinh học trường Đại Học Tôn Đức Thắng từ 12/03/2012 đến 28/06/2012 GVHD : TS Trần Hoàng Ngọc Ái Đối tượng nghiên cứu vi khuẩn Bacillus subtilis Chất hoạt hóa bề mặt ứng dụng nhiều công nghiệp sống Tuy nhiên đa số chất hoạt hóa bề mặt sử dụng chất hoạt hóa bề mặt hóa học, việc sử dụng chất hoạt hóa bề mặt sinh học cịn hạn chế Trong đó,chất hoạt hóa bề mặt sinh học có nhiều ưu điểm chất hoạt hóa bề mặt hóa học rẻ tiền hơn,ít độc hại…Vì tơi nghiên cứu đề tài mong muốn chất hoạt hóa bề mặt sinh học phát triển ứng dụng rộng rãi tương lai Kết thu Phân lập, xác định chủng Bacillus subtilis từ đất Khảo sát ảnh hưởng điều kiện nuôi cấy đến khả tạo biosurfactant vi khuẩn Bacillus subtilis Nhiệt độ thời gian tối ưu 30oC,72 Khảo sát môi trường nuôi cấy đến khả tạo biosurfactant vi khuẩn Bacillus subtilis Môi trường tối ưu môi trường có bổ sung 2% dầu hỏa , 2% urea, 40g/l glucose, pH = iv MỤC LỤC Lời cảm ơn iii Tóm tắt iv Mục lục v Danh sách chữ viết tắt ix Danh sách bảng x Danh sách sơ đồ x Danh sách hình xi Chương 1: Mở Đầu 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục đích đề tài 1.3 Yêu cầu đề tài Chương : Tổng Quan 2.1Giới thiệu biosurfactant 2.1.1Giới thiệu kháiquát biosurfactant 2.1.2 Tính chất 2.1.2.1 Tính thấm ướt 2.1.2.2 Khả tạo bọt 2.1.2.3 Khả hòa tan 2.1.2.4 Khả hoạt hóa bề mặt 2.1.2.5 Khả nhũ hóa 2.1.3 Ưu điểm biosurfactant 2.1.4 Các nhóm biosurfactant 2.1.5 Các yếu tố ảnh hưởng tới khả sản xuất biosurfactant 2.1.5.1 Nguồn carbon 2.1.5.2 Nguồn Nitơ 2.1.5.3 Các yếu tố khác 2.1.6 Ứng dụng biosurfactant 2.2 Sơ lược B subtilis 11 v 2.2.1 Lịch sử phát 11 2.2.2 Tìm hiểu vi khuẩn Bacillus subtilis 11 2.2.2.1 Đặc điểm phân loại 11 2.2.2.2 Đặc điểm phân bố 11 2.2.2.3 Đặc điểm hình thái 11 2.2.2.4 Đặc điểm sinh hóa 12 2.2.2.5 Bào tử khả tạo bào tử vi khuẩn Bacillus subtilis 12 2.2.2.5.1Cấu tạo bào tử 12 2.2.2.5.2.Khả tạo bào tử 13 Chương 3: Nội dung phương pháp nghiên cứu 14 3.1 Thời gian địa điểm thực đề tài 14 3.2 Vật liệu thí nghiệm 14 3.2.1 Đối tượng khảo sát 14 3.2.2 Thiết bị dụng cụ thí nghiệm 14 3.2.2.1 Thiết bị 14 3.2.2.2 Dụng cụ 14 3.2.2.3 Môi trường nuôi cấy 14 3.2.2.4 Hóa chất 14 3.2.3 Nội dung nghiên cứu 15 3.3 Phương pháp thực đề tài 15 3.3.1 Phân lập vi khuẩn Bacillus subtilis từ đất 15 3.3.1.1 Cách lấy mẫu đất để phân lập Bacillus subtilis 15 3.3.1.2 Phương pháp phân lập vi khuẩn Bacillus subtilis 15 3.3.1.3 Khảo sát đặc điểm sinh học vi khuẩn phân lập 16 3.3.2 Tối ưu hóa điều kiện tao biosurfactant 17 3.3.2.1 Tăng sinh vi khuẩn Bacillus subtilis môi trường Nutrient Broth 17 3.3.2.2 Khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ đến khả tạo biosurfactant 17 3.3.2.3 Khảo sát ảnh hưởng pH đến khả tạo biosurfactant… 18 3.3.2.4 Khảo sát thời gian nuôi cấy tối ưu 18 3.3.2.5 Khảo sát ảnh hưởng nguồn hydrocarbons đến khả tạo biosurfactant 19 vi 3.3.2.6 Khảo sát ảnh hưởng nguồn Nitơ đến khả tạo biosurfactant 19 3.3.2.7 Khảo sát ảnh hưởng nguồn Carbon đến khả tạo biosurfactant 19 3.3.2.8 Khảo sát ảnh hưởng hàm lượng nguồn carbon tối ưu đến khả tao biosurfactant 20 3.3.2.9 Khảo sát tăng trưởng khả tạo biosurfactant vi khuẩn Bacillus subtilis nuôi môi trường tối ưu hóa 20 3.3.3 Phương pháp xác định sinh khối 21 3.3.3.1 Phương pháp đếm khuẩn lạc 21 3.3.3.2 Phương pháp đo độ đục 22 3.3.4 Phương pháp thu nhận biosurfactant thô 23 3.3.5 Xác định hoạt động nhũ tương hóa 24 Chương 4: Kết luận thảo luận 24 4.1 Khảo sát đặc điểm vi khuẩn Bacillus subtilis 24 4.1.1 Quan sát đặc điểm khuẩn lạc nghi ngờ Bacillus subtilis 24 4.1.2 Khảo sát đặc điểm sinh hóa chủng vi khuẩn nghi ngờ Bacillus subtilis 25 4.2 Đồ thị chuẩn xác định mật độ tế bào 27 4.3 Điều kiện môi trường tối ưu tạo biosurfactant 28 4.3.1 Kết khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ đến khả tạo biosurfactant 28 4.3.2 Kết khảo sát ảnh hưởng pH đến khả tạo biosurfactant 29 4.3.3 Kết khảo sát thời gian nuôi cấy 30 4.3.4 Kết khảo sát ảnh hưởng nguồn Hydrocarbons đến khả tạo biosurfactant 31 4.3.5 Kết khảo sát ảnh hưởng nguồn Nitơ đến khả tạo biosurfactant 32 4.3.6 Kết khảo sát ảnh hưởng nguồn Carbon đến khả tạo biosurfactant 33 vii 4.3.7 Kết khảo sát nồng độ nguồn carbon tối ưu 34 4.4 Sự tăng trưởng khả tạo biosurfactant vi khuẩn Bacillus subtilis nuôi môi trường tối ưu hóa 35 4.5 Xác định hoạt động nhũ tương hóa 36 Chương 5: Kết luận kiến nghị 38 Kết luận 38 Kiến nghị 38 Tài liệu tham khảo 39 Phụ lục viii DANH SÁCH CHỮ VIẾT TẮT CHHBM : Chất hoạt hóa bề mặt CHHBMHH : Chất hoạt hóa bề mặt hóa học CHHBMSH : Chất hoạt hóa bề mặt sinh học B subtilis : Bacillus subtilis DANH SÁCH SƠ ĐỒ Tên Trang Sơ đồ 3.1: Phân lập vi khuẩn Bacillus subtilis từ đất 16 Sơ đồ 3.2 Định danh vi khuẩn Bacillus subtilis 17 Sơ đồ 3.3: Các bước thu nhận biosurfactant thô 23 ix DANH SÁCH CÁC BẢNG Bảng 2.1 Các phản ứng sinh hóa B subtilis 12 Bảng 4.1 Kết thử phản ứng sinh hóa chủng phân lập 25 Bảng 4.2 Ảnh hưởng nhiệt độ nuôi cấy lên khả sinh trưởng tạo biosurfactant 28 Bảng 4.3 Ảnh hưởng pH môi trường nuôi cấy lên khả sinh trưởng tạo biosurfactant 29 Bảng 4.4 Ảnh hưởng thời gian nuôi cấy lên khả sinh trưởng tạo biosurfactant 30 Bảng 4.5 Ảnh hưởng nguồn hydrocarbons lên khả sinh trưởng tạo biosurfactant 31 Bảng 4.6 Ảnh hưởng nguồn Nitơ lên khả sinh trưởng tạo biosurfactant 32 Bảng 4.7 Ảnh hưởng nguồn Carbon lên khả sinh trưởng tạo biosurfactant 33 Bảng 4.8 Ảnh hưởng hàm lượng glucose lên khả sinh trưởng tạo biosurfactant 34 Bảng 4.9 Sự tăng trưởng khả tạo biosurfactant vi khuẩn Bacillus subtilis phân lập từ nguồn khác ni mơi trường tối ưu hóa 35 Bảng 4.10 Kết đo độ đục ống đối chứng ống nghiệm có cho biosurfactant thu ni vi khuẩn Bacillus subtilis phân lập từ đất, bơ, viên men môi trường điều kiện tối ưu 36 x 4.3.5 Kết khảo sát ảnh hưởng nguồn Nitơ đến khả tạo biosurfactant Bảng 4.6 Ảnh hưởng nguồn Nitơ lên khả sinh trưởng tạo biosurfactant Thời gian (giờ) Log số lượng tế bào (N/ml) Biosurfactant (mg/l) casein hydrolysate casein yeast extract hydrolysate urea 0 0 72 659 734 678 urea yeast extract 6.382 6.382 6.382 9.034 9.647 9.149 Ảnh hưởng nguồn nito đến khả tạo biosurfactant hàm lượng biosurfactant(mg/l) 740 720 700 680 660 640 620 casein hydrolysate Urea yeast extract Hình 4.8 Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng nguồn Nitơ đến khả tạo biosurfactant chủng vi khuẩn Bacillus subtilis Theo kết bảng 4.6 hình 4.8 urea nguồn nitơ thích hợp cho khả tạo biosurfactant vi khuẩn 32 4.3.6 Kết khảo sát ảnh hưởng nguồn Carbon đến khả tạo biosurfactant Bảng 4.7 Ảnh hưởng nguồn Carbon lên khả sinh trưởng tạo biosurfactant Log số lượng tế bào (N/ml) Biosurfactant (mg/l) Thời gian (giờ) glucose sucrose glycerol glucose sucrose glycerol 0 0 6.349 6.349 6.349 72 639 536 568 9.365 8.949 8.774 hàm lượng biosurfactant(mg/l) Ảnh hưởng nguồn carbon đến khả tạo biosurfactant 660 640 620 600 580 560 540 520 500 480 glucose sucrose glycerol Hình 4.9 Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng nguồn Carbon đến khả tạo biosurfactant chủng vi khuẩn Bacillus subtilis Theo kết bảng 4.7 hình 4.9 glucose nguồn carbon thích hợp cho khả tạo biosurfactant vi khuẩn 33 4.3.7 Kết khảo sát nồng độ nguồn carbon tối ưu Theo kết khảo sát 4.2.6 glucose nguồn carbon tối ưu cho phát triển tạo biosurfactant vi khuẩn Ta tiếp tục khảo sát hàm lượng glucose bổ sung vào mơi trường để tìm hàm lượng tối ưu cho phát triển tạo biosurfactant vi khuẩn Bacillus subtilis phân lập từ đất Bảng 4.8 Ảnh hưởng hàm lượng glucose lên khả sinh trưởng tạo biosurfactant Biosurfactant (mg/l) Log số lượng tế bào (N/ml) Thời gian (giờ) 25g/l 30g/l 35g/l 40g/l 45g/l 25g/l 30g/l 35g/l 40g/l 45g/l 0 0 72 603 636 641 731 6.330 6.330 6.330 6.330 6.330 698 8.915 8.736 9.551 9.666 9.737 Ảnh hưởng hàm lượng glucose đến khả tạo biosurfactant hàm lượng biosurfactant(mg/l) 800 700 600 500 400 300 200 100 25g/l 30g/l 35g/l 40g/l 45g/l hàm lượng glucose Hình 4.10 Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng hàm lượng glucose bổ sung vào môi trường đến khả tạo biosurfactant vi khuẩn Bacillus subtilis Theo kết bảng 4.8 hình 4.10 hàm lượng glucose thích hợp cho khả tạo biosurfactant vi khuẩn 40g/l 34 4.4 Sự tăng trưởng khả tạo biosurfactant vi khuẩn Bacillus subtilis nuôi môi trường tối ưu hóa Dựa theo kết khảo sát ta xác định điều kiện tối ưu môi trường nuôi cấy tối ưu Điều kiện nuôi cấy tối ưu để vi khuẩn Bacillus subtilis sinh trưởng tạo biosurfactant nhiều thời gian 72 giờ, nhiệt độ 30oC Môi trường nuôi cấy tối ưu để vi khuẩn Bacillus subtilis sinh trưởng tạo biosurfactant nhiều mơi trường có bổ sung 40g/l glucose, 2% urea, 2% dầu hỏa, pH = Bảng 4.9 Sự tăng trưởng khả tạo biosurfactant vi khuẩn Bacillus subtilis phân lập từ nguồn khác nuôi môi trường tối ưu hóa Log số lượng tế bào (N/ml) Biosurfactant (mg/l) Thời gian (giờ) Đất Bơ Viên men Đất Bơ Viên men 0 0 6.438 6.438 6.438 72 2036 1239 574 11.500 9.439 8.777 Khả tạo biosurfactant từ vi khuẩn Bacillus subtilis phân lập từ nguồn khác hàm lượng biosurfactant(mg/l) 2500 2000 1500 1000 500 Đất Bơ Men viên Nguồn phân lập vi khuẩn Bacillus subtilis Hình 4.11 Khả tạo biosurfactant từ vi khuẩn Bacillus subtilis phân lập từ nguồn khác 35 Các chủng Bacillus subtilis chọn để khảo sát chủng phân lập từ nguồn đất, phân lập từ men viên (là chủng phân lập được), phân lập từ bơ (bạn Thảo Ly phân lập được) Kết bảng 4.9 hình 4.11 cho thấy chủng Bacillus subtilis phân lập từ đất tạo nhiều biosurfactant Môi trường đất dùng để phân lập đất nhiễm nhiều dầu thô… Để sử dụng nguồn hydrocarbon mơi trường đất vi khuẩn phải tạo chất hoạt động bề mặt để nhũ hóa dầu Vi khuẩn tiếp xúc với dầu tiết enzym để chuyển hóa thành chất sử dụng được.Chính mà vi khuẩn phân lập từ đất có khả tạo biosurfactant nhiều 4.5 Xác định hoạt động nhũ tương hóa Bảng 4.10 Kết đo độ đục ống đối chứng ống nghiệm có cho biosurfactant thu nuôi vi khuẩn Bacillus subtilis phân lập từ đất, bơ, viên men môi trường điều kiện tối ưu Ống đối chứng 0.647 Nguồn phân lập vi khuẩn Bacillus subtilis Đất Bơ Viên men 0.987 0.806 0.723 Ống đối chứng gồm có dầu hỏa đệm Tris-Mg phân thành lớp rõ ràng Khi cho biosurfactant vào biosurfactant làm giảm sức căng bề mặt, ống nghiệm khơng cịn phân lớp rõ ràng mà có hòa tan dầu hỏa vào đệm Tris-Mg, xuất bọt màu trắng (hiện tượng nhũ hóa dầu) Độ đục ống nghiệm có cho biosurfactant cao ống đối chứng Do vi khuẩn Bacillus subtilis phân lập từ đất thu nhiều biosurfactant nên độ đục ống cao Bacillus subtilis phân lập từ bơ cuối Bacillus subtilis phân lập từ men viên (hình 4.12) 36 Hình 4.12 Một số hình ảnh hoạt động nhũ tương hóa biosurfactant thu nuôi vi khuẩn Bacillus subtilis phân lập từ đất, bơ, viên men môi trường điều kiện tối ưu 37 Chương 5: Kết luận kiến nghị Kết luận Phân lập chủng Bacillus subtilis từ đất Điều kiện nuôi cấy tối ưu để vi khuẩn Bacillus subtilis sinh trưởng tạo biosurfactant nhiều thời gian 72 giờ, nhiệt độ 30oC Môi trường nuôi cấy tối ưu để vi khuẩn Bacillus subtilis sinh trưởng tạo biosurfactant nhiều mơi trường có bổ sung 40g/l glucose, 2% urea, 2% dầu hỏa, pH = Lượng biosurfactant cao thu 2036 g/l nuôi cấy vi khuẩn Bacillus subtilis phân lập từ đất điều kiện môi trường tối ưu Xác định hoạt động nhũ tương hóa biosurfactant thu Kiến nghị Chỉ phân lập chủng Bacillus subtilis Cần chọn thêm nhiều nguồn để phân lập thêm nhiều chủng Bacillus subtilis để lựa chọn xem chủng có khả tạo biosurfactant nhiều Cần khảo sát thêm điều kiện nuôi cấy ảnh hưởng đến khả tạo biosurfactant vi khuẩn Bacillus subtilis Thử nghiệm nhiều loại môi trường sản xuất khác để có mơi trường thích hợp cho vi khuẩn Xác định thêm số tính chất biosurfactant thu độ bền… Sử dụng biosurfactant thu vào số ứng dụng thực tế khác 38 Tài liệu tham khảo Phạm Thành Hổ, 2006 Nhập môn công nghệ sinh học, , NXBGD http://tailieu.vn/xem-tai-lieu/chat-hoat-dong-be-mat.321180.html http://kilobooks.com Đánh giá khả tạo CHHBMSH chủng vi khuẩn phân lập từ mùn khoan dầu khí Vũng Tàu ảnh hưởng chúng lên khả phân huỷ dầu TỔNG QUAN VỀ CHẤT HOẠT ĐỘNG BỀ MẶT Đặng Ngọc Phương Uyên, 2007 Phân lập chủng vi khuẩn Bacillus subtilis từ đất có khả đối kháng mạnh với E coli gây bệnh tiêu chảy heo nhằm ứng dụng sản xuất probiotic chăn nuôi, LVTN, Trường Đại học Nông Lâm TP.HCM Tơ Minh Châu, 2000 Giáo trình thực tập vi sinh vật học Tủ sách trường Đại học Nông Lâm TP.HCM Lý Kim Hữu, 2005 Khảo sát đặc điểm vi khuẩn Bacillus subtilis tìm hiểu điều kiện ni cấy thích hợp sản xuất thử nghiệm chế phẩm Probiotic LVTN, khoa Chăn nuôi thú y Trường Đại học Nông Lâm TP.HCM Lê Đỗ Mai Phương, 2004 Phân lập giám định vi khuẩn Bacillus subtilis tự nhiên, bước đầu khảo sát khả sinh enzyme amylase enzyme protease LVTN, trường Đại học Mở Bán Công TP.HCM http://tailieu.vn/xem-tai-lieu/luan-van-phan-lap-vi-khuan-bacillus-subtilis-tudat-va-khao-sat-tinh-doi-khang-voi-vi-khuan-e-col.670770.html Trần Linh Thước, 2005 Phương pháp phân tích vi sinh vật, , NXBGD 39 Phụ Lục Phương pháp nhuộm Gram Các bước tiến hành : Phết canh khuẩn lên miếng lam Cố định mẫu cách hơ qua đèn cồn Đặt giấy lọc lên vết phết vi khuẩn Nhuộm crystal violet phút Rửa nước, thấm khô Đặt giấy lọc lên vết phết vi khuẩn Cố định màu lugol phút Rửa nước, thấm khô Tẩy cồn 960 khoảng 15 giây Rửa nước, thấm khô Đặt giấy lọc lên vết phết vi khuẩn Nhuộm màu dung dịch Fuchsine kiềm lỗng Rửa nước, thấm khơ Xem kính hiển vi với độ phóng đại 1000 lần (vật kính dầu)[9] Thử phản ứng sinh hóa 2.1 Khả lên men đường maltose Chuẩn bị: Môi trường đường: maltose Giống vi khuẩn Bacillus subtilis Ống nghiệm, ống Durham Cách làm: cho vào ống nghiệm có sẵn mơi trường đường ống Durham hấp khử trùng 1210C/15 phút Sau cấy vi khuẩn vào mơi trường ủ 370C/24 Quan sát đổi màu sinh Nếu vi khuẩn có khả lên men đường, chuyển đường thành rượu, rượu lên men thành acid làm pH môi trường giảm, chuyển màu môi trường 40 Kết quả: Phản ứng (-): mơi trường có màu hồng đỏ Phản ứng (+): mơi trường có màu vàng 2.2 Thử phản ứng Catalase Chuẩn bị: Dung dịch H2O2 30% Lame Giống vi khuẩn Bacillus subtilis Cách làm: dùng pipette lấy vi khuẩn, phết lên lame kính khơ Sau nhỏ giọt H2O2 30% lên vết vi khuẩn Đọc kết sau khoảng 15 giây Kết quả: Phản ứng (-): khơng có tượng sủi bọt Phản ứng (+): có tượng sủi bọt 2.3 Thử phản ứng VP (Voges Proskauer) Chuẩn bị: Giống vi khuẩn Bacillus subtilis Môi trường Clark lubs α - naphtol 10%, NaOH 40% Cách làm: cấy vi khuẩn vào môi trường Clark lubs, ni nhiệt độ 370C/24 Sau nhỏ - giọt NaOH 40% - giọt α - naphtol 10% Sau 15 phút đọc kết Kết quả: Phản ứng VP (-): môi trường có màu vàng Phản ứng VP (+): mơi trường có màu đỏ 2.4 Thử phản ứng MR (Methyl - Red) Chuẩn bị: Môi trường Clark lubs Thuốc thử Methyl Red Giống vi khuẩn Bacillus subtilis Cách làm: Dùng que cấy vịng lấy vi khuẩn cấy vào mơi trường Clark lubs, ni nhiệt độ 370C/24 Sau nhỏ - giọt thuốc thử Methyl Red vào canh khuẩn đọc 41 Kết quả: Phản ứng MR (-): môi trường có màu vàng Phản ứng MR (+): mơi trường có màu đỏ 2.5 Thử phản ứng khử Nitrate (NO3) Chuẩn bị: Môi trường Nitrate Dung dịch thuốc thử Giess A, Giess B Giống vi khuẩn Bacillus subtilis Cách làm: Dùng que cấy thẳng lấy vi khuẩn cấy sâu vào môi trường thạch nitrate, nuôi nhiệt độ 370C/24 Sau 24 nhỏ vào môi trường - giọt Giess A, sau nhỏ tiếp - giọt Giess B Kết quả: Phản ứng (-): môi trường có màu vàng Phản ứng (+): mơi trường có màu đỏ 2.6 Thử khả sử dụng Citrate Chuẩn bị: Môi trường Citrate Giống vi khuẩn Bacillus subtilis Cách làm: cấy vi khuẩn vào môi trường Citrate Nuôi nhiệt độ 370C/24 Kết quả: Phản ứng (-): môi trường có màu xanh mạ non Phản ứng (+): mơi trường có màu xanh dương 2.7 Phản ứng lecithinase Chuẩn bị Mơi trường lịng đỏ trứng Giống vi khuẩn Bacillus subtilis Tiến hành: Dùng que cấy vòng, thao tác vơ trùng lấy cấy sinh khối vi khuẩn cấy lên đĩa mơi trường lịng đỏ trứng, ủ đĩa 370C/24 42 Kết Dương tính: có vịng xung quanh khuẩn lạc Âm tính: khơng có vịng xung quanh khuẩn lạc [9] Các mơi trường nuôi cấy 3.1 Môi trường Nutrient Broth Thành phần: Nutrient Broth 13g/l Nước cất Cách pha : Pha 13g Nutrient Broth lít nước cất Cho vào erlen 250 ml Hấp khử trùng 1210C 15 phút 3.2 Môi trường Trypticase Soya Agar (TSA) Cân 30 g bột môi trường TSA + 18 g agar cho vào 1000 ml nước cất, đun sơi cho hịa tan Đem hấp khử trùng nhiệt độ 1210C/ 15 phút 3.3 Môi trường lên men đường maltose Thành phần: Cao thịt 5g Pepton bột 10g Đường maltose 10g Phenol red 0,01g Nước cất 1000ml pH = 6,7 - 7,1 Hấp khử trùng 121oC 15 phút 3.4 Môi trường Simmons Citrate Agar Thành phần Sodium citrate 2g K2PO4 1g MgSO4 0,2g Brothynol blue 0,008g NaCl 5g NH4H2PO4 1g Agar 15g Nước cất 1000ml 43 3.5 Môi trường khử nitrate Cao thịt 3g Pepton bột 5g NaNO3 1g Agar 7g Nước cất 1000ml pH = 7,0 ± 0,2 3.6 Môi trường lòng đỏ trứng Cao thịt 1g Pepton bột 10g Mannitol 10g NaCl 10g Phenol Red 0,0025g Agar 15g Nước cất 1000ml pH = 7,2 ± 0,2 Phân 225ml môi trường vào bình tam giác Khử trùng 121oC, 15 phút Khi môi trường nguội đến 50oC thêm 12,5 ml dung dịch lòng đỏ trứng gà Trộn phân vào đĩa petri vơ trùng Cách pha dung dịch lịng đỏ trứng: rửa trứng, sát trùng bên trứng cồn Dùng kẹp đập trứng, bỏ phần lòng trắng, chuyển phần lịng đỏ vào bacher có chứa 25 - 30ml nước muối sinh lý vô trùng Bảo quản dung dịch 40C để dùng 3.7 Môi trường Clark Lubs Pepton bột 7g Glucose 5g KH2PO4 5g Nước cất 1000ml pH = 6,7 - 7,1 44 Hóa chất 4.1 Nước muối sinh lý ‰ NaCl 9g Nước cất 1000ml 4.2 HCl 1% HCl đđ 10ml Nước cất 1000ml 4.3 NaOH 1% NaOH đđ 10ml Nước cất 1000ml 4.4 NaOH 40% NaOH 40g Nước cất 1000ml Cân 40g NaOH tinh thể hòa vào 50ml nước cất, lắc đều, để yên sau 24 giờ, gan lấy nước rooig bổ sung thêm nước cất cho đủ 1000ml 4.5 Thuốc thử chất thị màu 4.5.1 Thuốc thử catalase Dung dịch 3% H2O2 (Hydogen peroxide) 4.5.2 Thuốc thử methyl red Methyl Red 0,1g Ethanol 95% 300ml Nước cất (vừa đủ) 500ml Hòa tan đỏ methyl vào 300ml ethanol Thêm nước cất vào cho đủ 500ml 4.5.3 Thuốc thử α-naphton 10% α-naphton 10g Cồn 960 vừa đủ 100ml 4.5.4 Thuốc thử xác định khả khử nitrate Giess A: Axit sunfanilis 0,5g Axit acetic 30ml Nước cất 100ml 45 Giess B: α-naphhthylamin 0,8g Axit acetic 30ml Nước cất 100ml Hịa tan 0,8g α-naphhthylamin 100 ml nước đun sơi để nguội bổ sung thêm 30ml axit acetic, đem lọc Đựng chai màu, bảo quản tủ lạnh để sử dụng 4.6 Thuốc nhuộm 4.6.1 Crystal violet (tím kết tinh) a Crystal violet 0,4g Cồn 96 10ml b Phenol 1g Nước cất 100ml Trộn hai dung dịch a b lại với nhau, khuấy cho tan đem lọc Dung dịch thuốc nhuộm bảo quản chai màu để tránh ánh sáng 4.6.2 Lugol KI 2g Iod tinh thể 1g Nước cất 300ml Hoà 2g KI vào 5ml nước , sau thêm 1g Iod,chờ cho Iod tan hết thêm nước cất vừa đủ 300ml 4.6.3 Fuschine kiềm loãng a Fuschine kiềm 0,3g Cồn 96o 10ml b Phenol 5g Nước cất 35ml Trộn dung dịch a với dung dịch b cho hoà tan Đem bảo quản chai màu 46 ... Hiện tượng làm cho bề mặt dung dịch chất tẩy rửa tăng lên Khả tạo bọt độ bền bọt phụ thuộc vào cấu tạo chất đó, nồng độ, nhiệt độ dung dịch, độ pH hàm lượng ion Ca2+, Mg2+ dung dịch chất tẩy rửa... hỗ trợ, giúp đỡ thời gian thực luận văn tốt nghiệp Sinh viên thực Chu Ngọc Thùy Dung iii TÓM TẮT Chu Ngọc Thùy Dung, Trường Đại Học Tơn Đức Thắng TP Hồ Chí Minh Đề tài nghiên cứu “ Nghiên cứu... subtilis 12 2.2.2.5.1Cấu tạo bào tử 12 2.2.2.5.2.Khả tạo bào tử 13 Chương 3: Nội dung phương pháp nghiên cứu 14 3.1 Thời gian địa điểm thực đề tài 14 3.2 Vật liệu