NGHIÊN CỨU THU NHẬN VÀ CÓ ĐỊNH ENZYME PROTEASE TỪ ASPERGILLUSORYZAE

TỔNG LIÊN ĐỒN LAO ĐỘNG VIỆT NAM ĐẠI HỌC TƠN ĐỨC THẮNG KHOA KHOA HỌC ỨNG DỤNG KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU THU NHẬN VÀ CỐ ĐỊNH ENZYME PROTEASE TỪ ASPERGILLUS ORYZAE Giảng viên hướng dẫn: Sinh viên thực hiện: ThS NGÔ MINH NHÃ NGUYỄN THỊ KIỀU TRINH Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 1/2011 LỜI CẢM ƠN Trong suốt năm học tập trường Đại học Tôn Đức Thắng, đến lúc em hoàn thành chương trình học tập để bắt đầu giai đoạn Để đạt kết ngày hôm thiếu quan tâm gia đình nhà trường.Vì vậy, lời tri ân em xin gởi đến cha mẹ, người luôn quan tâm lo lắng cho em mặt vật chất lẫn tinh thần Em xin gởi lời cảm ơn chân thành sâu sắc đến cô Ngô Minh Nhã thầy Bùi Anh Võ, thầy cô nhiệt tình hướng dẫn trực tiếp, truyền đạt kiến thức tạo điều kiện thuận lợi để em thực đề tài Qua đây, em xin gởi lời cảm ơn đến quý thầy cô khoa Khoa học ứng dụng tận tình trang bị kiến thức tạo điều kiện để em hồn thành khóa học Cảm ơn phụ trách phịng thí nghiệm tạo điều kiện sở vật chất, máy móc, thiết bị để em hồn thành đề tài Cuối cùng, xin cảm ơn tất bạn bè động viên, giúp đỡ suốt thời gian qua Sinh viên thực Nguyễn Thị Kiều Trinh MỤC LỤC CHƯƠNG MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục đích 1.3 Ý nghĩa đề tài CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Tổng quan enzyme - 2.1.1 Định nghĩa enzyme 2.1.2 Bản chất enzyme 2.1.3 Tính chất enzyme 2.1.4 Các yếu tố ảnh hưởng vận tốc phản ứng enzyme xúc tác 2.2 Enzyme cố định 2.2.1 Định nghĩa - 2.2.2 Tính chất ưu nhược điểm enzyme cố định 2.2.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt độ enzyme cố định 2.2.4 Các phương pháp cố định enzyme 2.2.5 Vật liệu cố định enzyme - 11 2.2.6 Ứng dụng enzyme cố định 14 2.2.7 Tình hình nghiên cứu enzyme cố định nước 15 2.3 Enzyme protease - 17 2.3.1 Định nghĩa enzyme protease 17 2.3.2 Phân loại enzyme protease - 18 2.3.3 Nguồn thu nhận enzyme protease - 19 2.3.4 Ứng dụng enzyme protease - 23 2.4 Tổng quan nấm mốc Aspergillus oryzae 26 2.4.1 Khái quát nấm mốc Aspergillus oryzae 26 2.4.2 Sinh tổng hợp enzyme protease Aspergillus oryzae - 27 CHƯƠNG NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Thời gian địa điểm - 31 3.1.1 Thời gian - 31 3.1.2 Địa điểm 31 3.2 Vật liệu 31 3.2.1 Nguồn gốc mẫu thí nghiệm 31 3.2.2 Nguyên liệu 31 3.2.3 Hóa chất 31 3.2.4 Dụng cụ thiết bị 31 3.3 Sơ đồ nghiên cứu 33 3.4 Quy trình thu nhận cố định enzyme - 34 3.5 Phương pháp nghiên cứu - 35 3.5.1 Phương pháp giữ giống 35 3.5.2 Phương pháp cấy giống 35 3.5.3 Thu nhận CPE từ canh trường Aspergillus oryaze - 36 3.5.4 Xác định hàm lượng protein theo phương pháp Bradford - 37 3.5.5 Xác định hoạt độ protease theo phương pháp Anson cải tiến - 40 3.5.6 Cố định enzyme protease natri alginate phương pháp nhốt - 42 3.6 Phương pháp xử lý số liệu 43 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Xây dựng đường chuẩn albumin 44 4.2 Xây dựng đường chuẩn Tyrosin - 44 4.3 Xác định hàm lượng protein hoạt độ protease dịch lọc enzyme 45 4.4 Xác định hàm lượng protein hoạt độ protease chế phẩm enzyme 45 4.5 Hiệu suất thu nhận chế phẩm enzyme protease từ canh trường Aspergillus oryzae -46 4.6 Hiệu suất hoạt độ CPE so với canh trường ban đầu 46 4.7 Độ tinh chế phẩm enzyme protease 47 4.8 Khảo sát nồng độ natri alginate để cố định enzyme 47 4.9 Khả tái sử dụng enzyme cố định - 48 CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1 Kết luận - 50 5.2 Kiến nghị - 50 TÀI LIỆU THAM KHẢO DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 2.1 Cấu trúc phân tử Natri alginate 12 Hình 2.2 Cấu trúc phân tử protease - 17 Hình 2.3 Cây đu đủ - 20 Hình 2.4 Vi khuẩn Bacillus subtilis 21 Hình 2.5 Nấm mốc Penicillium - 22 Hình 2.6 Xạ khuẩn Streptomyces fradiae 22 Hình 2.7 Nấm mốc Aspergillus oryzae - 26 Hình 2.8 Cấu tạo nấm mốc - 26 Hình 3.1 Giữ giống ống nghiệm - 35 Hình 3.2 Erlen chứa sinh khối nấm mốc Aspergillus oryzae 36 DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 3.1 Bố trí thí nghiệm dựng đường chuẩn albumin - 39 Bảng 3.2 Số liệu xác định hoạt độ enzyme protease - 41 Bảng 4.1 Sự biến đổi giá trị ∆OD theo nồng độ albumin chuẩn 44 Bảng 4.2 Sự biến đổi giá trị ∆OD theo nồng độ Tyrosin chuẩn 44 Bảng 4.3 Hàm lượng protein hoạt độ enzyme protease dịch lọc enzyme 45 Bảng 4.4.Hàm lượng protein hoạt độ enzyme protease chế phẩm enzyme thô tủa cồn 960 - 46 Bảng 4.5 Hiệu suất thu nhận chế phẩm enzyme protease từ canh trường - 47 Bảng 4.6 Hiệu suất hoạt độ CPE so với canh trường ban đầu 47 Bảng 4.7 Độ tinh CPE protease 47 Bảng 4.8 Khảo sát nồng độ natri alginate để cố định enzyme protease - 48 Bảng 4.9 Kết hoạt độ protease enzyme cố định - 48 Bảng 4.10 Hoạt độ enzyme protease qua lần tái sử dụng - 49 DANH MỤC ĐỒ THỊ Đồ thị 4.1 Đường chuẩn albumin - 44 Đồ thị 4.2 Đường chuẩn Tyrosin 45 Đồ thị 4.3 Nồng độ natri alginate để cố định enzyme protease 48 Đồ thị 4.4 Hoạt độ enzyme protease qua lần tái sử dụng 49 DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT HđR : Hoạt độ riêng AU : Độ hấp thu OD : Optical density CPE : Chế phẩm enzyme TCA : Trichloacetic acid UI : Đơn vị hoạt tính CBB : Coomasie Brillant Blue PGA : Potato glucose agar mg Pro : milligram protein CT : Canh trường pHopt : pH tối ưu CHƯƠNG MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề Ngày nay, với phát triển mạnh mẽ Công nghệ sinh học, chế phẩm enzyme sản xuất nhiều sử dụng hầu hết lĩnh vực như: chế biến thực phẩm, nông nghiệp, chăn nuôi, y tế… Hàng năm lượng enzyme sản xuất giới đạt khoảng 300.000 với giá trị 500 triệu USD, phân phối lĩnh vực khác Khoảng 75% chế phẩm enzyme thủy phân sử dụng cho việc thủy phân chất tự nhiên Protease enzyme sử dụng nhiều số ngành sản xuất như: chế biến thực phẩm (đông tụ sữa làm phomat, làm mềm thịt, bổ sung để làm tăng chất lượng sản phẩm sản xuất bia, xử lý phế phụ phẩm chế biến thực phẩm…), sản xuất chất tẩy rửa, thuộc da, y tế, nông nghiệp Protease phân bố thực vật, động vật, vi sinh vật Tuy nhiên nguồn enzyme vi sinh vật phong phú nhất, có hầu hết vi sinh vật vi khuẩn (Bacillus subtilis, B.mesentericus, B.thermorpoteoliticus) số giống thuộc chi Clostridium, nấm mốc (Aspergillus Oryzae, A.terrcola, A.fumigatus, A.saitoi, Penicillium chysogenum) xạ khuẩn (Streptomyces grieus, S.fradiae, S.trerimmosus) Hiện nay, việc nâng cao hiệu suất sử dụng enzyme protease quan tâm Phương pháp cố định enzyme hướng nghiên cứu nhằm nâng cao hiệu suất sử dụng enzyme Bằng cách cố định enzyme chất mang khơng tan nước, enzyme tách khỏi chất cách dễ dàng sau phản ứng Thêm vào enzyme cố định tái sử dụng nhiều lần khắc phục tình trạng khan enzyme Với lý nêu trên, tiến hành nghiên cứu tách chiết enzyme protease từ nấm mốc Aspergillus oryzae cố định lên chất mang natri alginate để nâng cao hiệu suất sử dụng enzyme 1.2 Mục đích Thu nhận, cố định enzyme protease từ nấm mốc Aspergillus oryzae lên chất mang natri alginate 1.3 Ý nghĩa đề tài Thu nhận enzym protease từ nấm mốc Aspergillus oryzae Cố định enzyme protease chất mang natri alginate khảo sát khả tái sử dụng enzyme cố định sóng 595 nm Độ hấp thu bước sóng 595nm có liên hệ cách trực tiếp với nồng độ protein So với phương pháp xác định protein phương pháp có độ nhạy cao xác định tới 1µg, hóa chất đơn giản tốn thời gian Một ưu điểm lớn phương pháp bị cản trở hóa chất sử dụng nghiên cứu protein, amonium sulfate Phẩm màu Coomassie Blue làm tan ethanol chai đựng màu tối có nắp Bổ sung phosphric acid chỉnh tới 100ml nước cất Lắc đều, giữ 40C 3.5.4.2 Hóa chất thiết bị - Dung dịch albumin chuẩn: Cân xác 10mg albumin pha ml nước cất Lắc cho tan Giữ 200C, dùng pha loãng 100 lần, dung dịch albumin có nồng độ 0.1 mg/ml - Dung dich thuốc thử Bradford: Coomassie Brillant Blue : 0.001 g Ethanol 990 : 4.7 g Acid phosphoric : 8.5 g Phẩm màu Coomassie Brillant Blue làm tan ethanol chai đựng có nắp, bổ sung acid phosphoric 85 % chỉnh tới 100ml nước cất - Máy so màu 3.5.4.3 Tiến hành a Xây dựng đường chuẩn: Lấy ống nghiệm đánh theo số thứ tự 0, 1, 2, 3, 4, Bổ sung thành phần vào ống nghiệm theo bảng sau: Ông số Nước cất (ml) 0.9 0.8 0.7 0.6 0.5 Dung dịch albumin 0.1 mg/ml (ml) 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 Dung dịch thuốc thử Bradford (ml) 2 2 2 Nồng độ albumin (μg/ml) 10 20 30 40 50 Tiến hành hai lơ thí nghiệm, lô sáu ống nghiệm đánh số theo thứ tự 38 Bảng 3.1 Bố trí thí nghiệm dựng đường chuẩn albumin Thí nghiệm1 0a 1a 2a 3a 4a 5a Thí nghiệm2 0b 1b 2b 3b 4b 5b Dùng đồng hồ bấm giây, canh thời gian phút, cho ml thuốc thử Braford vào ống nghiệm 0a Lắc đều, để yên Ở thời điểm phút, cho ml dung dịch thuốc thử vào ống nghiệm 0b Lắc đều, để yên Thực việc bổ sung 5ml dung dịch thuốc thử vào ống 1a, 1b, …5a, 5b thời điểm cách phút Đến thời điểm 11 phút, cho ml dung dịch thuốc thử vào ống 5b Lắc đều, để yên Tính thời gian ống 0a 20 phút , tiến hành đo độ hấp thu dung dịch bước sóng 595 nm (OD595 nm ) Tính thời gian ống 0b 21 phút, tiến hành đo OD595 bước sóng 595 nm Tuần tự tiến hành đo OD595 ống lại thời điểm cách phút Đến thời điểm 31 phút tiến hành đo ống 5b Lấy giá trị trung bình hai ống a b Lấy OD595 ống thử thật (có protein) trừ OD595 ống thử khơng (khơng có protein) ∆OD595 Vẽ đường tuyến tính nồng độ protein (µg/ml) với mật độ ∆OD595 b Mẫu thí nghiệm Việc đo mẫu tiến hành tương tự với thời gian cho phản ứng 20 phút Mẫu đo với thể tích cho OD595 đo nằm khoảng OD595 đường chuẩn Từ lượng protein tính dung dịch đem đo, suy tổng lượng protein có 100g nguyên liệu ban đầu c Cách tính Tổng hàm lượng protein dịch mơi trường tính theo cơng thức mg protein = a.10-3 n.V a: nồng độ protein mẫu suy từ đường chuẩn ( µg/ml ) n: hệ số pha lỗng V: tích dịch chiết từ 100g nguyên liệu ban đầu 39 3.5.5 Xác định hoạt độ enzyme protease theo phương pháp Anson cải tiến.[5] 3.5.5.1 Nguyên tắc Cho protease tác dụng với casein, sau kết tủa protein dư TCA, xác định sản phẩm tạo thành phản ứng màu với thuốc thử Folin Biễu diễn hoạt tính đơn vị hoạt độ Một đơn vị hoạt độ lượng enzyme phút 300C phân giải lượng protein tương đương với μmol tyrosin 3.5.5.2 Dụng cụ hóa chất a Dụng cụ Ống nghiệm Ống hút 1ml, 2ml, 3ml, 10ml Máy quang phổ Cốc 50ml, 100ml, 250ml Bình định mức 100ml b Hóa chất Dung dịch Na2HPO4 1/15M: hòa tan 5,9690g Na2HPO4.12 H2O nước cất vừa đủ 250 ml Dung dịch K2HPO4 1/15M: hòa tan 0,9072g K2HPO4 nước vừa đủ 100ml Dung dịch đệm Sorensen 1/15M, pH 7,6: trộn chung 177ml dung dịch Na2HPO4 1/15M 23 ml dung dịch K2HPO4 1/15M Dung dịch Casein 1%: đun sôi cách thủy 1g casein dung dịch đệm Sorensen thấy tan hoàn toàn định mức lại cho đủ 100ml Dung dịch TCA 5%: hòa tan 5g TCA nước cất cho đủ 100ml Dung dịch NaOH 0,5N: hòa tan 10g NaOH nước cất cho đủ 50ml Thuốc thử Folin ( pha loãng với nước cất theo tỷ lệ 1: 3) Dung dịch HCl 0,2N: trộn 4.25ml HClđđ với nước cho đủ 250ml Dung dịch Tyrosin 20Mm/l: khuấy nghiền 1,8119g Tyrosin dung dịch HCl 0,2N vừa đủ 500ml 40 Dung dịch Tyrosin chuẩn 1Mm/l dung dịch HCl 0.2N: pha loãng 5ml dung dịch Tyrosin 20Mm/l dung dịch HCl 0,2N thành 100ml 3.5.5.3 Tiến hành a Dựng đường chuẩn Tyrosin Thực ống nghiệm bảng sau: Ống nghiệm Tyrosin chuẩn (ml) 0.2 0.4 0.6 0.8 HCl 0,2N (ml) 4.8 4.6 4.4 4.2 NaOH 0,5N (ml) 10 10 10 10 10 10 Thuốc thử Folin (ml) 3 3 3 Lắc mạnh sau 10 phút đo OD bước sóng 660nm.Ống số ống thử khơng (TK), ống cịn lại ống thí nghiệm (TT).Vẽ đường chuẩn Tyrosin tương quan lượng Tyrosin (µM) ∆OD (∆OD = ODTT – ODTK) Dựng đường chuẩn tyrosin biểu diễn tương quan lượng tyrosin hiệu số OD b Mẫu thí nghiệm Bảng 3.2 Số liệu xác định hoạt độ enzyme protease Ống nghiệm Dung dịch hóa chất Dung dịch Casein 1% (ml) 5 Dung dịch TCA 5% (ml) 10 Dung dịch enzyme mẫu (ml) 1 Lắc giữ 35,50C Dung dịch TCA 5% (ml) 10 Để yên 30 phút, lọc lấy dịch bên Lấy ống nghiệm mới, sạch, chia thành hai lô, lô hai ống để lấy trung bình đánh dấu A B Cho vào ống A 5ml dịch lọc từ ống nghiệm cho vào ống B 5ml dịch lọc từ ống nghiệm 41 Thêm vào ống 10 ml NaOH 0,5N 3ml thuốc thử Folin, lắc mạnh, sau 10 phút đo OD bước sóng 660nm Tính ∆OD = ODTT – ODTK Dựa vào đồ thị chuẩn suy µM Tyrosin c Cách tính Định nghĩa đơn vị Anson : đơn vị Anson lượng enzyme tối thiểu điều kiện chuẩn (35,50C, pH 7,6…) thủy phân Casein phút tạo thành sản phẩm hòa tan TCA, phản ứng với thuốc tử Folin cho ta độ hấp thu OD bước sóng 660 nm tương ứng với µM Tyrosin đường chuẩn Hđ P = µM Tyrosin.V L / t m v (UI) V: tổng thể tích hỗn hợp ống nghiệm (ml) v: thể tích dịch lọc đem phân tích (ml) t: thời gian thủy phân (phút) m: khối lượng mẫu enzyme đem xác định hoạt tính (g) L: độ pha lỗng mẫu enzyme µM Tyrosin: lượng µM Tyrosin v (ml) suy từ đường chuẩn 3.5.6 Cố định enzyme protease natri alginate phương pháp nhốt.[6] 3.5.6.1 Khảo sát nồng độ natri alginate Tạo dung dịch natri alginate nồng độ 1%, 2%, 3% cách cân 0,5g, 1g, 1,5g natri alginate hòa vào 50 ml dung dịch đệm phosphat pH Khuấy đến tất natri alginate hòa tan hoàn toàn 3.5.6.2 Tiến hành cố định Cân 0,5 g enzyme protease hòa tan dung dịch natri alginate nồng độ pha Dùng ống xilanh có đầu kim tiêm (0,3mm), hút dung dịch enzyme hòa tan này, nhỏ từ độ cao 20cm vào 200ml dung dịch 0,02M CaCl2 với khuấy liên tục để tạo gel Quá trình tạo gel xảy nhiệt độ phòng Sau cố định, dùng giấy lọc, lọc enzyme cố định Kết thu hạt enzyme protein nhốt khn gel 42 Hình 3.3: Hạt enzyme cố định 3.5.6.3 Khảo sát khả tái sử dụng Kết thúc thí nghiệm xác định hoạt tính lần 1, rửa enzyme cố định lại nước cất thu lại hạt enzyme cố định Lặp lại thí nghiệm hoạt tính enzyme cố định giảm xuống 50% so với hoạt tính enzyme cố định lần 3.6 Phương pháp xử lý số liệu Sử dụng phần mềm Excel phương pháp thống kê để xử lý số liệu 43 CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Xây dựng đường chuẩn albumin Tiến hành lập đường chuẩn mục 3.6.3.3 Kết trình bày bảng 4.1 Bảng 4.1 Sự biến đổi giá trị ∆OD theo nồng độ albumin chuẩn Ống Lượng albumin 10 20 30 40 50 µg ∆OD (A0) 0,103 0,196 0,282 0,395 0,494 Từ số liệu bảng, ta xây dựng đường chuẩn albumin với phương trình OD y=0.0098x - 0.0001, R2=0.9687 OD 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 -0.1 y = 0.0098x - 0.0001 R2 = 0.9988 10 20 30 40 50 60 Hàm Hàm lượnglượng Albumin (g/ml) album in Đồ thị 4.1 Đường chuẩn albumin 4.2 Xây dựng đường chuẩn Tyrosin Tiến hành lập đường chuẩn mục 3.6.3.4 Kết trình bày bảng 4.2 Bảng 4.2 Sự biến đổi giá trị ∆OD theo nồng độ Tyrosin chuẩn Ống Lượng Tyrosin 10 20 30 40 50 µmol ∆OD (A0) 0,027 0,049 0,0815 0,1005 0,119 Từ số liệu bảng, ta xây dựng đường chuẩn Tyrosin với phương trình y = 0,1211x+0.0023, R2 = 0,993 44 OD OD y = 0.1211x + 0.0023 R2 = 0.993 0.14 0.12 0.1 0.08 0.06 0.04 0.02 0 0.5 1.5 Nồng độ Tyrosin (mol/ml) Tyrosin Đồ thị 4.2 Đường chuẩn Tyrosin 4.3 Xác định hàm lượng protein hoạt độ protease dịch lọc enzyme Chiết enzyme từ 100g chế phẩm enzyme thô Dịch chiết thu đem xác định hàm lượng protein hoạt độ protease theo mục 3.6.3 3.6.4 Tổng hàm lượng protein tổng hoạt độ protease 100g chế phẩm quy đổi thành hàm lượng hoạt độ 100g chế phẩm Bảng 4.3 Hàm lượng protein hoạt độ enzyme protease dịch chiết enzyme thô Hàm lượng protein Hoạt độ enzyme protease (mg pr/g canh trường) (UI-g canh trường) 8,59 13,01 Nhận xét: Sau tiến hành trích ly enzyme protease khỏi canh trường nấm mốc Aspergillus oryzae ta xác định hàm lượng protein là: 8,59 (mg pr/g canh trường), hoạt độ enzyme protease là: 13,01(UI-g canh trường) 4.4 Xác định hàm lượng protein hoạt độ protease chế phẩm enzyme Chiết enzyme từ chế phẩm enzyme thô theo mô tả mục 3.6.1, dịch chiết tủa với cồn 960 Ly tâm để thu tủa, cặn tủa đem sấy nhiệt độ < 400C Lấy chế phẩm enzyme sau sấy đem xác định hàm lượng protein hoạt độ protease theo mục 3.6.3 3.6.4 Kết trình bày bảng 4.4 45 Bảng 4.4 Hàm lượng protein hoạt độ enzyme protease chế phẩm enzyme thô tủa cồn 960 Hàm lượng protein Hoạt độ protease (mg pr/g canh trường) (UI-g canh trường) 14,03 26,52 Nhận xét: Khi dùng cồn 960 để tủa enzyme với tỷ lệ 3:1 ta thu enzyme với hoạt độ cao Khi thể tích dung mơi tăng dần hoạt tính dung mơi tăng theo, phân tử dung mơi hỗn hợp tách thu kết tủa tốt, chúng tách hết lớp phân tử nước bao xung quan phân tử protein làm tăng khả kết tủa Nếu tiếp tục tăng nồng độ cồn lúc số điện môi giảm phân tử protein tự tháo gỡ trở thành khơng hoạt động, hoạt tính giảm theo Kết thu hàm lượng protein là: 14,03 (mg pr/g canh trường), hoạt độ enzyme protease là: 26,52 (UI-g canh trường) 4.5 Hiệu suất thu nhận chế phẩm enzyme protease từ canh trường Aspergillus oryzae Từ khối lượng canh trường đem nuôi cấy nấm mốc khối lượng chế phẩm enzyme thu sau sấy Kết tính hiệu suất thu chế phẩm enzyme trình bày bảng 4.5 Bảng 4.5 Hiệu suất thu nhận chế phẩm enzyme protease từ canh trường Aspergillus oryzae Khối lượng canh Khối lượng chế Hiệu suất thu chế trường (g) phẩm enzyme (g) phẩm enzyme (%) 300 3,4667 1,16 Nhận xét: Dựa vào bảng 4.5 ta thấy, hiệu suất thu chế phẩm enzyme 1,16% Để nâng cao hiệu suất thu hồi chế phẩm enzyme cần tạo điều kiện thuận lợi cho nấm mốc Aspergillus oryzae phát triển như: thành phần môi trường dinh dưỡng, điều kiện nuôi cấy 46 4.6 Hiệu suất hoạt độ CPE so với canh trường ban đầu Dựa vào kết hoạt độ enzyme canh trường hoạt độ enzyme chế phẩm thu Kết tính hiệu suất hoạt độ CPE so với canh trường ban đầu trình bày bảng 4.6 Bảng 4.6 Hiệu suất hoạt độ CPE so với canh trường ban đầu Hoạt độ Hoạt độ Hiệu suất hoạt độ (UI /g CT) (UI /g CPE) (%) 13,03 26,52 203,8 Hoạt độ CPE tăng so với hoạt độ canh trường ban đầu dùng tác nhân tủa cồn để loại bớt thành phần enzyme protease nên hoạt độ tăng lên 4.7 Độ tinh CPE protease Dựa vào kết thu hoạt độ riêng canh trường hoạt độ riêng chế phẩm Kết tính độ tinh trình bày bảng 4.7 Bảng 4.7 Độ tinh CPE protease Hoạt độ riêng canh Hoạt độ riêng CPE Độ tinh trường (UI /mg pr) (UI /mg pr) (lần) 1,51 1,89 1,25 Sau bước tinh sạch, protein enzyme protease bị loại nên hoạt độ riêng tăng lên, chế phẩm có độ cao 4.8 Khảo sát nồng độ natri alginate để cố định enzyme Sau tiến hành cố định enzyme natri alginate nồng độ 1%, 2%, 3% theo mục 3.5.7.1 Thu hạt enzyme cố định đem xác định hoạt độ theo phương pháp Anson cải tiến Kết trình bày bảng 4.8 47 Bảng 4.8 Khảo sát nồng độ natri alginate để cố định enzyme protease Hoạt độ protease (%) (UI) 17,3 18,93 15,27 Hoạt độ protease (UI) Nồng độ natri alginate 20 15 10 0 Nồng độ natri alginate(%) Đồ thị 4.3 Nồng độ natri alginate để cố định enzyme protease Nhận xét: Từ kết cho thấy, nồng độ natri alginate 2% ta thu hạt enzyme có hoạt độ cao 18,93 UI Ở nồng độ này, khả tiếp xúc chất enzyme lớn nhất, bị cản trở chất mang natri alginate nên hoạt độ protease enzyme cố định cao Nên chọn nồng độ để sử dụng cho thí nghiệm 4.9 Khả tái sử dụng enzyme cố định Enzym sau cố định gel natri alginate 2% đem xác định hoạt độ protease theo mục 3.6.4 Kết hoạt độ protease enzyme cố định trình bày bảng 4.9 Bảng 4.9 Kết hoạt độ protease enzyme cố định Hàm lượng protein Hoạt độ protease Hoạt độ riêng (mg pr) (UI) (UI/mg protein) 14,03 18,93 1,34 48 Dựa vào bảng kết ta thấy hoạt độ riêng enzyme cố định thấp hoạt độ riêng enzyme ban đầu Điều giải thích hạn chế khả tiếp xúc enzyme với chất làm cho hoạt độ enzyme cố định giảm so với enzyme ban đầu Kết khảo sát số lần tái sử dụng trình bày bảng 4.10 Bảng 4.10 Hoạt độ enzyme protease qua lần tái sử dụng Số lần tái Hoạt độ protease Hoạt độ riêng sử dụng (UI) (UI/mg protein) Lần1 14,93 1,064 Lần 12,95 0,923 Lần 8,05 0,573 Lần 6,95 0,495 Lần 5,78 0,411 Hoạt độ protease 20 15 10 0 Số lần tái sử dụng Đồ thị 4.4 Hoạt độ enzyme protease qua lần tái sử dụng Nhận xét: Việc tái sử dụng enzyme cố định đặc tính quan trọng enzyme cố định Tuy nhiên, qua lần tái sử dụng hoạt tính enzyme bị giảm so với hoạt tính ban đầu enzyme cố định Sự giảm hoạt tính enzyme cố định phụ thuộc nhiều yếu tố Qua bảng kết quả, hoạt tính enzyme cố định natri alginate giảm nhiều so với ban đầu, hiệu suất tái sử dụng khơng cao chất natri alginate bền với nhiệt độ điều kiện phản ứng 49 CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1 Kết luận Qua trình nghiên cứu phương pháp trình bày trên, với kết thu được, đưa kết luận: - Dịch chiết enzyme thô thu chiết nước cất kết thu là: hàm lượng protein là: 8,59 (mg/g chế phẩm); hoạt độ protease là: 13,01(UIg canh trường) - Chế phẩm enzyme sau trích ly có: hàm lượng protein là: 14,03(mg/g chế phẩm); hoạt độ protease là: 26,52 (UI-g chế phẩm) - Hoạt độ enzyme cố định thấp hoạt độ enzyme ban đầu, cụ thể là: hoạt độ enzyme ban đầu: 26,52 (UI-g chế phẩm), hoạt độ enzyme cố định là: 18,93 (UI) - Sau lần tái sử dụng, hoạt độ enzyme giảm đáng kể, hoạt độ lại là: 5,78 (UI) 5.2 Kiến nghị Với kết thu trên, hiểu số vấn đề enzyme protease, cụ thể enzyme protease nấm mốc Aspergillus oryzae Tuy nhiên, điều kiện thời gian có hạn nên nghiên cứu đề tài phạm vi giới hạn nêu Nếu có điều kiện mở rộng hướng nghiên cứu đề tài sau: - Nghiên cứu nuôi cấy nấm mốc môi trường nuôi cấy khác như: môi trường bã đậu nành, môi trường cám bắp… - Sử dụng số tác nhân để tủa dịch chiết enzyme như: acetone, muối (NH4)2SO4… - Sử dụng số vật liệu để cố định enzyme như: chitosan, kaolin… - Nghiên cứu điều kiện bảo quản thời gian bảo quản enzyme cố định - Nghiên cứu ứng dụng protease sinh tổng hợp từ canh trường nuôi cấy nấm mốc Aspergillus oryzae lĩnh vực như: sản xuất phomat, sản xuất nước mắm, sản xuất loại thịt hộp 50 TÀI LIỆU THAM KHẢO Nguyễn Trọng Cẩn (chủ biên), Nguyễn Thị Hiền, Đỗ Thị Giang, Trần Thị Luyến, 1998, Công nghệ enzyme, NXB Nông Nghiệp – Tp HCM 2.GS TSKH Phạm Thị Trân Châu, PGS.TS Phan Tuấn Nghĩa, 2006, Công nghệ sinh học tập enzym ứng dụng, NXB Giáo Dục Phạm Thị Trân Châu, Trần Thị Áng, Hóa sinh học, NXB Giáo Dục Lâm Thị Kim Châu, Văn Đức Chín, Ngơ Đại Nghiệp, Thực tập lớn sinh hóa, NXB Đại học Quốc Gia Tp HCM Phạm Thị Ánh Hồng, 2003, Kỹ thuật sinh hóa, NXB Đại học Quốc Gia Tp HCM Nguyễn Đức Lượng, 2004, Công nghệ enzym, NXB Đại học Quốc Gia Tp HCM Nguyễn Đức Lượng, Công nghệ sinh học, NXB Đại học Quốc Gia Tp HCM Nguyễn Đức Lượng, Công nghệ vi sinh tập 2, NXB Đại học Quốc Gia Tp HCM Nguyễn Tiến Thắng, 2004, Giáo trình công nghệ enzyme, Tủ sách trường Đại học Nông Lâm Tp HCM 10 PSG.TS Đồng Thị Thanh Thu, Giáo trình sinh hóa bản,Tủ sách Đại học khoa học Tự Nhiên 11 Nguyễn Thị Hương Nhàn, 2009, Khóa luận tốt nghiệp: Khảo sát hoạt tính lypase thu nhận từ Aspergillus niger trước sau cố định natri alginate chitosan, NHD: TS Vũ Văn Độ, CN: Đỗ Thị Tuyến, Đại học Nông Lâm Tp.HCM 12 Nguyễn Thị Phương Thảo, 2006, Luận văn tốt nghiệp: Tìm điều kiện ni cấy nấm mốc Aspergillus oryzae để thu nhận enzym protease có khả đơng tụ sữa, NHD: Th.S Trương Phước Long, Đại học Tôn Đức Thắng 13 Hồ Minh Thương, 2008, Luận văn tốt nghiệp: Nghiên cứu ứng dụng enzyme protease sản xuất nước mắm ngắn ngày, NHD: Th.S Nguyễn Thị Cẩm Vi, Đại học Tôn Đức Thắng 14 Giáo trình Thí nghiệm cơng nghệ protein enzyme, Đại học Tôn Đức Thắng 15 Thực hành vi sinh đại cương, 2008, Đại học Tôn Đức Thắng 16.http://www.scribd.com/doc/39045286/protease-papain 17.http://www.huaf.edu.vn/diendan/viewtopic.php?f=186&t=5220 ... đậu nành : 5g 35 Chuẩn bị: - Điều chỉnh độ ẩm ban đầu từ 50% đến 60% - Phân phối môi trường vào erlen - Hấp khử trùng 1210C, 1atm 15 phút Để nguội - Lấy khoảng 0. 5-1 ml cho vào ống nghiệm có... phân tích - Có thể dừng phản ứng giai đoạn cần thi? ??t, cần tách enzyme cố định khỏi chất - Kéo dài thời gian bảo quản bền vững với chất kiềm hãm tác nhân gây biến tính so với enzyme hòa tan - Hoạt... Scouten Gerhartz có bốn phương pháp cố định enzyme: - Phương pháp liên kết enzyme với vật liệu cố định - Phương pháp hấp thụ vật lý - Phương pháp nhốt - Phương pháp khâu mạch 2.2.4.1 Phương pháp liên