NGHIÊN CỨU THU NHẬN ENZYME LIPASE TỪ VI KHUĂN Bacillus

TỔNG LIÊN ĐOÀN LAO ĐỘNG VIỆT NAM TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÔN ĐỨC THẮNG KHOA KHOA HỌC ỨNG DỤNG ***000*** LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU THU NHẬN ENZYME LIPASE TỪ VI KHUẨN Bacillus Giảng viên hướng dẫn: Sinh viên thực hiện: TS TRẦN HÒANG NGỌC ÁI NGUYỄN MAI THẢO LY Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 7/2012 LỜI CẢM ƠN Tôi xin chân thành cảm ơn: * Ban Giám hiệu trường Đại học Tôn Đức Thắng, Ban chủ nhiệm Khoa Khoa học ứng dụng Bộ Môn Công nghệ sinh học, tất quý thầy cô truyền đạt kiến thức cho tơi suốt q trình học trường * TS Trần Hòang Ngọc Ái hết lòng hướng dẫn, giúp đỡ suốt thời gian thực tập luận văn tốt nghiệp * Các thầy, cô quản lý phịng thí nghiệm Bộ mơn Cơng nghệ Sinh học tận tình giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi cho thời gian thực tập tốt nghiệp * Các bạn bè thân yêu lớp 07SH1D 07SH2D chia sẻ vui buồn thời gian học hết lòng hỗ trợ, giúp đỡ thời gian thực tập Sinh viên thực Nguyễn Mai Thảo Ly i TÓM TẮT NGUYỄN MAI THẢO LY, Đại Học Tôn Đức Thắng Tp Hồ Chí Minh Tháng 7/2012 “ NGHIÊN CỨU THU NHẬN ENZYME LIPASE TỪ VI KHUẨN Bacillus” Giảng viên hướng dẫn: TS TRẦN HÒANG NGỌC ÁI Ngày nay, enzyme sử dụng rộng rãi t rong công nghiệp đời sống Đặc biệt enzyme thuộc nhóm thủy phân protease, amylase, cellulase, lipase,…, lipase ứng đ thứ ba doanh thu tổng khối lượng bán hàng Lipase (EC 3.1.1.3) thuộc nhóm enzyme thủy phân có serine trung tâm hoạt động, xúc tác thủy giải liên kết ester triacylgly cerol Lipase thu nhận chủ yếu từ vi sinh vật: Candida, Aspergillus, Bacillus,… nhiên ất r cơng trình nghiên cứu lipase từ Bacillus subtilis Do đó, mục tiê u nghiên cứu đề tài khảo sát khả sinh tổng hợp lipase vi khuẩn Bacillus subtilis tìm điều kiện ni cấy thích hợp Đề tài thu kết sau: − Dựa đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa phân lập sơ chủng vi khuẩn Bacillus subtilis Khảo sát họat tính lipase chủng vi khuẩn môi trường chọn lọc chứa Tween 80 phân lập chủng vi khuẩn có khả sinh lipase, có ch ủng có đặc tính gần giống với Bacillus subtilis BB3( mẫu bơ), BM1 (Mỡ heo), BĐ2 (mẫu đậu hũ chiên), chọn chủng BB3 sinh lipase cao − Tìm điều kiện nuôi cấy tối ưu cho sinh tổng lợp lipase từ Bacillus là: Môi trường nuôi gồm: Nutrient broth + 1% dầu olive, 37°C, pH 7, lắc 220 vòng/phút thời gian ni cấy thích hợp cho họat tính lipase cao từ 48 đến 56 − Tổng hợp điều kiện tối ưu nuôi cấy chủng vi khuẩn BB3 bước đầu thu nhận chế phẩm enzyme lipase thô có họat tính riêng UI/mg protein enzyme Khảo sát khả ứng dụng enzyme lipase thu từ Bacillus BB3 thí nghiệm phân giải chất béo bã đậu nành cho thấy enzyme có khả phân giải chất béo đậu nành ii MỤC LỤC TRANG LỜI CẢM ƠN i TÓM TẮT ii MỤC LỤC iii DANH SÁCH CÁC HÌNH .vi DANH SÁCH CÁC BẢNG vi DANH SÁCH CÁC ĐỒ THỊ vii CHƯƠNG MỞ ĐẦU .1 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục đích đề tài 1.3 Nội dung đề tài CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Tổng quan enzyme lipase 2.1.1 Định nghĩa 2.1.2 Các nguồn thu nhận enzyme lipase 2.1.3 Phân lọai enzyme lipase vi sinh vật 2.1.4 Các đặc tính lý hóa lipase vi sinh vật 2.1.4.1 Cấu trúc khối lượng phân tử 2.1.4.2 Một vài đặc tính enzyme lipase .7 2.1.5 Cơ chế xúc tác tính đặc hiệu 2.1.5.1 Cơ chế xúc tác 2.1.5.2 Tính đặc hiệu lipase .10 2.1.6 Các yếu tố ảnh hưởng tới sinh tổng hợp lipase vi sinh vật 10 2.1.6.1 Ảnh hưởng thành phần môi trường dinh dưỡng 10 2.1.6.2 Ảnh hưởng điều kiện nuôi 11 2.1.7 Ứng dụng lipase 12 2.2 Giới thiệu Bacillus subtilis .14 2.2.1 Phân loại phân bố 14 iii 2.2.2 Đặc điểm hình thái 14 2.2.3 Đặc điểm sinh lý sinh hóa 16 2.2.4 Một số đặc tính lipase từ Bacillus sp .17 2.3 Giới thiệu probiotic 18 2.3.1 Định nghĩa .18 2.3.2 Cơ chế tác động .18 2.3.3 Yêu cầu chế phẩm sinh học .18 CHƯƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP .21 3.1 Thời gian địa điểm tiến hành thí nghiệm 21 3.1.1 Địa điểm 21 3.1.2 Thời gian 21 3.2 Nội dung nghiên cứu .21 3.3 Vật liệu thí nghiệm 21 3.3.1 Đối tượng nghiên cứu 21 3.3.2 Trang thiết bị thí nghiệm 21 3.3.3 Hóa chất mơi trường thí nghiệm 21 3.4 Phương pháp thí nghiệm .24 3.4.1 Phân lập tuyển chọn giống Bacillus subtilis có khả sinh lipase cao 24 3.4.1.1 Thu mẫu chuẩn bị mẫu 24 3.4.1.2 Sàn lọc vi khuẩn có khả sinh tổng hợp lipase 25 3.4.1.3 Phương pháp làm vi khuẩn .25 3.4.1.4 Phân lập vi khuẩn .25 3.4.2 Khảo sát khả sinh tổng hợp lipase Bacillus theo thời gian 26 3.4.3 Khảo sát yếu tố môi trường cảm ứng sinh tổng hợp lipase .27 3.4.4 Phương pháp thu nhận chế phẩm enzyme lipase thô .28 3.4.5 Phương pháp xác định họat tính lipase 28 3.4.6 Xác định hoạt tính riêng enzyme lipase 29 3.4.7 Xác định hàm lượng protein phương pháp Bradford 30 3.4.8 Xác định hàm lượng lipid thô bã đậu nành 31 3.5 Phương pháp xử lý số liệu .32 iv CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .33 4.1 Kết phân lập tuyển chọn Bacillus subtilis sinh lipase .33 4.1.1 Kết phân lập vi khuẩn Bacillus subtilis 33 4.1.2 Kết tuyển chọn Bacillus subtilis sinh lipase cao nh ất qui mơ thí nghiệm 36 4.2 Kết khảo sát họat tính lipase Bacillus subtilis chọn theo thời gian nuôi cấy 38 4.2.1 Xây dựng đường tương quan tuyến tính độ đục mật độ tế bào 38 4.2.2 Xác định đường cong tăng trưởng 39 4.2.3 Kết khảo sát họat tính lipase chủng Bacillus chọn theo thời gian nuôi cấy 40 4.3 Kết khảo sát điều kiện tối ưu để cảm ứng sinh tổng hợp lipase .41 4.3.1 Ảnh hưởng nhiệt độ nuôi cấy lên khả sinh tổng hợp lipase .41 4.3.2 Ảnh hưởng pH môi trường nuôi cấy lên khả sinh tổng hợp lipase 43 4.3.3 Ảnh hưởng nguồn chất cảm ứng môi trường nuôi cấy lên khả sinh tổng hợp lipase .44 4.4 Tổng hợp điều kiện tối ưu để thử nghiệm nuôi cấy, thu nhận chế phẩm enzyme lipase thô .46 4.4.1 Xác định hàm lượng protein họat tính lipase 47 4.4.2 Khảo sát khả ứng dụng enzyme lipase thu từ BB3 48 CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .50 5.1 Kết luận 50 5.2 Kiến nghị .50 TÀI LIỆU THAM KHẢO .52 PHỤ LỤC 55 v DANH SÁCH CÁC HÌNH Hình 2.1 - Mơ hình hoạt động lipase .7 Hình 2.2 - Cấu trúc không gian lipase Candida rugosa Hình 2.3 - Phản ứng thủy phân triacylglycerol enzyme lipase Hình 2.4 - Tế bào vi khuẩn B subtilis 15 Hình 2.5 - Khuẩn lạc B subtilis 15 Hình 4.1 - Hình thái khuẩn lạc chủng vi khuẩn môi trường TSA sau ngày nuôi cấy 35 Hình 4.2 - Các chủng vi sinh vật sinh lipase môi trường chọn lọc 36 DANH SÁCH CÁC BẢNG Bảng 2.1 - Một số nguồn thu nhận lipase .4 Bảng 2.2 - Các phản ứng sinh hóa Bacillus subtilis .16 Bảng 4.1 - Một số đặc điểm hình thái, sinh lý chủng BB3, BM1, BĐ2 34 Bảng 4.2 - Đặc điểm sinh hóa chủng BB3, BM1, BĐ2 .35 Bảng 4.3 - Kết xác định hoạt tính lipase chủng B subtilis 37 Bảng 4.4 - Kết đếm khuẩn lạc trị số OD 600nm 38 Bảng 4.5 - Sự gia tăng mật độ tế bào theo thời gian chủng BB3 39 Bảng 4.6 - Ảnh hưởng thời gian nuôi cấy đến sinh tổng hợp lipase chủng B subtilis (BB3) 40 Bảng 4.7 - Ảnh hưởng nhiệt độ nuôi cấy đến sinh tổng hợp lipase chủng B subtilis (BB3) 42 Bảng 4.8 - Ảnh hưởng pH môi trường đến sinh tổng hợp lipase chủng B subtilis ( BB3 ) .43 Bảng 4.9 - Ảnh hưởng nguồn chất cảm ứng đến sinh tổng hợp lipase chủng B subtilis (BB3) 45 Bảng 4.10 - Tương quan giá trị ΔOD 595 nồng độ albumin .47 Bảng 4.11 - Kết hàm lượng protein hoạt tính trước, sau tủa .48 vi DANH SÁCH CÁC ĐỒ THỊ Đồ thị 4.1 – Họat tính lipase chủng Bacillus phân lập .38 Đồ thị 4.2 - Đường tương quan tuyến tính độ đục mật độ tế bào 39 Đồ thị 4.3 - Đường cong tăng trưởng chủng BB3 40 Đồ thị 4.4 - Ảnh hưởng thời gian nuôi cấy lên khả sinh tổng hợp lipase chủng BB3 .41 Đồ thị 4.5 - Ảnh hưởng nhiệt độ nuôi cấy lên khả sinh tổng hợp lipase chủng BB3 42 Đồ thị 4.6 - Ảnh hưởng pH môi trường đến sinh tổng hợp lipase chủng BB3 44 Đồ thị 4.7 - Ảnh hưởng nguồn chất đến sinh tổng hợp lipase chủng BB3 45 Đồ thị 4.8 - Đường chuẩn albumin .47 vii CHƯƠNG 1.1 MỞ ĐẦU Đặt vấn đề Lipase (triacylglycerol acylhydrolase, EC 3.1.1.3) enzyme tham gia xúc tác cho phản ứng thủy phân thuận nghịch triacylglycerol (dầu thực vật, mỡ động vật) điều kiện bình thư ờng tạo thành glycerol acid béo tương ứng Bên cạnh hoạt tính thủy phân lipid, enzyme lipase cịn có hoạt tính thủy phân tổng hợp ester Ưu điểm lipase so với xúc tác hoá học khác phản ứng ơn hồ, khơng tốn lượng không tạo sản phẩm phụ Nguồn thu nhận lipase từ động vật, thực vật vi sinh vật, nhiên lipase từ vi sinh vật quan tâm tới nhiều Ngoài ưu điểm khác sản xuất nhanh, đơn giản, rẻ tiền, lipase từ số vi sinh vật nhiều ứng dụng cụ thể thay có tính đặc hiệu vị trí hay đặc hiệu chất Ứng dụng lipase đề cập tới nhiều công nghiệp thực phẩm, xử lý môi trường, sản xuất chất tẩy rửa, chất dinh dưỡng, mỹ phẩm… Trong y học, lipase bổ sung vào chế phẩm enzyme tiêu hoá chữa bệnh suy giảm chức đường tiêu hố Men tiêu hóa thể (chủ yếu từ ống tuyến tiêu hóa) tiết để tiêu hóa thức ăn (cắt nhỏ thức ăn thành phần tử nhỏ để hấp thu vào máu) như: amylase, pepsin, lipase dày Tuy nhiên men lipase dày có tác dụng yếu, tiêu hóa dạng chất béo đư ợc nhũ tương hóa (chất béo sữa, trứng), ruột non nhờ tác dụng xúc tác enzyme lipase dịch mật chất béo bị thuỷ phân thành acid béo glycerol hấp thụ vào thành ruột Vì hệ vi sinh đóng vai trị quan trọng đường tiêu hóa Ngày nay, dựa vào phát triển công nghiệp dược, người ta sản xuất chế phẩm vi sinh (men vi sinh) hỗ trợ tiêu hóa, cịn gọi probiotic, tùy thuộc vào loại sản phẩm mà thành phần có nhiều vi khuẩn có ích cần thiết cho hệ tiêu hóa như: Lactobacillus, Bacillus ssp… Trong loài vi khuẩn khác thuộc giống Bacillus Bacillus subtilis tập trung nhiều vi khuẩn có lợi phổ biến tự nhiên, chúng sống nhiều loại môi trường khác nhau, có khả phát triển nhanh Quan trọng Bacillus subtilis có hệ enzyme ngoại bào phong phú, nhiều enzyme số có tác dụng hỗ trợ tốt cho tiêu hóa Các dịng vi khuẩn Bacillus subtilis khơng mang gene gây độc cho người thú, trình hình thành bào tử Bacillus subtilis nghiên cứu cách chi tiết, đồng thời nghiên cứu gần cho thấy bào tử Bacillus subtilis có khả nảy mầm phần đầu ruột non Điều làm cho việc nghiên cứu Bacillus subtilis để sản xuất probiotic đẩy mạnh Trên giới Việt Nam có nhiều cơng trình nghiên cứu lipase từ vi sinh vật đ ạt thành tựu đáng kể Tuy nhiên nghiên cứu enzyme lipase Bacillus subtilis cịn 1.2 Mục đích đề tài Vì việc nghiên cứu lipase giống Bacillus đề tài nhằm tìm kiếm nguồn giống, tìm hiểu khả sinh tổng hợp lipase vi khuẩn Bacillus subtilis làm tiền đề cho nghiên cứu đặc điểm lipase Bacillus ứng dụng vào việc sản xuất chế phẩm sinh học (probiotic) 1.3 Nội dung đề tài - Phân lập, tuyển chọn giống Bacillus có khả sinh lipase cao qui mơ thí nghiệm - Khảo sát khả sinh lipase Bacillus chọn theo thời gian nuôi cấy - Khảo sát yếu tố môi trường cảm ứng sinh tổng hợp lipase: nhiệt độ, pH, chất cảm ứng - Tổng hợp điều kiện tối ưu để thử nghiệm nuôi cấy, thu nhận chế phẩm enzyme lipase thơ H ọat tính riêng (UI/mg protein) 14 12 10 6 pH Đồ thị 4.6 - Ảnh hưởng pH môi trường đến sinh tổng hợp lipase chủng BB3 Từ kết Đồ thị 4.6 Bảng 4.8 cho thấy: Khỏang pH môi trường thích hợp cho sinh t hợp lipase chủng BB3 pH (7 - 9), pH có họat tính enzyme lipase tạo cao 13,175 UI/mg protein Tại pH môi trường acid (từ pH 6,0 trở xuống) hay pH kiềm ( pH 9,0) làm ảnh hưởng mạnh đến khả tăng trưởng phát triển vi khuẩn, ảnh hưởng đến khả sinh tổng hợp lipase Như vậy, pH 7,0 pH mơi trường thích hợp cho chủng BB3 sinh tổng hợp lipase 4.3.3 Ảnh hưởng nguồn chất cảm ứng môi trường nuôi cấy lên khả sinh tổng hợp lipase Chúng tiến hành khảo sát ảnh hưởng số loại dầu thực vật khác dầu nành Simply, dầu dừa, dầu olive dầu thực vật Meizan (có thành phần dầu Olein, dầu đậu nành, dầu hạt cải tinh luyện) lên khả tổng hợp lipase chủng BB3 bổ sung vào môi trường cảm ứng với tỷ lệ 1%, nuôi cấy điều kiện nhiệt độ thích hợp khảo sát phần 37oC, pH 7, thời gian nuôi 48h Lấy hoạt tính lipase dầu olive làm chất cảm ứng làm đối chứng (100%), hoạt tính lipase khảo sát từ dầu khác quy đổi % hoạt tính dựa hoạt 44 tính dầu olive Từ so sánh % hoạt tính lipase loại chất khác cảm ứng Kết trình bày Bảng 4.9 Đồ thị 4.7 Bảng 4.9 - Ảnh hưởng nguồn chất cảm ứng đến sinh tổng hợp lipase chủng B subtilis (BB3) Cơ chất Dầu nành Dầu Olive Dầu Meizan Dầu dừa P (mg protein/mL) 0.772 0.666 A (UI/mL) 9.333 9.111 AR (UI/mg protein) 12.090 13.680 % Hoạt tính 88.38 100 0.546 8.000 14.652 107.11 0.93 6.667 7.168 52.40 16 H ọat tính riêng (UI/mg protein) 14 12 10 Dầu nành Dầu Olive Dầu Meizan Dầu dừa Cơ chất cảm ứng Đồ thị 4.7 - Ảnh hưởng nguồn chất đến sinh tổng hợp lipase chủng BB3 Kết đồ thị 4.7 cho thấy enzyme lipase chủng vi khuẩn BB3 có hoạt tính khác loại chất Dầu Meizan cho họat tính lipase cao 14,652 UI/mg protein Trong đó, ho ạt tính li pase tạo từ nguồn dầu dừa thấp 7,168 UI/mg protein 45 Trong thí nghiệm này, loại chất cảm ứng: dầu đậu nành, dầu olive, dầu thực vật Meizan dầu dừa có khác biệt chủ yếu độ dài mạch carbon phân tử acid béo mức độ không no chúng Dầu đậu nành chủ yếu chứa acid linoleic (C18:2 n-6) với hàm lượng cao, dầu dừa chứa chủ yếu acid lauric (C12:0) dầu olive đặc trưng acid oleic (C18:1 n-9), dầu Meizan có thành phần dầu Olein, dầu đậu nành, dầu hạt cải tinh luyện Sự khác dự đốn sơ tính chất đặc hiệu chất lipase thu nhận Từ đồ thị 4.7 so sánh dầu nành với dầu Olive có chênh lệch sau: dầu nành cho họat tính lipase thấp đạt khỏang 88,38% so với dầu Olive Trong dầu dừa lại cho họat tính thấp nhất, chệnh lệch nhiều so với dầu olive (chỉ khỏang 52,4%) Điều phần chất lượng khác loại dầu, phần thành phần chất béo loại dầu Cả loại dầu chứa loại chất béo: khơng bão hịa đa, khơng bão hịa đơn bão hịa, nhiên tỷ lệ chất lại khác (Phụ lục 4) Từ ta thấy chủng vi khuẩn phân giải chất béo dầu olive dầu nành tốt hẳn so với dầu dừa dầu dừa chưa phần lớn chất béo bão hòa Dầu Meizan cho họat tính lipase cao nhất, nhiên khơng cao so với dầu Olive (chỉ cao khỏang ,11%) Theo số nghiên cứu lại cho kết dầu olive chất cảm ứng tốt chủng vi sinh vật sinh lipase Điều giải thích thành phần dầu Meizan chứa dầu Olein, dầu đậu nành, dầu hạt cải tinh luyện lọai chứa phần lớn chất béo khơng bão hịa, tỉ lệ chất béo khơng bão hịa cao hơn, đa dạng so với lọai dầu nành dầu olive, ngòai cịn có bổ sung este polyglycerol chủng vi khuẩn dễ dàng phân giải hơn, lượng acid béo tạo thành nhiều Kết cho thấy chất không làm tăng đáng kể khả sinh tổng hợp enzyme chủng nghiên cứu Như vậy, kết phù hợp với nghiên cứu loài vi sinh vật khác cho dầu olive chất cảm ứng tốt khả sinh tổng hợp lipase đa số vi sinh vật Tóm lại: Điều kiện ni cấy thích hợp để thu nhận lipase từ chủng vi khuẩn BB3 ni cấy mơi trường cảm ứng có pH 7,0 với chất dầu olive 1%, sau 48 nuôi cấy lắc 37 0C 4.4 Tổng hợp điều kiện tối ưu để thử nghiệm nuôi cấy, thu nhận chế phẩm enzyme lipase thô 46 Sau xác định số điều kiện ni cấy thích hợp để thu nhận lipase ngoại bào chủng BB3 tiến hành nuôi cấy điều kiện tối ưu để thu nhận lipase thô tiến hành khảo sát hoạt tính lipase thu nhận thí nghiệm nhằm đưa tiềm ứng dụng lipase thu Sau thu nhận chế phẩm enzyme lipase thô, tiến hành khảo sát hàm lượng protein họat tính lipase: 4.4.1 Xác định hàm lượng protein họat tính lipase  Đường chuẩn albumin dùng phương pháp Bradford Để xác định hàm lượng protein chế phẩm enzyme thô , tiến hành xây dựng đường chuẩn albumin Kết trình bày Bảng 4.10 Từ tương quan nồng độ albumin giá trị ΔOD 595 xây dựng đường chuẩn albumin (Đồ thị 4.8) Bảng 4.10 - Tương quan giá trị ΔOD 595 nồng độ albumin Nồng độ Albumin (mg/mL) 10 20 30 40 50 ΔOD 595 0,069 0,132 0,19 0,256 0,31 0.35 y = 0.0062x + 0.0046 0.3 R2 = 0.9989 ΔOD595 0.25 0.2 0.15 0.1 0.05 0 10 20 30 40 50 60 Hàm lượng protein Đồ thị 4.8 - Đường chuẩn albumin Đường chuẩn có phương trình: y = 0,0062x + 0,0046 độ tin cậy R =0,9989 Căn vào đường chuẩn vừa dựng được, hàm lượng protein suy từ công thức x = (y – 0,0046) / 0,0062 47 Với y: giá trị ΔOD 595 x: hàm lượng protein (µg/mL) Để đảm bảo tính xác, chế phẩm enzyme pha loãng lần với nước cất khử trùng cho giá trị ΔOD 595 nằm đường chuẩn Thu giá trị ΔOD 595 Bảng 4.11 - Kết hàm lượng protein hoạt tính trước, sau tủa Các thơng số Dịch enzyme Thể tích (ml) 40 Túa Khối lượng (mg CPE) 849 Hàm lượng protein (mg/ml), (mg/mg CPE) 0,775 0,003 31 2,547 Hoạt tính (UI/ml), (UI/mg CPE) 10,667 0,024 Tổng hoạt tính (UI) 426,68 20,376 Hoạt tính riêng (UI/mg protein) 13,764 Tổng hàm lượng protein (mg protein) Qua kết Bảng 4.11, ta có:  Tổng hàm lượng protein dịch enzyme : 31 mg  Tổng hàm lượng protein tủa : 2,547 mg Vậy hiệu suất thu hồi protein : 8,22%  Tổng hoạt tính lipase dịch enzyme thơ: 426,68 UI  Tổng hoạt tính lipase tủa: 20,376 UI Hiệu suất thu hồi enzyme là: 4,78%  Hoạt tính riêng dịch enzyme thơ: 13,764 UI/mg protein  Hoạt tính riêng tủa: UI/mg protein Độ tinh enzyme là: 0,581 4.4.2 Khảo sát khả ứng dụng enzyme lipase thu từ BB3 Từ thông số nhận thấy enzyme lipase thu có họat tính cịn yếu chúng tơi tiến hành khảo sát khả phân giải enzyme lipase thu từ Bacillus BB3 với nguồn chất đơn giản bã đậu nành (Bã thu sau nấu sữa đậu nành) 48 Đối với chất bã đậu nành (dạng bán rắn): Tiến hành thí nghiệm sau: Cân 10g bã đậu nành cho vào erlen ủ với enzyme thu erlen chưa 10g bã đ ậu nành + dịch huyền phù vi khuẩn BB3, ủ 37oC, Hàm lượng dầu mẫu chiết phương pháp Soxhlet Lấy 50mL dầu chiết được, thêm vào – giọt NaOH 0,1N giọt phenolphthalein Sau chuẩn độ lại NaOH 0,1N đến xuất màu hồng nhạt (Sadasivam Manikam, 1996) Phần trăm acid béo tự có mẫu tính theo cơng thức sau: % lipid = V × 0,02825 m Trong đó: ×100 V : Số mL dung dịch NaOH chuẩn độ dầu chiết sau ủ (mL) m o : Khối lượng bã ( g ) Thu kết sau: • Lượng chất béo có bã đậu nành 8,475% • Lượng chất béo dầu chiết sau phản ứng với enzyme 9,04% • Lượng chất béo dầu chiết sau ủ với huyền phù vi khuẩn 10,17% Kết cho thấy enzyme thu có họat tính khơng cao, so với huyền phù vi khẩn enzyme lipase tạo acid béo mức thấp Điều nhiều yếu tố điều kiện thí nghiệm khơng đảm bảo, khơng chuẩn xác, thu nhận enzyme chưa cách làm mát, biến tính protein enzyme… 49 CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận 5.1 Với kết thực nghiệm thu trình bày phần trên, chúng tơi có kết luận sau:  Phân lập làm chủng khuẩn có khả sinh lipase ngoại bào từ mẫu thực phẩm, có chủng vi khuẩn có số đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa giống với vi khuẩn Baccillus subtilis ký hiệu là:  BB3 – phân lập từ mẫu Bơ thực vật  BM1 – phân lập từ mẫu Mỡ heo  BĐ2 – Phân lập từ mẫu đậu hũ chiên  Từ chủng vi khuẩn phân lập chủng Bacillus subtilis từ chế phẩm men tiêu hóa (ký hiệu BS1) tiến hàn h nuôi cấy môi trường cảm ứng có chứa 1% dầu olive, ni cấy lắc 24 Kết chọn chủng Bacillus có họat tính lipase cao BB3  Xác định mơi trường thích hợp để cảm ứng sinh tổng hợp lipase chủng vi khuẩn BB3 sau: ni cấy mơi trường cảm ứng có pH 7,0 với chất cảm ứng dầu olive nồng độ 1% sau 48 nuôi cấy 37 0C  Tổng hợp điều kiện tối ưu nuôi cấy chủng vi khuẩn BB3 bước đầu thu nhận chế phẩm enzyme lipase thơ có họat tính riêng UI/mg protein enzyme Khảo sát khả ứng dụng enzyme lipase thu từ Bacillus BB3 thí nghiệm phân giải chất béo bã đậu nành cho thấy họat tính enzyme thu chưa cao, mức độ phân giải acid béo bã đậu nành enzyme thơ cịn thấp so với mức phân giải vi khuẩn 5.2 Kiến nghị Nội dung thực đề tài nhằm góp phần xây dựng sưu tập chủng vi sinh vật có khả sinh lipase ngoại bào nói chung Bacillus subtilis nói riêng, kết đề tài tiền đề cho cơng trình nghiên cứu loài vi sinh vật sinh lipase ngoại bào Việt Nam ứng dụng chúng Vì chúng tơi có đề nghị nhằm củng cố thêm kết mà đề tài đạt hướng phát triển tương lai  Đi sâu nghiên cứu đặc tính, định danh vi khuẩn BB3, xác định kích thước cấu trúc lipase thu nhận từ chủng vi khuẩn BB3 50  Thu nhận tạo dịng gene mã hóa cho enzyme lipase chủng khảo sát vào chủng vi sinh vật khác dễ nuôi cấy, dễ cảm ứng nhằm cho mục đích sản xuất lipase thương mại  Tiếp tục định danh, sàng lọc chủng sinh lipase có đặc điểm tốt khác  Tiến hành nghiên cứu xác định tính chất, cấu trúc, đánh giá chế hoạt động, động học, ứng dụng lipase thu nhận từ chủng vi khuẩn  Nghiên cứu điều kiện tối ưu để phát triển hệ thống lên men thu lipase thương phẩm 51 TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT Lâm Thị Kim Châu, Văn Đức Chín, Ngơ Đại Nghiệp, Thực tập lớn sinh hóa, NXB ĐHQG TP.HCM (2004) Phạm Thị Ánh Hồng, Kỹ thuật sinh hóa, NXB ĐHQG TP.HCM (2003) Lại Mai Hương, Trần Thị Hồng Hạnh, Nguyễn Thị Nguyên, Nghiên cứu thu nhận chế phẩm enzyme lipase từ vi sinh vật, Đề tài KHCN cấp Đại Học Quốc Gia TP Hồ Chí Minh (2008) Lê Quang Huy, Nguyễn Phan Cẩm Tú, Nguyễn Thị Thắm, Khảo sát hoạt tính enzyme lipase nấm men Schizosaccharomyces pombe, Hội nghị khoa học lần Trường ĐHKHTN, ĐHQG TP HCM (2009) Quyền Đình Thi, Nguyễn Thị Bẩy, Mai Thị Thanh, Nguyễn Thị Thảo, Lê Thị Thu Giang, Nguyễn Thị Tuyết Nhung, Nguyễn Ngọc Dũng, “Phân lập chủng vi khuẩn sinh tổng hợp lipase từ nước thải khảo sát hoạt tính lipase 102 chủng Pseudomonas”, Tạp chí Di truyền Ứng dụng (2003) Đặng Thị Thu, Nghiên cứu công nghệ sản xuất số loại dầu béo lipase Báo cáo tổng kết khoa học kỹ thuật, Bộ Khoa Học Công Nghệ, Viện Khoa Học Công Nghệ Đại Học Bách Khoa Hà Nội (2004) Lê Ngọc Tú, La Văn Chứ, Phạm Trân Châu, Nguyễn Lân Dũng Enzyme vi sinh vật (tập II) NXB Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội (1982) Dương Thị Phụng Các (2004), Bước đầu phân lập vi sinh vật chịu mặn có khả phân hủy lipid, Khóa luận cử nhân khoa học, Công nghệ Sinh học Công nghiệp, Ngành Công nghệ Sinh học, Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQG Tp HCM Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đang Đức, Đặng Hồng Miên, Nguyễn Vĩnh Phước, Nguyễn Đìn h Quyến, Nguyễn Phùng Tiến, Phạm Văn Ty (1976), Một số phương pháp nghiên cứu vi sinh vật học, tập II, Nhà xuất Khoa học Kỹ thuật Hà Nội 10 Nguyễn Lân Dũng, Nguy ễn Đình Quyến, Phạm Văn Ty (2000), Vi sinh vật học, Nhà xuất Giáo Dục 11 Lê Thanh Hịa, Quyền Đình Thi (2006), Y sinh học phân tử, Chương IX: Lipase vi sinh vật: sinh tổng hợp, tinh sạch, xác định tính chất sinh học, Quyển I, NXB Y học, tr 176-205 12 Lê Quang Huy (2008), “Khảo sát hoạt tính enzyme triglyceride lipase nấm men Schizosacchromyces pombe “, Khóa luận cử nhân khoa học, Chuyên ngành Sinh hóa, Ngành Sinh học, Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQG Tp HCM 13 Quyền Đình Thi (2004), “Những ứng dụng lipase vi sinh vật”, Báo cáo Khoa học, Hội nghị Khoa học, Hóa sinh Y dược năm 2004, Hà Nội, 8, tr 23-136 14 Quyền Đình Thi, Nguyễn Thị Bẩy, Mai Thị Thanh, Nguyễn Thị Thảo, Lê thị Thu Giang, Nguyễn Thị Tuyết Nhung, Nguyễn Ngọc Dũng (2003), “Phân l ập chủng vi khuẩn sinh tổng hợp lipase từ nước thải khảo sát hoạt tính lipase 102 chủng Pseudomonas”, Tạp chí Di truyền học Ứng dụng, 4, tr 37- 42 15 Trần Linh Thước (2006), Phương pháp phân tích vi sinh vật nước, thực phẩm mỹ phẩm, Tái lần thứ hai, Nhà xuất giáo dục 52 16 Nguyễn Văn Lượng Công nghệ vi sinh vật, tập 2, vi sinh vật học công nghiệp Nhà xuất Đại học quốc gia TP Hồ Chí Minh 17 Trần Đỗ Quyên, 2005 “Thu nhận khảo sát hoạt tính chế phẩm amylase từ vi khuẩn Bacillus subtilis” Khóa luận cử nhân sinh học Đại học Khoa Học Tự Nhiên TP Hồ Chí Minh 18 Lê Văn Việt, 2007 “Khảo sát khả sinh tổng hợp enzyme amylase, protease, phytase số chủng Bacillus subtilis thử nghiệm sản xuất chế phẩm Probiotic” Khóa luận cử nhân sinh học, Đại học Khoa Học Tự Nhiên, TP Hồ Chí Minh 19 TS Ngơ Đại Ngh iệp, ThS Trần Quốc Tuấn , ThS Vòng Bính Long , “Nghiên cứu thu nhận , tinh sạch lipase từ Trichoderma spp”, Đề tài KHCN cấp Đại Học Quốc Gia TP Hồ Chí Minh (2011) 20 Trương Minh Mẫn, 2009 “ Bước đầu khảo sát vi sinh vật có khả sinh tổng hợplipase ngọai bào” Luận văn thạc sĩ sinh h ọc, Đại học Khoa Học Tự Nhiên, TP Hồ Chí Minh TIẾNG ANH 21 Buchholz K., Kasche V., Bornscheuer U.T., Biocatalysts and Enzyme Technology, Wiley VCH, Weinheim, 2005 22 Sharma R., Chisti Y., Banerjee U C.: Production, purification, characterization, and applications of lipases Biotechnology Advances 19 (2001) 627– 662 23 Jaeger, K E., & Reetz, M T (1998) Microbial lipases from versatile tools for biotechnology Trends in Biotechnology, 16, 396–403 24 S Mrudula, R Kokila, 2010 Production of Thermostable α-amylase by Bacillus cereus MK in solid state fermentation: Partial purification and characterization of the enzyme The Internet Journal of Microbiology 2010 Volume Number 25 Birger Vasel, Hans-Jurgen Hecht, Rolf Dieter Schmid and Dietmar Schomburg, 3D- Structures of the lipase from Rhozomucor miehei at different temperatures and computer modeling of a complex of the lipase with trilaurylglycerol, Journal of Biotechnology, 99-115, (1993) 26 Ching T.Hou and Yuji Shimada, Lipase, Industrial Uses, National Center for Agricultural Utilization Research, ARS, US Department of Agriculture, Peoria, IL USA and Osaka Municipal Technical Research Institute, Osaka, Japan (2008) 27 GGwen Falony, Janny Coca Armas, Julio C Dustet Mendoza and Jose L Martinez Hernandez, Production of Extracellular lipase from Aspergillus niger by Solid – State Fermentation, Food Technol, Biotechnol, 44 (2) 235-240, Cuba, Mexico (2006) 28 Hanna Kontkanen, Novel steryl esterases as biotechnological tools, Technical Research Center of Finland, Helsinki (2006) 29 Jean Louis Arpigny and Karl-Erich Jaeger Bacterial lipolytic enzymes: classification and properties, Biochemical Journal, 177-183 (1999) 30 Jyoti Vakhl, Yeast lipase: enzyme purification, biochemical properties and gene cloning, Electronic Journal of Biotechnology (1), 17 (2006) 53 31 Kashmiri M.Akram Ahmad Adnan and Beenish Waseem Butt, Production, purification and partial characterization of lipase from Trichoderma viride, African Journal of Biotechnology, 878-882, (2006) 32 Manoj Singh, Kumar Saurav, Neha Srivastava and Krishnan Kannabiran, Lipase production by Bacillus subtilis OCR-4 in solid state fermentation using ground nut oil cakes as substrate, Current research journal of Biological Sciences India 2(4), 241-245 (2010) 33 Paul Woolley, Steffen B, Petersen, Lipase: Their structure, Biochemistry and Application, Biochemistry and Molecular Biology Education 22 (4), 216 (1992) 34 Rajendra B Kakde and Ashok M Chavan, Effect of carbon, nitrogen, sulphur, phosphorus, antibiotic and vitamin sources on hydrolytic enzyme production by storage fungi Recent Research in Science and Technology 3(5), 20-28 (2011) 35 Rohit Sharma, Yusuf Chisti, Uttam Chand Banerjee, Production, purification, characterization and applications of lipases, Biotechnology Advances 19, 627 – 662 (2001) 36 Sailas Benjamin and Ashok Pandey, Isolation and Characterization of Three Distinct Forms of Lipases from Candida rugosa Produced in Solid State Fermentation, Brazilian Archives of Biology and Technology 43(5), 453-460 (2000) 37 Saxena R.K., Ghosh P.K., Rani Gupta, Davidson W.Sheba, Sapna Bradoo and Ruchi Gulati, Microbial lipases: Potential biocatalysts for the future industry 77 (1), 101-115 (1999) 38 Sendar ULKER, Arzu OZEL, Ahmet COLAK, Sengul ALPAY KARAOGLU, Isolation, production, and characterization of an extracellular lipase from Trichoderma harzianum isolated from soil, Turkish Journal of Biology, 543-550 (2010) 39 Shahani Khem M., Enzymes in food processing, Food Science and Technology, 181 - 217 (1975) 40 Sharon C., Furugoh S., Yamakido T., Ogawa H., Kato Y, Purification and characterization of a lipase from Pseudomonas aeruginosa KKA-5 and its role in castor oil hydrolysis, J Ind Microbiol Biotechnol 20, 304–3077 (1998) 41 Xuebing Xu, Production of specifie structured triacylglycerols by lipasecatalyzed reaction, Lyngby Denmark, Eur J Lipid scienes Technology, 287-303 (2002) 42 Arpigny, J.L and Jaeger, K.J (1999), “Bacterial lipolytic enzymes: classification and properties”, Biochemical Journal, 343, pp 177-183 43 Brockerhoff, H and Jensen, R (1974), Lipolytic enzymes, Academic Press, New York 44 Kagukawa, K., Shobayashi, M., Suzuki, O and Miyakawa, T (2002), “Purification and characterization of a lipase from the glycolipid-producing yeast Kurtzmanomyces sp.I11”, Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry, 66 (5), pp 978-985 45 Sharma, R., Chisti, Y and Banerjee, U.C (2001), “Research review paper – Production, purification, characterization, and applications of lipases”, Biotechnology Advances, 19, pp 627–662 46 Kanimozhi K., Wesely Jebasingh Devairrakam E.G., Jegadeeshkumar D., Production and Optimization of a lipase from Bacillus subtilis, International Journal of Biological Technology, (2011) 2(3):6 – 10 54 Tài liệu từ internet 47 http://www.jlindquist.net/generalmicro/102bactid3.html 48 http://vietsciences2.free.fr/khaocuu/nguyenlandung/phuongphapthucnghi em-dinhtenvk04.htm 49 http://khoamt-cnsh.darkbb.com/t17-topic 50 http://vi.wikipedia.org/wiki/Triglyceride PHỤ LỤC PHỤ LỤC – Chủng vi khuẩn làm môi trường TSA BC1 BLT PHỤ LỤC - Một số vi khuẩn sinh tổng hợp lipase [22] Nguồn gốc Giống Loài Tham khảo Vi khuẩn (Gram dương) Bacillus B megaterium B cereus B stearothermophilus Godtfredsen, 1990 El-Shafei and Rezkallah, 1997 Gowland et al., 1987; Kim et al., 1998 Kennedy and Rennarz, 1979 B subtilis Recombinant B subtilis Lesuisse et al., 1993 168 B brevis Hou, 1994 B thermocatenulatus Rua et al., 1998 Bacillus sp IHI-91 Bacillus strain 55 Becker et al., 1997 WAI Janssen et al., 1994 28A5 Bacillus sp B acidocaldarius Helisto and Korpela, 1998 El-Shafei and Rezkallah, 1997 Manco et al., 1998 Bacillus sp RS-12 B thermoleovorans ID-1 Sidhu et al., 1998a,b Lee et al., 1999 B coagulans Bacillus sp J 33 Lactobacillus delbruckii Lactobacilus sub sp bulgaricus Lactobacillus sp Nawani and Kaur, 2000 El-Sawah et al., 1995 Meyers et al., 1996 PHỤ LỤC - Một vài lipase từ vi sinh vật có giá trị thương mại [23], [22] Lồi Nấm Vi khuẩn Nguồn gốc Ứng dụng Công ty sản xuất C rugosa Tổng hợp hữu Amano, Biocatalysts, Boehringer Mannheim, Fluka, Genzyme, Sigma C antarctica Tổng hợp hữu Boehringer Mannheim, Novo Nordisk T lanuginosus Bổ sung vào chất tẩy Boehringer Mannheim, Novo Nordisk R miehei Sản xuất thực phẩm Novo Nordisk, Biocatalysts, Amano Burkholderia cepacia Tổng hợp hữu Amano, Fluka, Boehringer Mannheim P alcaligenes Bổ sung vào chất tẩy Genencor P mendocina Bổ sung vào chất tẩy Genencor Ch viscosum Tổng hợp hữu Asahi, Biocatalysts PHỤ LỤC - Thành phần loại chất béo chất Chất béo bão hòa Dầu olive Dầu nành Dầu dừa 14% 20% 92% 56 Chất béo không bão hịa Chất béo khơng bão hịa đơn Chất béo khơng bão hòa đa 77% 9% 25% 65% 6% 2% Với: Dầu nành Simply Dầu olive sản phẩm FRAGATA, Tây Ban Nha Dầu thực vật Meizan có thành phần: • Dầu Olein, dầu đậu nành, dầu hạt cải tinh luyện • Vitamin E, Vitamin A Este polyglycerol (475) PHỤ LỤC - Kết thống kê sinh học ANOVA Ảnh hưởng thời gian nuôi cấy đến khả tổng hợp lipase chủng BB3 SUMMARY Thời gian 48h 56h 72h 80h 96h Count 3 3 Sum 36.000 38.667 32.000 28.667 25.334 Average 12.000 12.889 10.667 9.556 8.445 Variance 0.445 1.037 1.778 0.592 0.148 ANOVA Source of Variation Between Groups Within Groups SS 38.635 8.001 df 4.000 10.000 MS 9.659 0.800 F 12.071 Total 46.636 14.000 P-value 0.001 F crit 3.478 Ảnh hưởng nhiệt độ nuôi cấy đến khả tổng hợp lipase chủng BB3 SUMMARY Groups Count Sum Average Variance o 20.000 6.667 1.778 27 C o 26.667 8.889 0.148 32 C 37oC 42oC 3 33.334 18.667 11.111 6.222 0.592 0.593 47oC 12.000 4.000 0.445 ANOVA Source of Variation Between Groups SS 88.420 df 4.000 MS 22.105 F 31.077 57 P-value 0.000 F crit 3.478 Within Groups 7.113 10.000 Total 95.533 14.000 0.711 Ảnh hưởng pH môi trường nuôi cấy đến khả tổng hợp lipase chủng BB3 SUMMARY Groups pH5 pH6 pH7 pH8 pH9 Count 3 3 Sum 6.667 21.333 30.000 26.001 16.666 Average 2.222 7.111 10.000 8.667 5.555 Variance 0.148 0.148 0.445 0.000 0.148 ANOVA Source of Variation Between Groups Within Groups SS 108.861 1.779 df 4.000 10.000 MS 27.215 0.178 F 153.010 Total 110.640 14.000 P-value 0.000 F crit 3.478 Ảnh hưởng chất cảm ứng đến khả tổng hợp lipase chủng BB3 SUMMARY Groups Nành Olive Meizan Dừa Count 3 3 Sum 28 27.333 24 20 Average 9.333 9.111 8.000 6.667 Variance 0.444 1.037 0.445 1.778 ANOVA Source of Variation Between Groups Within Groups SS 13.444 7.409 df MS 4.481 0.926 F 4.839 Total 20.852 11 58 P-value 0.033 F crit 4.066 ... hóa R -CO-OR + R -CO-OH R -CO-OR + R -CO-OH  Phản ứng rượu hóa R -OH + R -CO-OR R -OH + R -CO-OR  Phản ứng chuyển ester hóa R -CO-OR + R -CO-OR R -CO-OR + R -CO-OR  Phản ứng amin hóa R -CO-OR...  Phản ứng amin hóa R -CO-OR + R -NH R -CO-NHR + R -OH  Phản ứng thủy phân R -CO-OR + H2O R -CO-OH + R -OH  Phản ứng ester hóa R -CO-OH + R -OH 2.1.5.2 R -CO-OR + H O Tính đặc hiệu lipase Sự... hết sinh vật sống [32] TAG = triacylglycerols, DAG = diacylglycerols, MAG = monoacylglycerols, FFA = free fatty acids Hình 2.3 - Phản ứng thủy phân triacylglycerol enzyme lipase [43] Các phản