Mục tiêu nghiên cứu
- Xây dựng quy trình chiết tách thành phần hóa học các hợp chất trong cây xạ đen
- Xác định thành phần hóa học, cấu trúc các hợp chất hóa học trong cây xạ đen và nghiên cứu hoạt tính sinh học của nó.
Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu
Đối tượng: Thân cây xạ đen
Nghiên cứu này tập trung vào quy trình chiết tách và xác định thành phần, cấu trúc của một số hợp chất có trong thân cây xạ đen, đồng thời đánh giá hoạt tính sinh học của các hợp chất này.
Phương pháp nghiên cứu
Tìm hiểu về cây xạ đen bao gồm việc nghiên cứu các tư liệu, sách báo trong và ngoài nước, kết hợp với việc khảo sát thực tế để nắm rõ đặc điểm hình thái thực vật, thành phần hóa học và công dụng của cây này.
Trao đổi với giáo viên hướng dẫn về các đặc điểm, công dụng của cây xạ đen
Xác định độ ẩm bằng phương pháp trọng lượng
Xác định hàm lượng tro bằng phương pháp tro hóa mẫu
Xác định hàm lượng kim loại bằng phương pháp quang phổ hấp thụ nguyên tử AAS
Chiết bằng phương pháp Soxhlet
Khảo sát thời gian chiết
Sử dụng phương pháp sắc ký khí kết hợp với khối phổ (GC-MS) để xác định thành phần các hợp chất hóa học trong dịch chiết từ thân cây xạ đen Phân tích này giúp hiểu rõ hơn về các hợp chất có trong cây xạ đen và tiềm năng ứng dụng của chúng trong y học và công nghiệp.
Các phương pháp thử nghiệm hoạt tính sinh học.
Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài
Cây xạ đen chứa nhiều hợp chất có giá trị với các chỉ tiêu hóa lý và thành phần hóa học đặc trưng Nghiên cứu về cấu tạo của những hợp chất này giúp hiểu rõ hơn về tác dụng và ứng dụng của cây xạ đen trong y học và đời sống Việc cung cấp thông tin khoa học về cây xạ đen không chỉ nâng cao nhận thức về giá trị của nó mà còn hỗ trợ cho các nghiên cứu và phát triển trong lĩnh vực dược liệu.
Cung cấp các số liệu thực nghiệm cho các nghiên cứu sâu hơn về cây xạ đen
Giải thích một cách khoa học các kinh nghiệm dân gian, thuận tiện cho việc nghiên cứu, ứng dụng vào ngành công nghiệp dược phẩm.
Bố cục khóa luận
Khóa luận dài 35 trang, bao gồm 10 bảng, 11 hình, 1 sơ đồ và 3 biểu đồ Bài viết được cấu trúc thành phần mở đầu (3 trang), phần kết luận và kiến nghị (2 trang), cùng với tài liệu tham khảo (1 trang) Nội dung chính của đề tài được chia thành 3 chương.
Chương 1: Tổng quan tài liệu (8 trang)
Chương 2: Nguyên liệu và phương pháp nghiên cứu (6 trang)
Chương 3: Kết quả và bàn luận (15trang)
4
Sơ lƣợc về họ Dây gối (Celastraceae) [11]
Họ Dây gối (Celastraceae) là một họ thực vật đa dạng với khoảng 1300-1350 loài, được chia thành 90-100 chi Các loài trong họ này chủ yếu là dây leo, thân bụi hoặc cây gỗ nhỏ, và chúng phân bố chủ yếu ở các khu vực nhiệt đới và ôn đới.
Hình 1.1 Một số loài trong họ Dây gối
Giới thiệu về cây xạ đen [1], [2], [8], [9], [10]
Tên khoa học : Celastrus hindsii Benth
Tên nước ngoài : Celastrus hindsii
Tên thường gọi : Xạ đen
Tên khác : Bách giải, Đồng triều, Dây gối, Quả nâu, Ung thư (Mường)
Cây xạ đen là loại cây phân bố rộng rãi tại nhiều quốc gia, bao gồm Trung Quốc, Việt Nam, Myanmar và Thái Lan Ở Trung Quốc, cây xạ đen thường mọc ở độ cao từ 1.000 đến 1.500 mét Tại Việt Nam, cây xạ đen phân bố chủ yếu tại các tỉnh Hà Nam, Quảng Ninh, Ninh Bình, Hòa Bình và các khu vực như Vườn Quốc gia Cúc Phương, Vườn Quốc gia Ba Vì, đồng thời cũng có thể mọc tự nhiên trong rừng và dễ dàng trồng.
Xạ Đen là loài cây dễ thích nghi, nên việc ươm trồng khá đơn giản và có thể trồng xen kẽ với các loại cây ăn quả để tiết kiệm diện tích Nên chọn đất đỏ, đất thịt hoặc đất cát pha có độ ẩm vừa phải, tránh ngập úng Hạt giống cần được chọn lọc kỹ lưỡng để không bị sâu bệnh Trước khi ươm, ngâm hạt trong nước sạch khoảng 15 phút, sau đó để ráo và trộn với đất cát pha rồi gieo trên luống cao 20-25cm, rộng 0,8m và dài 6-10m Rắc một lớp cát mỏng lên bề mặt luống và phủ lá cây để giữ nhiệt độ Sau khoảng 5 ngày, khi hạt đã nảy mầm, cần tách những cây con sang bầu đã chuẩn bị sẵn để tránh gãy hoặc cong Khi cây con đã cứng cáp, chuyển vào vườn trồng và chăm sóc bằng cách tưới nước hàng ngày để cây phát triển tốt.
Cây có thân dạng dây dài từ 3-10m, thuộc loại bụi leo với nhánh non tròn và không lông Lá cây không rụng theo mùa, có phiến bầu dục - xoan ngược, kích thước lớn từ 6 - 11 x 2,5cm, với 7 cặp gân phụ và bìa có răng thấp Cuống lá dài từ 5 - 7mm Hoa mọc thành chùm ở ngọn hoặc nách lá, dài từ 5 - 10cm, với cuống hoa dài 2 - 4mm Hoa có mẫu 5, cánh hoa màu trắng, hoa cái có bầu 3 ô Quả nang hình trứng, dài khoảng 1cm, nổ thành 3 mảnh khi chín Hạt có áo hạt màu hồng Cây ra hoa từ tháng 3 đến tháng 5 và ra quả từ tháng 8 đến tháng 12 Cành cây tròn, lúc non có màu xám nhạt, sau chuyển sang màu nâu, có lông và cuối cùng có màu xanh.
Một số nghiên cứu về cây xạ đen
Viện Quân y 103, dưới sự dẫn dắt của GS Lê Thế Trung cùng các bác sĩ, đã tiên phong trong nghiên cứu cây xạ đen từ năm 1987, đóng góp quan trọng vào việc tìm hiểu và phát triển ứng dụng của loại cây này trong y học.
Học viện Quân y, dưới sự dẫn dắt của GS.TSKH Lê Thế Trung - Chủ tịch Hội Ung thư TP.Hà Nội, đã phát hiện cây xạ đen trong quá trình sưu tầm các bài thuốc quý từ dân gian Sau 12 năm nghiên cứu, họ đã chiết xuất thành công một loại tinh thể từ cây xạ đen có khả năng ức chế sự phát triển của tế bào ung thư.
Các tác giả Nguyễn Huy Cường, Phạm Thị Ninh, Trần Văn Sung và Trịnh Thị Thủy từ Viện Hóa Học, thuộc Viện Khoa Học và Công Nghệ Việt Nam, đã thực hiện nghiên cứu với đề tài đặc biệt.
“Phân lập và xác định cấu trúc các hợp chất Tritecpen từ cây xạ đen” đăng trên
The journal Chemistry T.46(4) has successfully isolated and determined the chemical structures of clionsterol and three triterpenes: D:A-friedo-oleanan-3,21-dione, lup-20(29)-en-3β-ol, and lup-12-en-3β-ol from the black licorice plant.
Luận án Tiến sĩ Hóa học của Nguyễn Huy Cường nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của cây xạ đen và cây cùm cụm răng Nghiên cứu này được thực hiện tại Viện Hóa Học thuộc Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
Nam đã thực hiện việc phân lập và xác định thành phần hóa học của một số hợp chất trong cây xạ đen, đồng thời tiến hành thăm dò hoạt tính sinh học của các chất này.
Một số bài thuốc y học cổ truyền sử dụng cây Xạ Đen
- Thông kinh, lợi niệu, giải nhiệt, kích thích tiêu hóa, chữa ung nhọt: Xạ đen
15g, Kim ngân hoa 12g, các vị thuốc thái nhỏ, phơi khô, sao vàng, hãm uống mỗi ngày một thang
Thuốc tăng cường khả năng miễn dịch và hỗ trợ điều trị các bệnh như ung thư và tiểu đường bao gồm các thành phần tự nhiên như Xạ đen, Nấm linh chi và Giảo cổ lam, mỗi loại 15g, được sắc uống hàng ngày Sản phẩm này không chỉ giúp giảm mệt mỏi, căng thẳng mà còn giảm đau hiệu quả.
- Hỗ trợ điều trị ung thư bằng hóa chất, tia xạ: Xạ đen 30g, Cỏ lưỡi rắn 20g,
Cam thảo dây 6g hãm uống như trà hàng ngày
- Điều trị bệnh gan, viêm gan B: Xạ đen 40-50g, Cà gai leo 30g, Mật nhân 10g sắc với 1 lít nước uống hàng ngày
- Hỗ trợ điều trị ung thư: Xạ đen 50-60g, Bạch hoa xà thiệt thảo 40g, Bán chi liên
20g sắc với 1,5 lít nước uống trong ngày
- Dùng hàng ngày để tăng cường sức khỏe và phòng chống bệnh tật: Xạ đen 70g sắc với 1 lít nước uống trong ngày.
Một số sản phẩm xạ đen trên thị trường
Hình 1.3 Một số sản phẩm xạ đen trên thị trường
1.1 Phương pháp tro hóa mẫu [3], [7] Để xác định hàm lượng tro và các nguyên tố vô cơ trong động thực vật người ta sử dụng phương pháp tro hóa mẫu hay còn gọi là vô cơ hóa mẫu Có 3 phương pháp tro hóa mẫu: phương pháp khô, ướt và khô – ướt kết hợp Trong đó phương pháp khô – ướt kết hợp là tối ưu hơn cả vì hạn chế mất chất phân tích, tro hóa triệt để, thời gian xử lí nhanh hơn Do vậy trong đề tài này tôi sử dụng phương pháp tro hóa mẫu là phương pháp khô – ướt kết hợp
Ban đầu mẫu được phân hủy sơ bộ bằng các chất có tính oxi hóa cao như
H2SO4 đặc kết hợp với HNO3, HClO4, H2O2, KMnO4 giúp tăng tốc độ phân hủy mẫu Sau đó, mẫu được đốt trên bếp điện để tránh cháy trong lò nung và tiến hành nung đến khi thu được tro trắng Trong quá trình nung, các quá trình vật lý và hóa học diễn ra, bao gồm bay hơi nước và các chất dễ bay hơi, kết tinh, cũng như đốt cháy các chất mùn và hữu cơ Tro còn lại chủ yếu là các chất vô cơ khó bay hơi, và cần cân để xác định khối lượng tro.
1.2 Phương pháp đo phổ hấp thụ nguyên tử AAS [3], [7]
Phép đo phổ hấp thụ nguyên tử (AAS) là một kĩ thuật phân tích hiện đại, đang được phát triển mạnh mẽ và ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khoa học và kĩ thuật tại các nước phát triển Kĩ thuật này dựa trên nguyên lý hấp thụ năng lượng ánh sáng (bức xạ đơn sắc) của nguyên tử tự do ở trạng thái hơi khi chiếu chùm tia bức xạ vào đám hơi của nguyên tố, theo định luật hấp thụ ánh sáng Lambert-Beer: A = εlC.
C là nồng độ chất tan (mol/l), l là bề dày cuvet đựng mẫu (cm), và ε là hệ số hấp thụ mol đặc trưng cho cường độ hấp thụ của chất nghiên cứu Trong điều kiện bình thường, nguyên tử ở trạng thái cơ bản bền vững, không thu hay phát ra năng lượng Tuy nhiên, khi ở trạng thái hơi tự do và chịu tác động của chùm tia sáng có bước sóng xác định, các nguyên tử này sẽ hấp thụ bức xạ tương ứng với bước sóng mà chúng có thể phát ra Quá trình này làm cho nguyên tử nhận năng lượng và chuyển sang trạng thái kích thích cao hơn, tạo ra phổ hấp thụ nguyên tử Quan trọng là, nguyên tử chỉ hấp thụ các bức xạ ở những vạch phổ nhạy, đặc trưng cho các nguyên tố, cho thấy rằng mỗi loại nguyên tử sẽ hấp thu năng lượng bức xạ đặc trưng tùy theo cấu trúc hóa học của nó.
Tóm lại để thu được phổ hấp thụ nguyên tử của một nguyên tố nào đó cần phải thực hiện các quá trình sau:
Để xác định nguyên tố trong mẫu, cần xử lý mẫu nhằm chuyển các cation về trạng thái dung dịch Quy trình này phải được thực hiện một cách phù hợp để đảm bảo nguyên tố cần xác định hoàn toàn chuyển vào dung dịch đo phổ.
Quá trình hóa hơi và nguyên tử hóa mẫu được thực hiện để tạo ra các đám hơi nguyên tử, tạo môi trường hấp thụ và sinh ra phổ hấp thụ nguyên tử Quá trình này diễn ra ở nhiệt độ cao, sử dụng nguồn nhiệt từ ngọn lửa đèn khí bằng cách phun dung dịch chứa chất phân tích ở dạng aerosol vào ngọn lửa, hoặc thông qua phương pháp không ngọn lửa nhờ tác dụng nhiệt của lò graphite.
Chùm bức xạ đặc trưng của các nguyên tố cần phân tích được chiếu qua đám hơi nguyên tử Nguồn bức xạ này được phát ra từ đèn catot rỗng (HCL) hoặc đèn phóng điện không cực (EDL), được chế tạo từ chính nguyên tố mà ta muốn xác định.
Hình 1.4 Sơ đồ máy quang phổ hấp thụ nguyên tử AAS
Nguyên tử tự do hấp thu năng lượng từ chùm bức xạ, tạo ra phổ hấp thụ nguyên tử và làm giảm cường độ chùm bức xạ đi qua mẫu Phương pháp này cho phép phân tích định lượng dựa trên cường độ vạch phổ hấp thụ nguyên tử Ứng dụng của nó bao gồm phân tích các vết kim loại trong nhiều loại mẫu khác nhau như quặng, đất, đá, xi măng, nước, không khí, sản phẩm nông nghiệp, thực phẩm, nước uống, phân bón, và các mẫu sinh học, y học như máu, nước tiểu và thực vật.
Phương pháp chiết xuất là kỹ thuật tách các chất từ nguyên liệu dựa vào tính chất của chất cần chiết và dung môi, thông qua sự phân bố giữa hai pha lỏng và rắn Dung môi phân cực có khả năng tách chất phân cực, trong khi dung môi không phân cực tách chất không phân cực Khi nguyên liệu tiếp xúc với dung môi, dung môi thấm vào, hòa tan các chất có trong tế bào nguyên liệu và khuếch tán ra ngoài Quá trình chiết xuất bao gồm khuếch tán, thẩm thấu và hòa tan, chịu ảnh hưởng bởi nhiều yếu tố như nhiệt độ, thời gian chiết và độ mịn của nguyên liệu.
Có nhiều phương pháp chiết xuất nguyên liệu như ngâm dầm, ngấm kiệt, đun hoàn lưu và chiết soxhlet Trong số đó, phương pháp chiết soxhlet được coi là tối ưu nhất trong điều kiện phòng thí nghiệm, vì nó cho phép chiết kiệt hoạt chất và tiết kiệm dung môi nhờ vào quá trình chiết nóng hồi lưu.
Hình 1.5 Bộ dụng cụ Soxhlet
Phương pháp chiết Soxhlet là một quy trình chiết xuất liên tục, tự động lặp lại nhiều lần để thu hồi hoạt chất hiệu quả Bộ dụng cụ chiết Soxhlet bao gồm một bình cầu, thiết bị chiết và ống sinh hàn hồi lưu Trong quá trình chiết, dung môi trong bình cầu sẽ được làm bốc hơi, sau đó ngưng tụ và chảy vào nguyên liệu chiết trong túi giấy lọc, rồi quay trở lại bình cầu Quá trình này giúp làm giàu cấu tử cần tách trong dung môi Đặc biệt, thiết bị chiết Soxhlet có ống xi-pông bên cạnh, cho phép dung dịch chiết chỉ chảy vào bình khi mức chất lỏng trong ống chiết đạt đến khuỷu trên của ống xi-pông.
1.4 Phương pháp sắc ký khí ghép khối phổ GC – MS [3], [5], [7]
Bản chất GC-MS là sự kết hợp của Sắc ký khí (Gas Chromatograohy) và Khối phổ (Mass Spectometry) Ngưỡng phát hiện của phương pháp này là 1 picogram (0.000000000001 gam)
Sắc ký khí là phương pháp dùng để tách biệt các thành phần trong hỗn hợp chất Pha động, thường là khí trơ như helium, sẽ vận chuyển mẫu qua pha tĩnh, nơi mỗi chất tương tác khác nhau Các hợp chất tương tác mạnh sẽ ra khỏi cột nhanh hơn, trong khi những hợp chất tương tác yếu hơn sẽ ra sau Khi các chất được tách ra và đi vào đầu dò, chúng tạo thành các đỉnh trên sắc đồ, với thời gian lưu đặc trưng cho từng chất trong điều kiện sắc ký nhất định Để xác định các hợp chất hóa học, khối phổ được sử dụng, so sánh với thư viện phổ chuẩn nhằm nhận diện các hợp chất trong mẫu.
Sắc ký khí ghép khối phổ (GC-MS) là phương pháp phân tích hiệu quả để xác định thành phần của các hỗn hợp hóa chất phức tạp, bao gồm cả chất hóa học và kháng sinh Phương pháp này cũng được sử dụng để đánh giá mức độ tồn lưu của các hóa chất diệt côn trùng trong nhiều loại vật liệu và hợp chất khác nhau.
Phương pháp sắc ký khí ghép khối phổ GC – MS [3], [5], [7]
Nguyên liệu để nghiên cứu: thân cây xạ đen được lấy tại xã Tân Sơn, huyện Kim Bảng, tỉnh Hà Nam
Thời gian lấy: tháng 7 năm 2014
Nguyên liệu sau khi thu hái, phơi khô, loại bỏ tạp, xay thành bột mịn
Hình 2.1 Nguyên liệu thân cây xạ đen khô và dạng bột 2.1.3 Thiết bị - dụng cụ, hóa chất
- Bộ chiết Soxhlet (phòng thí nghiệm khoa Hóa – trường Đại học Sư Phạm – Đại học Đà Nẵng)
- Máy quang phổ hấp thụ nguyên tử AAS (Đài Khí tượng Thủy văn khu vực Trung Trung Bộ - 660 – Trưng Nữ Vương – Đà Nẵng)
- Máy sắc kí khí ghép khối phổ GC-MS (Trung tâm Kỹ thuật Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng II, số 2 Ngô Quyền – Đà Nẵng)
Phòng thí nghiệm khoa Hóa tại Đại học Sư phạm - Đại học Đà Nẵng được trang bị đầy đủ các thiết bị cần thiết như tủ sấy, lò nung, cân phân tích, cốc thủy tinh, bình tam giác, ống nghiệm, bếp điện, bếp cách thủy, chén sứ, bình định mức, bình hút ẩm, các loại pipet và giấy lọc Những thiết bị này hỗ trợ sinh viên và giảng viên trong việc thực hiện các thí nghiệm và nghiên cứu khoa học hiệu quả.
Dung môi hữu cơ: Ethylacetat, diclomethan, n-hexan, ….
12
Nguyên liệu, dụng cụ, hóa chất [4], [6]
Nguyên liệu để nghiên cứu: thân cây xạ đen được lấy tại xã Tân Sơn, huyện Kim Bảng, tỉnh Hà Nam
Thời gian lấy: tháng 7 năm 2014
Nguyên liệu sau khi thu hái, phơi khô, loại bỏ tạp, xay thành bột mịn
Hình 2.1 Nguyên liệu thân cây xạ đen khô và dạng bột 2.1.3 Thiết bị - dụng cụ, hóa chất
- Bộ chiết Soxhlet (phòng thí nghiệm khoa Hóa – trường Đại học Sư Phạm – Đại học Đà Nẵng)
- Máy quang phổ hấp thụ nguyên tử AAS (Đài Khí tượng Thủy văn khu vực Trung Trung Bộ - 660 – Trưng Nữ Vương – Đà Nẵng)
- Máy sắc kí khí ghép khối phổ GC-MS (Trung tâm Kỹ thuật Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng II, số 2 Ngô Quyền – Đà Nẵng)
Phòng thí nghiệm khoa Hóa tại Đại học Sư phạm - Đại học Đà Nẵng được trang bị đầy đủ các thiết bị như tủ sấy, lò nung, cân phân tích, cốc thủy tinh, bình tam giác, ống nghiệm, bếp điện, bếp cách thủy, chén sứ, bình định mức, bình hút ẩm, các loại pipet và giấy lọc, phục vụ cho việc nghiên cứu và thực hành trong lĩnh vực hóa học.
Dung môi hữu cơ: Ethylacetat, diclomethan, n-hexan, …
Thuốc thử vô cơ: H 2 SO 4 , HNO 3
Sơ đồ nghiên cứu [4], [6], [7]
Sơ đồ 2.1 trình bày cách xác định thành phần hóa học của một số dịch chiết và kiểm tra hoạt tính sinh học của dịch chiết n-hexan từ thân cây xạ đen Việc phân tích này giúp hiểu rõ hơn về các hợp chất có trong cây xạ đen và tiềm năng ứng dụng của chúng trong y học.
Phương pháp xác định một số chỉ tiêu hóa lí [3], [7]
Bột thân cây xạ đen
Xác định độ ẩm, hàm lượng tro, hàm lượng kim loại
Bã n-hexan Dịch chiết n-hexan
Dịch chiết diclomethane Định danh thành phần hóa học các hợp chất trong dịch chiết
Chiết bằng dung môi n-hexan
Chiết bằng dung môi diclomethane
Chiết bằng dung môi ethylacetat Thử hoạt tính sinh học
Dược liệu thực vật cần phải tuân thủ giới hạn độ ẩm an toàn để tránh tình trạng mốc và hư hỏng Khi độ ẩm vượt quá mức cho phép, nguyên liệu sẽ dễ bị ảnh hưởng tiêu cực, làm giảm chất lượng và hiệu quả sử dụng.
Xây dựng chỉ tiêu độ ẩm cho nguyên liệu là việc xác định giới hạn tối đa cho phép của dược liệu nhằm đảm bảo chất lượng trong quá trình bảo quản Mỗi loại dược liệu có mức độ ẩm an toàn hoặc độ ẩm cho phép khác nhau, có thể cao hơn hoặc thấp hơn tùy thuộc vào đặc tính của từng nguyên liệu.
Chuẩn bị 5 chén sứ đã được rửa sạch và sấy khô trong tủ sấy, mỗi chén có ký hiệu mẫu riêng Sau khi sấy xong, cho các chén vào bình hút ẩm cho đến khi đạt nhiệt độ phòng, sau đó tiến hành cân khối lượng của các chén sứ (m1).
Lấy vào mỗi chén 5g bột xạ đen theo kí hiệu của mẫu đã ghi trên chén sứ Cân ghi nhận khối lượng mỗi mẫu (m 2 )
Tiến hành sấy chén sứ trong tủ sấy ở nhiệt độ 105°C trong 3 giờ, sau đó để nguội trong bình hút ẩm khoảng 15 phút rồi tiến hành cân Tiếp tục sấy và cân mỗi 30 phút cho đến khi khối lượng chén không đổi hoặc sai số khoảng 0,005g, lúc này dừng quá trình sấy Khối lượng được ghi nhận là m3, và độ ẩm của mỗi chén được tính bằng hiệu số khối lượng trước và sau khi sấy Độ ẩm chung là giá trị trung bình của 5 mẫu.
Độ ẩm của mỗi mẫu
Trong đó m 1 : Khối lượng chén sứ (g) m 2 : Khối lượng bột xạ đen trước khi sấy (g) m 3 : Khối lượng chén sứ và mẫu sau khi sấy (g) n : Số mẫu xác định độ ẩm
W : Độ ẩm của mỗi mẫu (%)
W TB : Độ ẩm trung bình (%)
2.3.2 Xác định hàm lượng tro
Xác định hàm lượng tro trong dược liệu là quá trình đo lường các chất vô cơ không bay hơi, bao gồm cả các tạp chất như đất và cát Thành phần vô cơ này có sự khác biệt giữa các loại cây do chúng sinh trưởng ở các vùng đất khác nhau.
Chuẩn bị năm chén sứ nung đã được rửa sạch và sấy ở nhiệt độ 100°C trong 30 phút Sau đó, nung các chén này trong lò ở 600°C trong 30 phút Cuối cùng, để nguội trong bình hút ẩm và cân để ghi nhận khối lượng của các chén sứ nung (m4).
Cho 5 mẫu vừa xác định độ ẩm vào chén sứ nung Tiếp theo nhỏ dung dịch
H2SO4 đặc được đun cẩn thận trên bếp điện cho đến khi than hóa hoàn toàn Sau đó, cho vào lò nung ở nhiệt độ 600°C cho đến khi thu được tro màu trắng ngà Sau khi làm nguội trong bình hút ẩm, cần cân để xác định khối lượng Quá trình nung được lặp lại cho đến khi khối lượng của chén sứ nung không thay đổi (m5).
Cách tính hàm lƣợng tro
Hàm lượng tro của mỗi mẫu
Hàm lượng tro trung bình
( ) ∑ ( ) Trong đó m 4 : Khối lượng chén sứ nung (g) m 2 : Khối lượng bột xạ đen (g) m 5 : Khối lượng chén sứ và mẫu sau khi tro hóa (g) n : Số mẫu xác định hàm lượng tro
X : Hàm lượng tro mỗi mẫu (%)
X TB : Hàm lượng tro trung bình (%)
2.3.3 Xác định hàm lượng kim loại nặng
Hàm lượng kim loại nặng trong cây thuốc có thể thay đổi tùy thuộc vào điều kiện thổ nhưỡng Ở những khu vực bị ô nhiễm, dược liệu có thể chứa lượng kim loại nặng cao, gây ảnh hưởng xấu đến sức khỏe người tiêu dùng.
Tro thu được sau khi nung được hòa tan trong dung dịch HNO3 loãng, sau đó được định mức bằng nước cất Hàm lượng kim loại nặng được xác định bằng phương pháp đo phổ hấp thụ nguyên tử AAS.
Khảo sát thời gian chiết [3], [4], [7]
Cân 20g bột thân cây xạ đen cho mỗi lần chiết, gói bằng giấy lọc
Lắp bộ chiết soxhlet và cho nguyên liệu vào, thêm 250ml dung môi
Tiến hành chiết trên bếp cách thủy (mỗi dung môi sẽ chiết ở một nhiệt độ khác nhau) trong thời gian 2h, 4h, 6h, 8h, 10h và 12h
Thu dịch chiết, làm bay hơi dung môi đến thể tích khoảng 20ml
Tiến hành cô quay chân không thu được cao xạ đen, cân khối lượng trên cân phân tích.
Xác định thành phần hóa học của thân cây xạ đen bằng phương pháp GC-MS [3], [5], [7]
Cân 20g bột thân cây xạ đen và chiết xuất lần lượt với 250ml dung môi n-hexan, diclomethane, và ethylacetat bằng bộ chiết Soxhlet Ba dịch chiết thu được được cô đuổi dung môi, sau đó phân tích bằng máy sắc ký khí ghép khối phổ tại Trung tâm Kỹ thuật Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng II, Đà Nẵng Phương pháp sắc ký khí ghép khối phổ cho phép xác định chính xác các thành phần hóa học trong mẫu.
Thử hoạt tính sinh học [1], [2], [9]
Thử hoạt tính độc tế bào
Phương pháp thử độ độc tế bào là một kỹ thuật quan trọng để phát hiện các chất có khả năng ức chế sự phát triển của tế bào ung thư trong điều kiện in vitro Trong nghiên cứu này, cao chiết n-hexan từ thân cây xạ đen được đánh giá khả năng kháng tế bào ung thư biểu mô KB tại Phòng Thử Hoạt tính Sinh học – Viện Hóa Học.
Phương pháp thử nghiệm sử dụng tế bào ung thư được duy trì trong điều kiện tiêu chuẩn và thử nghiệm với cao chiết n-hexan từ thân cây xạ đen ở năm nồng độ khác nhau (128, 32, 8, 2 và 0.5 µg/ml) trên đĩa 96 giếng Các đĩa thử nghiệm được ủ trong tủ ấm CO2 ở 37°C để tế bào phát triển Sau 3-5 ngày, tế bào được xử lý để xác định giá trị ức chế sinh trưởng, từ đó tính toán giá trị IC50.
18
Độ ẩm
Mẫu bột thân cây xạ đen khô được kiểm tra độ ẩm với 5 mẫu được lấy để xác định Độ ẩm chung được tính là độ ẩm trung bình của các mẫu này.
Hình 3.1 Mẫu xác định độ ẩm
Kết quả xác định độ ẩm trung bình của mẫu bột thân cây xạ đen khô được trình bày ở bảng 3.1
Bảng 3.1 Kết quả khảo sát độ ẩm ssssss m 1 (g) m 2 (g) m 3 (g) W (%) W TB (%)
Độ ẩm trung bình của thân cây xạ đen khô là 4.908%, cho thấy đây là mức độ an toàn để bảo quản nguyên liệu Mức độ ẩm này giúp duy trì chất lượng tốt và ngăn chặn sự phát triển của vi sinh vật và nấm mốc trong quá trình lưu trữ.
Hàm lượng tro
Lấy 5 mẫu vừa được xác định độ ẩm đem nung trong lò nung ở 600 0 C Khi tro có màu trắng, bột mịn, dùng kẹp lấy mẫu ra khỏi lò nung cho vào bình hút ẩm đến khi cốc nguội hẳn thì cân trên cân phân tích đến khối lượng không đổi Hàm lượng tro được lấy trung bình từ 5 mẫu trên
Hình 3.2 Mẫu xác định hàm lượng tro
Kết quả xác định hàm lượng tro trung bình được trình bày ở bảng 3.2
Bảng 3.2 Kết quả khảo sát hàm lượng tro
Hàm lượng tro trung bình trong thân cây xạ đen đạt 2,458%, phản ánh lượng các chất vô cơ không bay hơi có trong cây Sự khác biệt về điều kiện thổ nhưỡng ở các vùng khác nhau dẫn đến sự biến đổi trong thành phần các chất vô cơ này.
Xác định hàm lượng một số kim loại bằng phương pháp quang phổ hấp thụ nguyên tử AAS
Mẫu sau khi tro hóa được hòa tan bằng dung dịch HNO3 đặc, sau đó pha loãng và định mức trong bình định mức 100ml Dung dịch đã định mức được sử dụng để xác định hàm lượng một số kim loại nặng bằng máy quang phổ hấp thụ nguyên tử AAS tại Khoa Sinh – Môi Trường, Trường Đại học Sư phạm – Đại học Đà Nẵng và Đài Khí tượng Thủy văn Khu vực Trung Trung Bộ, 660 Trưng Nữ Vương – Đà Nẵng Kết quả phân tích được trình bày trong bảng 3.3 và phụ lục 1.
Bảng 3.3 Kết quả xác định hàm lượng kim loại nặng
STT Kim loại Kết quả
Hàm lƣợng cho phép (mg/kg)
Theo quyết định số 46/2007/QD-BYT của Bộ Y tế ban hành ngày 19-12-2007, các giới hạn tối đa về độ nhiễm sinh học và hóa học trong thực phẩm đã được quy định, trong đó hàm lượng kim loại nặng cho phép như Hg: 0.0500mg/kg, As: 1.0000mg/kg, Pb: 2.0000mg/kg Điều này cho thấy hàm lượng kim loại nặng trong thân cây xạ đen nằm trong giới hạn an toàn, không gây ảnh hưởng đến sức khỏe con người Do đó, thân cây xạ đen có thể được sử dụng để pha trà.
Kết quả khảo sát thời gian chiết bằng các dung môi khác nhau
Cân 20g bột thân cây xạ đen và cho vào giấy lọc, sau đó đặt vào bộ chiết soxhlet cùng 250ml dung môi n-hexan Tiến hành chiết ở nhiệt độ 69°C trong các khoảng thời gian 2h, 4h, 6h, 8h, 10h và 12h, thu được dịch chiết trong 6 bình tam giác đã được ký hiệu Sau đó, bay hơi dung môi đến thể tích khoảng 20ml, tiến hành cô quay chân không để thu cao chiết xạ đen và cân khối lượng trên cân phân tích Kết quả chiết xuất bằng dung môi n-hexan được trình bày chi tiết trong hình 3.3, bảng 3.4 và đồ thị 3.1.
Hình 3.3 Dịch chiết xạ đen bằng dung môi n-hexan Bảng 3.4 Kết quả khảo sát thời gian chiết bằng dung môi n-hexan
Khối lượng cốc và cao chiết (g)
Biểu đồ 3.1 Ảnh hưởng của thời gian chiết đến khối lượng riêng dịch chiết n- hexan
Thời gian tối ưu để chiết xuất trong dung môi n-hexan là 6 giờ, khi đó lượng cao chiết thu được đạt mức tối đa Nếu kéo dài thời gian chiết, mặc dù lượng cao chiết thu được có xu hướng giảm, nhưng sự giảm sút này không đáng kể.
Sau khi dùng bã n – hexan chiết soxhlet với 250ml dung môi diclomethane ở
Nghiên cứu được thực hiện với nhiệt độ 39 độ C trong các khoảng thời gian 2h, 4h, 6h, 8h, 10h và 12h, thu được các dịch chiết trong 6 bình tam giác đã được ký hiệu Sau đó, dung môi trong các dịch chiết được bay hơi đến thể tích khoảng 20ml, tiếp theo là tiến hành cô quay chân không để thu hồi cao chiết xạ đen Khối lượng cao xạ đen được xác định bằng cân phân tích Kết quả thu được từ quá trình chiết bằng dung môi diclomethane được trình bày trong hình 3.4, bảng 3.5 và đồ thị 3.2.
Hình 3.4 Dịch chiết xạ đen bằng dung môi diclomethane
Bảng 3.5 Kết quả khảo sát thời gian chiết bằng dung môi diclomethane
Khối lượng cốc và cao chiết (g)
Biểu đồ 3.2 Ảnh hưởng của thời gian chiết đến khối lượng riêng dịch chiết diclomethane
Thời gian tối ưu để chiết xuất bằng dung môi diclomethane là 6 giờ, khi đó lượng cao chiết thu được đạt mức tối đa Nếu thời gian chiết xuất kéo dài hơn 6 giờ, khối lượng cao chiết sẽ có xu hướng giảm dần.
Sau khi chiết xuất bằng bã diclomethan qua phương pháp Soxhlet với 250ml dung môi ethylacetat ở nhiệt độ 77°C trong các khoảng thời gian 2h, 4h, 6h, 8h, 10h và 12h, các dịch chiết được thu vào 6 bình tam giác đã được ký hiệu Sau đó, dung môi trong các dịch chiết được bay hơi đến thể tích khoảng 20ml, tiếp theo là quá trình cô quay chân không để thu được cao chiết xạ đen Khối lượng cao xạ đen được cân trên cân phân tích Kết quả thu được từ thời gian chiết bằng dung môi ethylacetat được trình bày trong hình 3.5, bảng 3.6 và đồ thị 3.3.
Hình 3.5 Dịch chiết xạ đen bằng dung môi ethylacetat Bảng 3.6 Kết quả khảo sát thời gian chiết bằng dung môi ethylacetat
Khối lượng cốc và cao chiết (g)
Biểu đồ 3.3 Ảnh hưởng của thời gian chiết đến khối lượng riêng dịch chiết ethylacetat
Thời gian tối ưu để chiết xuất bột thân cây xạ đen bằng dung môi ethylacetat là 10 giờ Trong khoảng thời gian này, lượng cao chiết thu được là lớn nhất; nếu kéo dài thời gian chiết, lượng cao thu được sẽ giảm dần.
XÁC ĐỊNH THÀNH PHẦN, CẤU TẠO CỦA MỘT SỐ HỢP CHẤT
3.2.1 Dịch chiết bằng dung môi n – hexan
Tiến hành chiết soxhlet 20g bột thân cây xạ đen bằng dung môi n-hexan ở nhiệt độ 69°C trong 6 giờ Sau khi bay hơi dung môi, thu được cao chiết n-hexan, được phân tích bằng thiết bị GC-MS tại Trung tâm Kỹ thuật Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng II (quatest II) ở Đà Nẵng Kết quả phân tích cho thấy nhiều thành phần cấu tạo trong dịch chiết n-hexan, với các hợp chất được định danh có thời gian lưu và hàm lượng cụ thể, được trình bày trong bảng 3.7 và phụ lục 2 Sự so sánh sắc ký đồ GC-MS với thư viện phổ chuẩn xác nhận sự đa dạng của các cấu tử trong dịch chiết.
Bảng 3.7 Thành phần hóa học dịch chiết n – hexan của thân cây xạ đen
(%) Định danh Công thức cấu tạo
Dựa vào bảng 3.7, dung môi n-hexan đã xác định được 10 cấu tử, trong đó alpha-Amyrin chiếm hàm lượng lớn nhất (23.43%), tiếp theo là Ergost-5-en-3-ol (3.beta.) (3.77%) và Stigmasterol (1.92%) Cả ba cấu tử này đều có hoạt tính sinh học đáng chú ý: Stigmasterol có tác dụng chống oxi hóa, hạ đường huyết và phòng ngừa một số loại ung thư như ung thư buồng trứng, ung thư vú, ung thư ruột kết, đồng thời ức chế hấp thu cholesterol; Ergost-5-en-3-ol (3.beta.) có khả năng chống viêm và ức chế các chất trung gian gây viêm liên quan đến viêm xương khớp; alpha-Amyrin có tác dụng giảm đau.
3.2.2 Dịch chiết bằng dung môi diclomethane
Bã n – hexan được chiết soxhlet với 250ml dung môi diclomethane, ở nhiệt độ
Dung môi diclomethane được bay hơi ở nhiệt độ 39 độ C trong 6 giờ để thu được cao chiết Cao chiết này sau đó được phân tích bằng thiết bị GC-MS tại Trung tâm Kỹ thuật Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng II (quatest II) ở số 2 Ngô Quyền, Đà Nẵng Kết quả phân tích cho thấy một số thành phần và cấu tạo của dịch chiết diclomethane, được trình bày chi tiết trong bảng 3.8 và phụ lục 3.
Bảng 3.8 Thành phần hóa học dịch chiết diclomethane của thân cây xạ đen
STT T R Hàm lượng(%) Định danh Công thức cấu tạo
Kết quả từ bảng 3.8 cho thấy 15 hợp chất đã được xác định trong dịch chiết diclomethane của cây xạ đen, trong đó alpha-Amyrin chiếm 6.38%, gamma-Sitosterol 6.77%, và Phenol, 4-(3-hydroxy-1-propenyl)-2-methoxy- 5.26% Các hợp chất này có hoạt tính sinh học, với alpha-Amyrin có tác dụng giảm đau và gamma-Sitosterol hỗ trợ điều trị u xơ tiền liệt tuyến cũng như giảm cholesterol trong máu.
3.2.3 Dịch chiết bằng dung môi ethylacetat
Bã diclomethane được chiết xuất bằng phương pháp soxhlet với 250ml dung môi ethylacetat ở nhiệt độ 77°C trong 10 giờ Sau khi bay hơi dung môi, cao chiết ethylacetat thu được và được phân tích bằng thiết bị GC-MS tại Trung tâm Kỹ thuật Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng II (quatest II) ở số 2 Ngô Quyền, Đà Nẵng Kết quả phân tích cho thấy một số thành phần và cấu trúc của dịch chiết ethylacetat, được trình bày chi tiết trong bảng 3.9 và phụ lục 4.
Bảng 3.9 Thành phần hóa học dịch chiết ethylacetat của thân cây xạ đen
STT T R Hàm lượng (%) Định danh Công thức cấu tạo
Kết quả từ bảng 3.9 cho thấy đã xác định được 7 hợp chất trong dịch chiết ethylacetat của cây xạ đen Các hợp chất chiếm hàm lượng lớn bao gồm alpha-Amyrin (3,51%), 4-((1E)-3-hydroxy-1-propenyl)-2-methoxy phenol (3,38%) và 2-Methoxy-4-vinylphenol (2,91%) Trong số đó, alpha-Amyrin có tác dụng giảm đau, trong khi beta-Sitosterol hỗ trợ điều trị u xơ tiền liệt tuyến và giảm cholesterol trong máu.
KẾT QUẢ THỬ HOẠT TÍNH SINH HỌC
Bột thân cây xạ đen được chiết xuất bằng phương pháp soxhlet với dung môi n-hexan ở nhiệt độ 69 độ C trong 6 giờ, thu được dịch chiết màu vàng Sau đó, dịch chiết này được cô quay chân không để loại bỏ dung môi, tạo thành cao chiết Cao chiết sau đó được gửi đến Phòng Thử Hoạt tính Sinh học tại Viện Hóa Học, số 18 Hoàng Quốc Việt, Cầu Giấy, Hà Nội.
Kết quả thử hoạt tính độc tế bào của cao n-hexan của thân cây xạ đen được trình bày trong bảng 3.10 và phụ lục 5
Bảng 3.10 Kết quả thử hoạt tính độc tế bào cao n-hexan của cây xạ đen
STT Tờn mẫu Giỏ trị IC 50 (àg/ml) Dũng tế bào KB
1 Cao n-hexan thân cây xạ đen 43.52
Cao chiết từ thân cây xạ đen đã được kiểm tra khả năng ức chế sự phát triển của tế bào ung thư thông qua phép thử gây độc tế bào với dòng tế bào KB Kết quả từ bảng 3.10 cho thấy, chất tham khảo Ellipticine có giá trị IC50 là 0.31 µg/ml, trong khi đó, cao n-hexan từ thân cây xạ đen không có khả năng ức chế dòng tế bào KB.
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
Kết luận
Qua qua trình nghiên cứu, chúng tôi đã thu được các kết quả sau đây:
Đã xác định được một số chỉ tiêu hóa lý
+ Hàm lượng kim loại nặng trong thân cây xạ đen phù hợp với tiêu chuẩn của Bộ Y
Tế về giới hạn tối đa độ nhiễm sinh học và hóa học trong thực phẩm
Đã khảo sát được thời gian chiết tốt nhất đối với một số dịch chiết thân cây xạ đen:
+ Dịch chiết n-hexan của thân cây xạ đen: thời gian chiết tốt nhất là 6h
+ Dịch chiết diclomethane của thân cây xạ đen: thời gian chiết tốt nhất là 6h
+ Dịch chiết ethylacetat của thân cây xạ đen: thời gian chiết tốt nhất là 10h
Phương pháp GC-MS đã được sử dụng để xác định các thành phần hóa học trong dịch chiết xạ đen Cụ thể, trong dịch chiết n-hexan, đã xác định được 10 hợp chất; trong dịch chiết diclomethane, có 15 hợp chất được định danh; và trong dịch chiết ethylacetat, đã xác định được 7 hợp chất Bên cạnh đó, còn tồn tại một số hợp chất với hàm lượng rất thấp hoặc chưa thể định danh tạm thời.
Các hợp chất có hoạt tính sinh học bao gồm alpha-Amyrin, có tác dụng giảm đau; beta-sitosterol, hỗ trợ điều trị u xơ tiền liệt tuyến và giảm cholesterol trong máu; Stigmasterol, với khả năng chống oxi hóa, hạ đường huyết và phòng ngừa các loại ung thư như ung thư buồng trứng, ung thư vú, và ung thư ruột kết, đồng thời ức chế hấp thu cholesterol; và Ergost-5-en-3-ol (3.beta.), có tác dụng chống viêm và ức chế một số chất trung gian gây viêm liên quan đến viêm xương khớp.
Dịch chiết n-hexan của cây xạ đen không có khả năng ức chế dòng tế bào ung thư biểu mụ KB (do cú giỏ trị IC 50 là 43.52àg/ml).
Kiến nghị
Thông qua kết quả của đề tài, tôi mong muốn đề tài được phát triển rộng hơn về một số vấn đề như:
Khảo sát hàm lượng các chất trong dịch chiết thân cây xạ đen từ các địa phương khác nhau nhằm đánh giá ảnh hưởng của thổ nhưỡng và khí hậu đến thành phần hóa học và tính chất của dịch chiết Nghiên cứu này cung cấp cơ sở khoa học quan trọng để hiểu rõ hơn về sự biến đổi chất lượng của cây xạ đen trong các điều kiện môi trường khác nhau.
Tách và phân lập các cấu tử tinh khiết từ dịch chiết cây xạ đen là bước quan trọng trong nghiên cứu Việc xác định cấu trúc và hoạt tính sinh học của các hợp chất này mở ra hướng đi mới cho ứng dụng trong dược học.
