CÁC xét NGHIỆM TRONG CHẨN đoán VIRUS gây VIÊM GAN SIÊU VI c

14:27, 21/10/2022 CÁC XÉT NGHIỆM TRONG CHẨN ĐOÁN VIRUS GÂY VIÊM GAN SIÊU VI C CÁC XÉT NGHIỆM TRONG CHẨN ĐOÁN VIRUS GÂY VIÊM GAN SIÊU VI C Nguyễn Thanh Tòng, Phạm Thị Thu Thủy, Hồ Tấn Đạt, Nguyễn Bảo Tồn, Nguyễn Bá Tịng, Nguyễn Thị Kiều Oanh, Đỗ Thị Thùy Trang   Viêm gan virus viêm gan C (HCV) bệnh nguy hiểm, khó điều trị, hậu bệnh nặng nề, chưa có thuốc chủng ngừa Chính vậy, việc xác định, định lượng định type HCV thông số cần thiết cho bác sĩ lâm sàng để lựa chọn phương án theo dõi điều trị bệnh nhân Chúng tơi thực kỹ thuật miễn dịch để tìm anti HCV, định serotype HCV, kỹ thuật sinh học phân tử để xác định HCVRNA PCR, định lượng virus máu Branched DNA Kết cho thấy có 70% trường hợp HCVRNA[+] 319 trường hợp anti HCV[+]; Serotype HCV 169 trường hợp chủ yếu type 6: 44.38%, thứ hai type 1: 37.28%, với type type khó đáp ứng điều trị đặc hiệu Kết định lượng cho thấy lượng virus cao cao chủ yếu thuộc type Qua kết thấy vai trò xét nghiệm sinh học phân tử chẩn đoán điều trị viêm gan siêu vi C   I Đặt vấn đề: Viêm gan siêu vi C (HCV) bệnh nguy hiểm triệu chứng lâm sàng thường mơ hồ, hậu bệnh để lại thường nặng nề như: 50%-80% chuyển qua mạn tính, có tới 20%-25% bệnh nhân mạn tính diễn tiến qua xơ gan ung thư gan 3,6,8,9,11,15 Do đó, chẩn đốn xác tác nhân HCV mục tiêu quan tâm hàng đầu bác sĩ, từ điều trị, theo dõi diễn tiến biến chứng bệnh, phòng ngừa lây lan HCV Ðể chẩn đoán viêm gan siêu vi C, xét ngiệm đánh giá chức gan, siêu âm xét nghiệm tìm HCV giữ vai trò quan trọng Bên cạnh xét nghiệm anti HCV, ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử chẩn đoán thường qui để xét nghiệm trực tiếp tìm HCVRNA, chứng nhiễm HCV & virus tăng sinh 6,8,9 Mặt khác, điều trị đặc hiệu HCV tốn kém, trước tiến hành điều trị ta nên đánh giá khả điều trị thành công cao hay thấp Hai yếu tố giữ vai trò quan trọng tiên lượng đáp ứng điều trị số lựơng virus loại (type) virus 2,6,8,9 Mục tiêu nghiên cứu là: (1) Khảo sát tỷ lệ HCVRNA bệnh nhân có anti HCV[+]; (2) Tìm hiểu mối tương quan số lượng HCVRNA type HCV; (3) Đánh giá khả phát triển xét nghiệm để đáp ứng việc chẩn đoán điều trị HCV www.drthuthuy.com/reseach/XetNghiemVGC.htm 1/8 14:27, 21/10/2022 CÁC XÉT NGHIỆM TRONG CHẨN ĐOÁN VIRUS GÂY VIÊM GAN SIÊU VI C II Đối tượng phương pháp nghiên cứu: 1.Ðối tượng nghiên cứu:   Các bệnh nhân chẩn đoán nhiễm HCV đến thực HCVRNA MEDIC, từ tháng 10/1999-6/2000 Các bệnh nhân viêm gan siêu vi C main tính , thực định lượng & serotype HCV trước bắt đầu điều trị đặc hiệu từ tháng 10/2002 đến tháng /2004 2.Phương pháp nghiên cứu: 2.1 AntiHCV: Kỹ thuật : miễn dịch gắn men vi hạt (MEIA: Microparticle Enzyme Immuno Assay).Test kit: AntiHCV, hệ ,Abbott Thực máy miễn dịch tự động AXSYM, Abbott 2.2 Định tính HCVRNA: Kỹ thuật Heminested PCR: Khếch đại DNA đích Ly trích RNA dựa theo qui trình Chomozynski Ly trích RNA Phenol – chroroform Thực Heminested PCR máy Bio-Rad, theo chu kỳ nhiệt : 40 ­ oC/10 min; 94­­ oC/ 30 sec, 70­­ oC/30 sec, 20 chu kỳ; 94­­ oC/30 sec, 56­­ oC/30 sec, 72­­ oC/2 min, 40 chu kỳ; 72­­ oC cho 10 PCR mix: Enzym Reverse Transcriptase (Pharmacia), Enzym Taq polymerase (Pharmacia), dNTP (Pharmacia), Primer (Invitrogen), UNG (Pharmacia), MgCL 2, Mn CL Điện di phân tích kết gel agarose, chụp hình hệ thống Gel Doc Bio-Rad 1.1 Ðịnh lượng HCV: Kỹ thuật: Branched DNA: Khếch đại tín hiệu Test kit: Bayer Thế hệ Thực máy System 340 bDNA Analyzer, Bayer 1.2 Serotype HCV: Kỹ thuật: Phản ứng miễn dịch gắn men Test kit: Murex Thực máy ELISA tự động ETI-STAR, Dia-Sorin 1.3 Phương pháp nghiên cứu: Tiền cứu cắt ngang III Kết quả: Thực PCR phát HCVRNA: www.drthuthuy.com/reseach/XetNghiemVGC.htm 2/8 14:27, 21/10/2022 CÁC XÉT NGHIỆM TRONG CHẨN ĐOÁN VIRUS GÂY VIÊM GAN SIÊU VI C Tổng số 1023 trường hợp nhiễm HCV thực HCVRNA PCR: Kết có 728 (71%) trường hợp HCVRNA [+]; 295 (29%) trường hợp HCVRNA [-] Có 319 trường hợp thực đồng thời anti HCV (Thế hệ 3) HCVRNA PCR: Kết có 223 (70%) trường hợp HCVRNA [+]; 96 (30%) trường hợp HCVRNA [-] Thực serotype HCV: Bảng   Type Số lượng Tỉ lệ (%) 63 37.28% 18 10.65% 3 1.77% 75 44.38% Không xác định 10 5.92% 169 100% Tổng cộng   Khảo sát mối tương quan số lượng HCV HCV serotype: Tổng cộng có 169 trường hợp Tuổi từ 21 – 71, độ tuổi trung bình 47,4 Giới: Nam 87 trường hợp (51.48%), nữ 82 trường hợp (48.52%) Phân bố số lượng virus theo serotype Bảng Type Số lượng copy < 10 10 – 10 10 – 10 10 – 10 6 > 10 Tổng số (%) (12.7) (7.94) (12.7) 31 (50.79) 10 (15.87) 63 (5.55) (16.67) (22.22) 10 (55.56)   18       (33.33) (66.67) 11 (14.67) 12 (16) 10 (13.33) 32 (42.67) 10 (13.33) 75 Indetermine   (10)   (70) (20) 10   Khảo sát số lượng virus theo nhóm type & tiên lượng đáp ứng với điều trị đặc hiệu Bảng 3: www.drthuthuy.com/reseach/XetNghiemVGC.htm 3/8 14:27, 21/10/2022 CÁC XÉT NGHIỆM TRONG CHẨN ĐOÁN VIRUS GÂY VIÊM GAN SIÊU VI C   SEROTYPE 2x 10 copies/ml >2x 10 copies/ml Tổng số 22 (34.92%) 41 (65.08%) 63 (44.44%) 10 (55.56%) 18   (100%) 33 (44%) 42 (56%) 75 Indetermine (10%) (90%) 10   IV Bàn luận: HCVRNA: Cho đến nay, xét nghiệm thường qui để chẩn đoán nhiễm HCV anti HCV Xét nghiệm dùng tầm soát người cho máu Nhờ hạn chế nhiều tỷ lệ nhiễm HCV sau truyền máu Tuy nhiên, số trường hợp như: Giai đoạn sớm viêm gan siêu vi C, mà chưa có kháng thể; Ở bệnh nhân bị suy giảm miễn dịch hay dùng thuốc ức chế miễn dịch; nồng độ anti HCV thấp có tình trạng anti HCV âm tính giả Mặc khác, mà bệnh nhân nhiễm khứ kháng thể tồn thời gian dài có đến 10 năm dù hết bệnh; đồng thời số trường hợp viêm gan tự miễn có Anti HCV dương tính giả 6,7,8,11 Chính áp dụng kỹ thuật PCR, kỹ thuật nhạy & đặc hiệu để tìm HCVRNA dùng đến xét nghiệm trực tiếp tìm HCV, nhờ xét nghiệm tránh số trường hợp âm tính dương giả Anti HCV 6,7 Chúng tơi khảo sát nhóm bệnh nhân thực Anti HCV : Một nhóm biết nhiễm HCV( Đã xét nghiệm Anti HCV ngồi, khơng rõ hệ test kit), nhóm thực Anti HCV hệ III MEDIC Bởi Anti HCV hệ I, II có độ nhạy & đặc hiệu Kết cho thấy khơng có khác biệt rõ rệt nhóm Như vậy, bệnh nhân thực Anti HCV hệ III trung tâm chúng tôi, bệnh nhân biết nhiễm siêu vi C từ lâu Theo kết nhóm thực HCVRNA, ta thấy có 71% & 70% trường hợp Anti HCV [+] có mang HCVRNA, chứng minh có mang virus dạng hoạt động Các trường hợp anti HCV [+], HCVRNA [-] do: bệnh nhân nhiễm khỏi bệnh, kháng thể tồn tại; HCVRNA dao động thể nên phải làm lại HCVRNA sau tháng để kiểm tra; Có thể viêm gan tự miễn Anti HCV dương giả; HCVRNA âm tính giả kỹ thuật thực PCR Serotype HCV: www.drthuthuy.com/reseach/XetNghiemVGC.htm 4/8 14:27, 21/10/2022 CÁC XÉT NGHIỆM TRONG CHẨN ĐOÁN VIRUS GÂY VIÊM GAN SIÊU VI C Kết xác định type HCV trình bày bảng Chúng tơi áp dụng kỹ thuật miễn dịch để định type HCV Ưu điểm kỹ thuật đơn giản, thực máy hồn tồn tự động, rẻ, khơng sợ nguy ngoại nhiễm Sử dụng kháng nguyên vùng NS (Không cấu trúc) 1,16 Tuy nhiên, phương pháp có số nhược điểm như: Khơng định subtype, xác định kháng thể nên không rõ bệnh nhân cịn mang HCVRNA khơng, bệnh nhân bị ức chế miễn dịch hay suy giảm miễn dịch khơng có anti HCV khơng xác định type, không phân biệt anti HCV nhiễm trước tồn & type HCV nhiễm, số dịng làm cho ta khơng xác định type 2,3 Sự phù hợp serotype genotype cịn nhiều bàn cãi nhiều cơng trình cơng bố kết khác Theo tài liệu cung cấp hãng Murex, Murex HCV serotyping định type 84.7%(221/261) trường hợp, với 93.7%(207/221) trường hợp phù hợp với genotype 16 Theo Matinot & CS: thực serotype HCV 220 trường hợp có 8% khơng phù hợp với sequencing, độ đặc hiệu 72%, độ nhạy 78% Tuveri & CS: Độ phù hợp serotype LiPA 12/21 ca(57%) bệnh nhân HIV[-], 4/19 (21%) ca có HIV [+] Nói chung, độ phù hợp serotype với kháng thể từ vùng NS4 genotype HCV 65-75%, 50-60% bệnh nhân bị ức chế miễn dịch Theo kết trình bày bảng 1, serotype chiếm tỷ lệ chủ yếu type Với type type khó đáp ứng với điều trị đặc hiệu, đồng thời chiếm tỷ lệ cao trường hợp tái phát 5,6,9,14 Type thường gặp vùng Đông Nam Á 3,6 nên khả đáp ứng điều trị đặc hiệu chưa có nhiều nghiên cứu Theo Nguyễn Thanh Hảo & CS, thực 123 đối tượng cho máu tình nguyện, tỷ lệ genotype HCV type1: 1a: 15.4%, 1b: 48.8%, 1: 5.6%; 6: 14.6% ; Theo P Trimoulet & CS thực genotype HCV 10 trường hợp: 1a: 10%, 1b : 40%, 6a: 50% 13 Như vậy, kể genotype & serotype cho thấy type HCV chủ yếu Việt Nam type & Tuy nhiên cần có nghiên cứu với số lượng lớn khẳng định cho điều Trong thời gian tới, trung tâm tiến hành áp dụng kỹ thuật : INNOLiPA Sequencing việc định genotype HCV kỹ thuật thường qui Khi đó, có đủ liệu để biết type HCV Việt Nam Số lượng virus HCV type khác nhau: Số lượng virus & type HCV yếu tố quan trọng việc tiên lượng đáp ứng với điều trị đặc hiệu Type thường khó đáp ứng với điều trị đặc hiệu.Theo bảng ta thấy: Số lượng virus type nhiều: Type có 41 trường hợp (65.08%) 2x10 copies/ml; 10 trường hợp (15.87% ) 10 copies/ml Type có 42 trường hợp (56%) 2x10 copies/ml; 10 trường hợp (13.33%) 10 copies/ml Bên cạnh đó, type có 10 trường hợp (55.56%) 2x10 copies/ml, nhiên có 18 trường hợp type nên khó nói type luợng virus cao Điều đặc biệt chúng tơi ghi nhận khơng có trường hợp type mà lượng virus cao 10 copies/ml Do nên thường type bệnh nhân đáp ứng cho điều trị đặc www.drthuthuy.com/reseach/XetNghiemVGC.htm 5/8 14:27, 21/10/2022 CÁC XÉT NGHIỆM TRONG CHẨN ĐOÁN VIRUS GÂY VIÊM GAN SIÊU VI C hiệu tốt Ngoài ra, 10 trường hợp không xác định type, lượng virus thường cao: trường hợp (90%) 2x10 copies/ml, có trường hợp (20%) 10 copies/ml Như trường hợp không xác định khó có đáp ứng tốt với điều trị đặc hiệu, để xác định type phải thực thêm genotype Đây lý tiến tới thực INNOLiPA & Sequencing cho định genotype HCV chẩn đoán thường qui V Kết luận: Viêm gan virus C cịn khó khăn chẩn đoán, điều trị đắt tiền mà hiệu cịn hạn chế, chưa có thuốc chủng ngừa Tần suất mang HCVRNA bệnh nhân anti HCV[+] 70% Như trường hợp anti HCV[+] mà khơng có HCVRNA chiếm 30% trường hợp Hai serotype chủ yếu nhóm bệnh nhân chúng tơi & 6; với type có tiên lượng đáp ứng với điều trị Do đó, cần có nghiên cứu với số lượng lớn hơn, áp dụng kỹ thuật sinh học phân tử LiPA, sequencing để xác định genotype, từ có lựa chọn điều trị đặc hiệu tốt cho bệnh nhân nhiễm HCV Kết thực định lượng virus trước& điều trị giúp ích nhiều cho việc lựa chọn phương pháp điều trị, chọn thuốc, liều, thời điểm ngưng điều trị     SUMMARY TESTS TO DIAGNOSIS VIRAL HEPATITIS C   Hepatitis causing by hepatitis C virus is the dangerous and difficult treatable disease, left the heavy consequences to the patients, and does not have the available vaccin Therefore, the determination, qualification, as well as typing of HCV are the necessary parameters to meet the requirement of physicians while they select the most propriety regime to treat and follow up the infected patients In this study, we are have carried out the immunoassay to detect anti HCV and serotype of HCV from patients’sera; performed the molecular biology assay to detect HCV RNA (using RT-PCR tagert the 5’UT region of viral genome), and to quatify the HCV in the patients blood (using bDNA) The received results have demonstrated that 70% HCVRNA[+] among 319 cases with anti HCV[+] With 169 cases that have been done the serotyping, the most common serotypes detected are type (44,6%) and type 1(37,3%) Type is referred as the most difficult to response to the specific treatment From the quantification assay, the results have also received that type and type infected patients with high quantity of viremia From this study, the role of the molecular biology assays are www.drthuthuy.com/reseach/XetNghiemVGC.htm 6/8 14:27, 21/10/2022 CÁC XÉT NGHIỆM TRONG CHẨN ĐOÁN VIRUS GÂY VIÊM GAN SIÊU VI C defined as the very necessary laboratory tool to help phycisians in diagnostic as well as treatment of patients with HCV infection   REFERENCES   Decker et al Hepatitis C 1997: Essay and Expert Opinions on its Natural History, Epidermiology, Diagnosis and Therapy Abbott Diagnostics Division Detmer et al Accurate Quantification of Hepatitis C Virus (HCV) RNA from All HCV Genotypes by Using Branched- DNA Technology Journal Of Clinical Microbiology Vol.34, No Apr 1996, p 901-907 DEV et al Southeast Asian Patients With Chronic Hepatitis C: The Impact of Novel Genotypes and Race on Treatment Outcome Hepatology, Vol 36, No 5, 2002 Nguyễn Thanh Hảo et al Genotýp virút viêm gan C Việt Nam Hội nghị chuyên đề bệnh gan mật Hội gan mật Hà Nội Tháng 4/2000 Hawkins et al Comparison of Plasma Virus Loads among Individuals Infected with Hepatitis C Virus (HCV) Genotypes 1, 2, and by Quantiplex HCV RNA Assay Versions and 2, Roche Monitor Assay, and an In-House Limiting Dilution Method Journal Of Clinical Microbiology Vol 35, No Jan 1997, p 187-192 Johannes Bircher et al Clinical Hepatology Second Edition Oxford University Press 1999 p 858-868, 903-922 Judith C Wilber et al Serological and Virological Diagnostic Tests for Hepatitis C Virus Infection Seminars in Gastrointestinal Disease, Vol 6, No January, 1995 p 13-19 Lothar Thomas Clinical Laboratory Diagnostics, Use and Assessment of Clinical Laboratory Results TH- Books 1999 p 1273-1278 NIH Consensus Statement National Institutes of Health Consensus Development Conference Statement: Management of Hepatitis C: 2002-June 1012, 2002 Hepatology, Vol 36, No 5, Suppl 2002 Leonard B Seeff Natural History of Chronic Hepatitis C Hepatology, Vol 36 No Suppl 2002 Sheila Sherlock & James Dooley Diseases of the Liver and Biliary System Elaventh Edition Blackwell Sciencen Ltd 2002 p 305-316 Thierry Poynard Hepatitis B and C, Management and Treatment Mertin Dunitz Ltd 2002 p 67-136 P Trimoulet, H.J.A Fleury Genomic Characterization of Vietnamese HCV Isolates by a Novel Sequencing Mothod The 50 th Annual Meeting & Postgraduate Courses of The AASLD November 5-9, 1999, Dallas, Texas USA Yamada et al Efficacy of Interferon Alfa Therapy in Chronic Hepatitis C Patients Depends Primarily on Hepatitis C Virus RNA Lavel Hepatology, Vol 22, No 5, 1995 www.drthuthuy.com/reseach/XetNghiemVGC.htm 7/8 14:27, 21/10/2022 CÁC XÉT NGHIỆM TRONG CHẨN ĐOÁN VIRUS GÂY VIÊM GAN SIÊU VI C Wilber J.C Manual of Clinical Microbiology 1995 Hepatitis C Virus, p 10501055 Murex HCV Serotyping 1-6 Assay Packing Insert Product Code HC02 1998 www.drthuthuy.com/reseach/XetNghiemVGC.htm 8/8 ... 21/10/2022 C? ?C XÉT NGHIỆM TRONG CHẨN ĐOÁN VIRUS GÂY VI? ?M GAN SIÊU VI C II Đối tượng phương pháp nghiên c? ??u: 1.Ðối tượng nghiên c? ??u:   C? ?c bệnh nhân chẩn đoán nhiễm HCV đến th? ?c HCVRNA MEDIC, từ tháng... www.drthuthuy.com/reseach/XetNghiemVGC.htm 7/8 14:27, 21/10/2022 C? ?C XÉT NGHIỆM TRONG CHẨN ĐOÁN VIRUS GÂY VI? ?M GAN SIÊU VI C Wilber J .C Manual of Clinical Microbiology 1995 Hepatitis C Virus, p 10501055... www.drthuthuy.com/reseach/XetNghiemVGC.htm 2/8 14:27, 21/10/2022 C? ?C XÉT NGHIỆM TRONG CHẨN ĐOÁN VIRUS GÂY VI? ?M GAN SIÊU VI C Tổng số 1023 trường hợp nhiễm HCV th? ?c HCVRNA PCR: Kết c? ? 728 (71%)