tiểu luận tìm hiểu cách thu nhận kiểm tra độ tinh sạch và hoạt tính của enzyme có nguồn gốc từ vi sinh vật

BỘ CÔNG THƯƠNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP TP HỒ CHÍ MINH VIỆN CƠNG NGHỆ SINH HỌC – THỰC PHẨM  ĐỀ TÀI: Tìm hiểu cách thu nhận kiểm tra độ tinh hoạt tính enzyme có nguồn gốc từ vi sinh vật GVHD: Nguyễn Thị Trang NHÓM THỰC HIỆN: NHÓM 12 LỚP HP: ĐHTP10B LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com BỘ CÔNG THƯƠNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC CƠNG NGHIỆP TP HỒ CHÍ MINH VIỆN CƠNG NGHỆ SINH HỌC – THỰC PHẨM ĐỀ TÀI NHÓM THỰC HIỆN: NHÓM 12 LỚP HP: ĐHTP10B GVHD: Nguyễn Thị Trang LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 1/ Lê Trí Thanh Giang (Nhóm trưởng) 14065321 2/ Võ Trần Mỹ Phương 14070761 3/ Nguyễn Thị Yến Ly 14071451 4/ Phạm Đức Quỳnh Như 14067021 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com LỜI CẢM ƠN Chúng em xin chân thành cảm ơn cô hướng dẫn cho chúng em mặt lý thuyết, hướng dẫn tài liệu tham khảo để chúng em có cở sở tìm hiểu hồn thành tiểu luận Chúng em xin chân thành cảm ơn Nhà trường, Thư viện tạo điều kiện thuận lợi đê chúng em tìm hiểu, nghiên cứu hồn thành tiểu luận LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com MỤC LỤC PHẦN MỞ ĐẦU 1/ Lý chọn đề tài 2/ Mục đích nghiên cứu 3/ Nội dung 4/ Kết nghiên cứu PHẦN NỘI DUN G 1/ Giới thiệu chung enzyme 1.1/ Định nghĩa 1.2/ Tính chất enzyme 2/ Thu nhận enzyme từ vi sinh vật 2.1/ Thu nhận enzyme thô 2.2/Các phương pháp thu nhận enzyme thô 2.2.1/ Pháp pháp học 2.2.2/ Phương pháp cô đặc 2.2.3/ Phương pháp siêu lọc 2.3/ Các phương pháp tinh enzyme 2.3.1/ Phương pháp kết tinh 2.3.2/ Phương pháp điện di 2.3.3/ Phương pháp sắc ký 3/ Các phương pháp kiểm tra độ tinh enzyme từ vi sinh vật 4/ Hoạt tính enzyme từ vi sinh vật 5/ Quy trình sản xuất, phương pháp kiểm tra độ hoạt tính enzyme lipase 6/ Quy trình sản xuất, phương pháp kiểm tra độ hoạt tính enzyme amylase LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 7/ Quy trình sản xuất, phương pháp kiểm tra độ hoạt tính enzyme pecrinase 8/ Quy trình sản xuất, phương pháp kiểm tra độ hoạt tính enzyme protease PHẦN KẾT LUẬN TÀI LIỆU THAM KHẢO LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com PHẦN MỞ ĐẦU 1/ Lý chọn đề tài: Trước kỷ XVII người ta biết sử dụng trình enzyme đời sống song có tính chất kinh nghiệm thực tế thông qua hoạt động vi sinh vật Ðó q trình lên men rượu, muối dưa, làm tương nước chấm Ở thời kỳ người ta chưa hiểu chất enzyme trình lên men Cho đến đầu kỷ XIX nhà khoa học khái quát trình lên men tượng phổ biến sống vai trị qua trọng enzyme chuyển hố chất trình lên men Đến việc nghiên cứu enzyme bước vào giai đoạn với kết hợp nhiều ngành khoa học khác nhau: hoá học protein, lý sinh phân tử, sinh học phân tử…Trong nghiên cứu thu nhận, tinh chế enzyme, hay thiết kế định hướng phân tử enzyme ưu việt dạng tự nhiên Chế phẩm enzyme không ứng dụng y học mà ứng dụng nhiều lãnh vực công nghiệp khác nhau, nơng nghiệp, hóa học… Do vậy, q trình thu nhận tinh protein/enzyme giữ vai trò quan trọng không ngừng cải tiến để đạt độ tinh cao để phụ vụ cho người 2/ Mục đích nghiên cứu: Hiểu nắm rõ phương pháp thu nhận enzyme từ vi sinh, phương pháp kiểm tra độ tinh hoạt tính enzyme từ vi sinh vật để ứng dụng công nghệ nuôi cấy, sản xuất loại enzyme phục vụ cho lĩnh vực khác Biết phương pháp để đánh giá độ tinh enzyme từ vi sinh vật, lựa chọn loại dịch chiets có độ tinh phù hợp với mục đích nghiên cứu 3/ Nội dung: 1/ Giới thiệu chung enzyme 1.1/ Định nghĩa 1.2/ Tính chất enzyme 2/ Thu nhận enzyme từ vi sinh vật 2.1/ Thu nhận enzyme thô 2.2/Các phương pháp thu nhận enzyme thô LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 2.2.1/ Pháp pháp học 2.2.2/ Phương pháp cô đặc 2.2.3/ Phương pháp siêu lọc 2.3/ Các phương pháp tinh enzyme 2.3.1/ Phương pháp kết tinh 2.3.2/ Phương pháp điện di 2.3.3/ Phương pháp sắc ký 3/ Các phương pháp kiểm tra độ tinh enzyme từ vi sinh vật 4/ Hoạt tính enzyme từ vi sinh vật 5/ Quy trình sản xuất, phương pháp kiểm tra độ hoạt tính enzyme lipase 6/ Quy trình sản xuất, phương pháp kiểm tra độ hoạt tính enzyme amylase 7/ Quy trình sản xuất, phương pháp kiểm tra độ hoạt tính enzyme pecrinase 8/ Quy trình sản xuất, phương pháp kiểm tra độ hoạt tính enzyme protease 4/ Kết nghiên cứu - Nắm quy trình thu nhận , tinh , kiểm tra hoạt tính loại enzyme vi sinh vật Từ đó, lựa chọn giống vi sinh vật phù hợp với mục đích nghiên cứu - Hiểu quy trình thu nhận, tinh sạch, kiểm tra hoạt tính loại enzyme lipase, amylase, pectinase, protease từ nguồn vi sinh vật Ứng dụng nghiên cứu nhân giống vi sinh vật, sản xuất enzyme vi sinh vật với quy mô công nghiệp, làm giảm giá thành sử dụng LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com PHẦN NỘI DUNG 1/ GIỚI THIỆU CHUNG VỀ ENZYME 1.1/ Định nghĩa: - Enzyme protein có khả xúc tác cho phản ứng hóa học với mức đặc hiệu khác nhiệt độ tương đối thấp - Trong phản ứng enzyme xúc tác phân tử lúc ban đầu trình gọi chất, enzyme biến đổi chúng thành phân tử khác Enzyme có hiệu suất xúc tác lớn chất xúc tác hữu co vô khác Enzyme không xúc tác phản ứng thể sống, mà sau tách khỏi thể sống chúng giữ hoạt tính xúc tác điều kiện xác định - Enzyme có tính đặc hiệu, nghĩa loại enzyme xúc tác cho chất định 1.2/ Tính chất enzyme: - Enzyme có chất protein nên có tất thuộc tính lý hóa protein Đa số loại enzyme có dạng hình cầu khơng qua màng bán thấm có kích thước lớn - Tan nước dung môi hữu phân cực, không tan ete dung môi không phân cực - Dễ bị biến tính nhiệt độ cao Trong mơi trường axit bazo làm enzyme khả hoạt động - Enzyme có tính lưỡng tính - Tính cường lực xúc tác - Tính đặc hiệu - Làm giảm lượng hốt hóa phản ứng - Enzyme có hai nhóm: enzyme cấu tử ( chứa protein) enzyme hai cấu tử ( phân tử có nhóm khơng phải protein)  Trong phân tử enzyme hai cấu tử có hai phần: • Apoenzym: Phần protein, nâng cao lực xúc tác E, định tính đặc hiệu LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 5, tạo thành sinh khối không bị ảnh hưởng tạo thành enzyme pectinase bị kìm hãm _ Vật liệu gieo cấy sợi nấm 24,32 48h tuổi với hàm lượng từ 210% Đối với A.niger A.awamori vật liệu gieo cấy sợi nấm ủ sơ môi trường dinh dưỡng bắt đầu nứt nanh bào tử, thời gian ủ sơ thường 38-42h Lượng sợi nấm đem gieo cấy thường 2% Trong trình ni cấy, hàm lượng chất hịa tan mơi trường giảm từ 6% xuống cịn 1.51.8% _ Để thu chế phẩm khô, cần tách sợi nấm khỏi canh trường lỏng cô đặc chân không canh trường lỏng đến hàm lượng chất khô đạt 5-8% sấy khô thiết bị sấy phun Điều kiện sấy phun nhiệt độ chất tải nhiệt vào phải đạt 1651800C đạt 60-700C Thời gian lưu chế phẩm enzyme thiết bị sấy phun phải không giây nhiệt độ chế phẩm sau sấy phải không 400C Chế phẩm thu cần phải đóng gói kín để tránh hút ẩm + Phương pháp yếm khí _ Mơi trường: bã củ cải 2%, (NH4)2HPO4 0.75%, KH2PO4 0.1%, CaCO3 0.3%, nước chiết ngô 0.5% _ Clostridium pectinofermentants 15 có khả tổng hợp pectinase cách mạnh mẽ pha tăng trưởng trình sinh trưởng tăng đồng thời với tích lũy sinh khối Sự tích lũy enzyme tối đa tương ứng với pha ổn định sinh trưởng qua 55-60h, pH ban đầu môi trường dinh dưỡng 6.5-7 Vật liệu gieo cấy ban đầu chuẩn bị trạng thái canh trường chứa bào tử cấy với lượng 4% theo thể tích Q trình nuôi cấy tiến hành nhiệt độ 350C _ Cl.felsineum ni cấy yếm khí để thu pectinase Có thể tiến hành thu chế phẩm từ dịch lọc canh trường cách kết tủa enzyme với dung môi hữu với muối amoni sulfat Nếu kết tủa dung môi hữu cơ, pH dung dịch xử lý 6.5-6.8 Nếu kết tủa 2-2.5 thể tích aceton hoạt độ enzyme kết tủa đạt 93-95% so với hoạt độ ban đầu _ Khi kết tủa ammonium sulfat có độ bão hịa 0.2 thu chế phẩm chứa pectinesterase pectintranseliminase, độ bão hịa 0.9-1 sẻ thu chế phẩm chứa pectintrenseliminase exopolygalacturonase Tinh enzyme pectinase phương pháp lọc màng (cross flow membrane) LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com _ Tiến hành kết tủa enzyme từ 500 ml dịch chiết thu ethanol 960, nhiệt độ kết tủa 40C, thời gian kết tủa Sau đó, ly tâm 5000 vịng/phút 15 phút thu enzyme thơ Hịa tan enzyme thô 500 ml dung dịch đệm Mc IIvaine pH 4,5 Tiến hành lọc 500 ml dung dịch enzyme vừa hòa tan hệ thống lọc QuixStand Benchtop Systems ( hãng Amersham Biosciences) với lọc màng (membrane) có khoảng phân đoạn 50kDa Tốc độ bơm mẫu đầu vào 150rpm & 200rpm điều chỉnh cho áp suất bề mặt màng không Psi Thu dịch qua lọc xác định hiệu suất thu hồi enzyme hoạt độ tương ứng _ Sau lọc dung dịch enzyme kết thu lọc với tốc độ bơm 150rpm thu dịch qua lọc Kết thu hiệu suất thu hồi enzyme hoạt độ đạt 27,87% 87,98%, độ tinh tăng 3,1 lần Khi tăng tốc độ bơm lên 200rpm hiệu suất thu hồi enzyme hiệu suất hoạt độ đạt 33,33% 73,65% độ tinh tăng 2,2 lần _ Quá trình sinh tổng hợp pectinase mơi trường có chất cảm ứng chủng Asp.niger có hoạt độ riêng cao sau 72 đạt 8,97-10.2 (UI/mg protein) _ Thu nhận enzyme pectinase sau 48 ni cấy sau đem tiến hành tinh _ Nguyên nhân tăng tốc độ bơm lên 200rpm áp suất đầu vào tăng (5,2 Psi) làm cho dòng chảy lọc chuyển động rối, phân tử va đập mạnh vào đẩy chúng vào thành lọc kết hình thành màng mỏng xung quanh thành lọc ( hay gọi lớp trở lực ) Mặt khác tác dụng lực ly tâm dòng chảy đẩy số phân tử màng mỏng theo dịch qua lọc phía ngồi Vì tốc độ bơm đầu vào 150rpm thực trình tinh tốt Phương pháp xác định hoạt tính enzyme pectinase _ Phương pháp đông chung (Cu-pectat) + Thủy phân pectin tác dụng pectinase Sau dùng CuSO4 5% để kết tủa axit pectin dạng đồng pectat (Cu-pectat) Hòa tan kết tủa NH4OH 25% Xác định lượng đồng nhờ iot Một đơn vị hoạt động pectinase theo phương pháp lượng enzyme có khả xúc tác thủy phân hết 1mg pectin thời gian điều kiện tiêu chuẩn LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com _Ngồi ra, người ta cịn sử dụng phương pháp khác phương pháp nhớt kế, phương pháp so màu 8/ Quy trình sản xuất, phương pháp kiểm tra độ hoạt tính enzym protease: 8.1/ Nguồn thu nhận: - Nguồn vi sinh vật thu nhận enzyme Protease chủ yếu gồm: vi khuẩn, nấm mốc, xạ khuẩn 8.1.1/ Vi khuẩn: Lượng Protease sản xuất từ vi khuẩn ước tính vào khoảng 500 tấn, chiếm 59% lượng enzyme sử dụng Protease động vật hay thực vật chứa hai loại endopeptidase exopeptidase, riêng vi khuẩn có khả sinh hai loại trên, Protease vi khuẩn có tính đặc hiệu chất cao Chúng có khả phân hủy tới 80% liên kết peptide phân tử protein Các chủng vi khuẩn có khả tổng hợp mạnh Protease Bacillus subtilis, B.mesentericus, B.thermorpoteoliticus số giống thuộc chi Clostridium Trong đó, B.subtilis S5 có khả tổng hợp Protease mạnh Các vi khuẩn thường tổng hợp Protease hoạt động thích hợp vùng pH trung tính kiềm yếu Các Protease trung tính vi khuẩn hoạt động khoảng pH hẹp (pH 5-8) có khả chịu nhiệt thấp Các Protease trung tính tạo dịch thủy phân protein thực phẩm đắng so với Protease động vật tăng giá trị dinh dưỡng Chúng cịn có khả lực cao acid amin ưa béo thơm sinh nhiều B.subtilis, B.mesentericus, B thermorpoteoliticus số giống thuộc chi Clostridium Protease Bacillus ưa kiềm có điểm đẳng điện 11, khối lượng phân tử từ LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 20.000-30.000dalton Ổn định khoảng pH 6-12 hoạt động khoảng pH rộng 7-12 8.1.2/ Nấm mốc Nhiều loại nấm mốc có khả tổng hợp lượng lớn Protease ứng dụng công nghiệp thực phẩm chủng: Aspergillus oryzae, A terricola, A fumigatus, A saitoi, Penicilliumchysogenum)… loại nấm mốc có khả tổng hợp ba loại P: acid, kiềm trung tính Nấm mốc đen tổng hợp chủ yếu Protease acid, có khả thủy phân protein pH 2,5-3 Một số nấm mốc khác như: A candidatus, P cameberti, P roqueforti… có khả tổng hợp Protease có khả đơng tụ sữa sử dụng sản xuất phomát 8.1.3/ Xạ khuẩn Về phương diện tổng hợp Protease, xạ khuẩn nghiên cứu vi khuẩn nấm mốc Tuy nhiên, người ta tìm số chủng có khả tổng hợp cao như: Streptomyces grieus, S fradiae, S trerimosus… Các chế phẩm xạ khuẩn biết nhiều pronase (Nhật) tách chiết từ S.grieus, enzyme có đặc tính đặc hiệu rộng, có khả thủy phân tới 90% LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com liên kết peptide nhiều protein thành acid amin Từ S fradiae tách chiết keratinase thủy phân karetin Ở Mỹ, CP sản xuất có tên M-Zim dùng sản xuất da Protease từ S fradiae có hoạt tính elastase cao, chúng dùng cơng nghiệp chế biến thịt 8.2/ Phương pháp thu nhận enzyme protease từ vi sinh vật 8.2.1/ Tuyển chọn cải tạo giống vi sinh vật cho enzyme có hoạt lực cao Để chọn giống vi sinh vật có khả sinh tổng hợp enzyme cao, người ta phân lập từ mơi trường tự nhiên dùng tác nhân gây đột biến tác động lên máy di truyền làm thay đổi đặc tính Để chọn giống vi sinh vật có khả sinh tổng hợp enzyme cao, người ta phân lập từ mơi trường tự nhiên dùng tác nhân gây đột biến tác động lên máy di truyền làm thay đổi đặc tính di truyền để tạo thành biến chủng có khẳ tổng hợp đặc biệt hữu hiệu loại enzyme đó, cao hẳn chủng gốc ban đầu c tính di truyền để tạo thành biến chủng có khẳ tổng hợp đặc biệt hữu hiệu loại enzyme đó, cao hẳn chủng gốc ban đầu Có thể thơng qua phương pháp sau: - Phương pháp gây đột biến - Phương pháp biến nạp - Phương pháp tiếp hợp gene - Phương pháp tải nạp LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 8.2.2/ Môi trường nuôi cấy vi sinh vật tổng hợp enzyme Protease Để tổng hợp enzyme Protease cần phải chọn mơi trường thành phần mơi trường dinh dưỡng có ảnh hưởng trực tiếp đến sinh trưởng tổng hợp enzyme vi sinh vật Trong thành phần mơi trường phải có đủ chất đảm bảo sinh trưởng bình thường vi sinh vật tổng hợp enzyme Đặc biệt lưu ý để tăng tổng hợp enzyme người ta thường dựa vào tượng cảm ứng Vì thành phần mơi trường có chất cảm ứng chất hay sản phẩm phân giải kìm hãm làm yếu tác dụng kìm toả chất kìm hãm nhằm bảo đảm khả sinh tổng hợp enzyme cho không bị cản trở Chất cảm ứng tổng hợp enzyme cho thêm vào môi trường nuôi thường chất tương ứng enzyme cần tổng hợp Thành phần mơi trường: C, N, H, O Ngồi chất vơ cơ: Mn, Ca, P, S, Fe, K chất vi lượng khác 8.2.2.1/Nguồn cacbon: Thường hợp chất hữu chủ yếu gluxit, tùy thuộc vào đặc tính enzyme nòi vi sinh vật mà người ta lựa chọn cho thích hợp - Có nhiều hợp chất hydratcacbon hợp chất khác nguồn cacbon thích hợp nấm mốc sinh enzyme Protease có hoạt lực cao LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Các nguồn cacbon có tác dụng đến sinh tổng hợp Protease Asp oryzae 79có thể theo thứ tự: fructoza→ sacaroza→ maltoza→ glucoza→ manit→ arabinoza→ galactoza - Tinh bột nguồn cacbon nhiều chủng vi khuẩn sinh tổng hợp enzyme Protease 8.2.2.2/ Nguồn nitơ Nguồn nitơ sử dụng phong phú, bao gồm nhóm: vơ hữu Đối với số loài nấm mốc thuộc họ (A oryzae, A awamori, A niger, A flavus) môi trường có nguồn nitơ hữu sinh tổng hợp Protease axit cao Nhiều kết nghiên cứu cho thấy sinh tổng hợp enzyme nâng cao môi trường có đồng thời nguồn nitơ hữu nitơ vơ Cho thêm vào mơi trường có cám mì, bột đậu tương tách chất béo, nguồn nitơ hữu hoạt lực enzyme Protease tăng 22- 74% Cịn trường hợp dùng nguồn nitơ vơ môi trường dẫn đến ngừng sinh tổng hợp Protease nói chung Các acid amin có ảnh hưởng rõ rệt tới sinh tổng hợp enzyme vi sinh vật Glyxin, alanin, metionin lơxin có tác dụng làm tăng hoạt lực Protease chủng đột biến A oryzae 251- 90 đến 6- 9% nguyên chủng A oryzae 132- 63 tới 7- 24% Ngoài ra, bazơ purin A (adenin), G (guanin) dẫn xuất chúng, ARN sản phẩm thuỷ phân làm tăng đáng kể sinh tổng hợp proteinza VSV 8.2.2.3/ Nguồn ngun tố khống yếu tố kích thích sinh trưởng - Muối khống cần thiết cho hoạt động vi sinh vật Ion Mg2+ có tác dụng sinh tổng hợp ổn định enzyme có hoạt tính nhiệt độ cao - Có nhiều yếu tố ảnh hưởng môi trường nuôi cấy Nhiệt độ nuôi cấy thông thường từ 25-300C Trị số pH ban đầu môi trường (chủ yếu môi trường nước) gây ảnh hưởng đến tạo thành E, cần tính đến khả biến đổi nhanh chóng số VSV LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com + Độ thơng khí cần thiết cho việc sinh tổng hợp enzyme Vì mơi trường bề mặt người ta thường thêm chất xốp trấu vào, mơi trường bề sâu (mơi trường dịch thể), người ta thường lắc (nếu enzyme cần lắc việc quan trọng) Độ ẩm quan trọng (chỉ có tác dụng ni cấy bề mặt), phụ thuộc vào thành phần môi trường bề mặt + Khi lựa chọn môi trường cần ý đến thành phần định tính định lượng cho trình sinh tổng hợp enzyme mong muốn cao 8.2.3/ Nuôi cấy thu nhận chế phẩm enzyme Protease phương pháp bề mặt Là phương pháp tạo môi trường cho vi sinh vật phát triển bề mặt môi trường Có thể mơi trường lỏng đặc Phương pháp thích hợp để ni cấy loại nấm mốc khả phát triển nhanh, mạnh, nên bị tạp nhiễm Khi nuôi nấm mốc phát triển bao phủ bề mặt hạt chất dinh dưỡng rắn, khuẩn ty phát triển đâm sâu vào lịng mơi trường tiệt trùng, làm ẩm Đối với số mục đích đặc biệt, người ta ni vi sinh vật trực tiếp bề mặt hạt gạo (sản xuất tương), hạt đậu tương (đậu tương lên men- misô) nấu chín trộn hạt cốc cịn sống (làm men thuốc bắc, men dân tộc, làm tương) Người ta thường dùng cám mì, cám gạo, ngơ mảnh… có chất phụ gia trấu Cám, trấu, có bề mặt tiếp xúc lớn, mơng, tạo độ xốp nhiều, khơng có chất gây ảnh hưởng xấu đến phát triển nấm mốc Tỉ lệ chất phụ gia phải bảo đảm cho hàm lượng tinh bột khối nguyên liệu khơng thấp 20%, bổ sung thêm nguồn nitơ vô ((NH4)2SO4, (NH4)2CO), photpho, nitơ hữu chất kích thích sinh trưởng malt, nước chiết ngô, nước lọc bã rượu LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com - Ưu, nhược điểm + Nồng độ enzyme tạo thành cao nhiều lần so với dịch ni cấy chìm sau tách tế bào vi sinh vật Chế phẩm dễ dàng sấy khô mà khơng làm giảm đáng kể hoạt tính enzyme Chế phẩm khô, dễ bảo quản, vận chuyển, nghiền nhỏ sử dụng trực tiếp không cần khâu tách làm enzyme Tốn lượng, thiết bị, dụng cụ nuôi cấy đơn giản dễ thực dễ dàng xử lý bị nhiễm vi sinh vật lạ, thực qui mơ gia đình, trang trại qui mô lớn đến 20Tấn/ngày + Tuy nhiên phương pháp bề mặt có suất thấp, khó khí hố, tự động hố, cần diện tích ni lớn, chất lượng chế phẩm mẻ không đồng Ngồi phương pháp ni cấy bề mặt có nhược điểm lớn tốn nhiều diện tích Do mà phương pháp dần thay ni cấy chìm để ni cấy vi khuẩn 8.2.3/ Thu nhận enzym 8.2.3.1/ Tách làm chế phẩm enzym Enzyme thường chứa tế bào sinh vật gọi enzyme nội bào (intracellular enzyme), sinh vật tiết mơi trường sống Đó enzyme ngoại bào (extracellular enzyme) Enzyme vi sinh vật thường chiết enzyme ngoại bào - Các phân tử enzyme nội bào khơng có khả qua màng tế bào màng cấu tử tế bào Do để chiết rút enzyme này, bước phải phá vỡ cấu trúc tế bào có chứa enzyme chuyển chúng vào dung dịch Có thể phá vỡ cấu trúc tế bào biện pháp học nghiền với bột thủy tinh cát thạch anh, làm đồng hóa thiết bị đồng hóa (homogenizator) Muốn tách enzyme cấu tử tế bào, người ta phải dùng yếu tố vật lý hóa học khác sóng siêu LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com âm, dùng dung môi hữu butanol, aceton, glycerin, ethyl acetate chất detergent Các hóa chất có tác dụng tốt cho việc phá vỡ cấu tử tế bào quan thường chứa mỡ Sau phá vỡ cấu trúc tế bào, enzyme chiết nước cất, dung dịch đệm thích hợp dung dịch muối trung tính + Có số yếu tố ảnh hưởng đến trình chiết rút cần lưu ý Trước hết nhiệt độ Để tránh hoạt tính chí vơ hoạt, cần chiết rút tiến hành kết tủa enzyme nhiệt độ thấp (từ đến 50C) Các thao tác phải nhanh Một số chất điện ly làm tăng trình chiết rút enzyme NaCl, ZnCl2, CaCl2 Tác dụng chúng phụ thuộc vào phương pháp dùng chiết rút - Để loại bỏ muối khoáng loại đường tạp chất có phân tử lượng thấp, người ta thường dùng phương pháp thẩm tích (dialysis) đối nước hay đối dung dịch đệm loãng cách lọc qua gel sephadex Để loại bỏ protein tạp (protein cấu trúc, protein trơ) chất có phân tử lượng cao khác người ta hay dùng kết hợp phương pháp khác nhau: phương pháp biến tích chọn lọc nhờ tác dụng nhiệt độ pH môi trường, phương pháp kết tủa phân đoạn muối trung tính dung mơi hữu cơ, phương pháp sắc ký (sắc ký hấp phụ, sắc ký trao đổi ion), điện di, phương pháp lọc gel -Mục đích yêu cầu: Các chế phẩm enzyme sử dụng dạng khác theo mức độ tinh khiết (hoạt độ riêng) Trong số trường hợp, canh trường nuôi cấy vi sinh vật có chứa enzyme sử dụng trực tiếp dạng thô không cần tách tạp chất chúng không gây ảnh hưởng đáng kể đến sản phẩm quy trình cơng nghệ sau (Ví dụ: sản xuất rượu, nước chấm thực vật, da) Cũng có người ta cần sử dụng chế phẩm enzyme tinh khiết công nghiệp dệt, công nghiệp mạch nha, y học, nghiên cứu khoa học LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Enzyme nói chung dễ bị giảm hoạt tính tác dụng tác nhân bên ngồi tách tinh chế enzyme để tránh biến hình protein ảnh hưởng lớn đến hoạt tính enzyme cần tiến hành nhanh chóng nhiệt độ thấp, độ pH thích hợp khơng có mặt chất gây biến hình enzyme - Để trích ly enzyme khỏi tế bào trước hết cần phải phá vỡ thành tế bào, màng tế bào cấu trúc tế bào phương pháp lý học hóa học Đối với trường hợp enzyme nằm tế bào (E nội bào nuôi phương pháp bề mặt) cần phải giải phóng enzyme cách phá vỡ tế bào thu nhiều cách như: + Nghiền nhỏ, nghiền với cát, nghiền với vụn thủy tinh, nghiền bi + Để tế bào tự phân hủy + Dùng tác dụng siêu âm tạo áp suất thẩm thấu cao, trích ly muối, dung dịch muối trung tính, dung môi hữu + Kết tủa enzyme chất điện ly thích hợp - Thẩm tích Trong q trình tinh enzyme để loại bỏ phân tử hịa tan nhỏ khơng mong muốn khỏi dịch trích ly enzyme amoni sulfat sau kết tủa, dùng muối để khử hấp thụ enzyme sắc ký trao đổi ion, phối tử cạnh tranh dùng sắc ký lực…người ta thường dùng phương pháp thẩm tích Túi thẩm tích cấu tạo màng bán thấm, chứa dịch chiết E, đặt vào dung dịch đệm khơng chứa chất hịa tan cần loại bỏ Chất hòa tan khuếch tán khỏi màng nồng độ chất hòa tan túi bên dịch đệm - Làm đặc Trong q trình tinh enzyme, phải làm đặc dịch E, sau qua giai đoạn sắc ký dịch chứa enzyme bị pha loãng nhiều Làm đặc LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com dịch chứa enzyme cách cho bốc chân không, cách thẩm thấu ngược ( tạo áp suất thẫm thấu làm cho dung dịch qua màng bán thấm giữ lại protein E) siêu lọc (dung dịch enzyme dẫn qua màng có lỗ nhỏ áp suất ly tâm) 8.2.3.2/ Các dạng chế phẩm enzyme thu - Thu chế phẩm kỹ thuật Chế phẩm enzyme kỹ thuật chế phẩm enzyme chưa tinh chế, chứa vài enzyme chủ yếu tùy theo yêu cầu sử dụng, thành phần cịn có protein khơng hoạt động, chất ổn định tạp chất khác Để thu chế phẩm enzyme kỹ thuật bước đầu người ta đặc dịch enzyme có nồng độ chất khô thấp 4-6 g/l lên tới 15 – 20 g/l nhiệt độ 35oC thiết bị có chân khơng cao Sau đó: + Hoặc ta đặc tiếp nhiệt độ 40- 45oC để đạt nồng độ chất khô 3035g/l, bổ sung thêm bảo quản NaCl, Glixerol, Socbitol, Benzoat thu chế phẩm dạng lỏng, bảo quản nhiệt độ thường từ 1-2 năm + Hoặc bổ sung thêm chất ổn định để đạt nồng độ chất khô 30-40 g/l sấy phun với nhiệt độ sấy có nhiệt độ đầu vào 120oC đầu 60oC Kết thu CP dạng bột + Hoặc người ta kết tủa enzyme loại muối trung tính (NH4)2SO4 cồn, trộn thêm chất ổn định sấy khô, nghiền mịn Kết ta thu chế phẩm dạng bột -Thu chế phẩm enzyme tinh khiết Việc tinh chế enzyme tiến hành theo nhiều phương pháp qua nhiều giai đoạn khác Các protein khơng hoạt động loại khỏi dịch enzyme phương pháp làm biến tính chọn lọc nhờ tác dụng pH, nhiệt Các protein bị biến tính tách khỏi dung dịch ly tâm loại bỏ kết tủa Có thể dùng phương pháp tách phân đoạn khác nhờ kết tủa dung môi LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com hữu cơ, kết tủa muối, hấp phụ chọn lọc, trao đổi ion để thu phần có hoạt lực enzyme cao 8.3/ Quy trình sản xuất enzyme protesae: LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com PHẦN KẾT LUẬN Vi sinh vật nguồn thu enzyme lớn Enzyme có nguồn gốc từ vi sinh vật có hoạt tính sinh học cao, xúc tác mạnh lại dễ bị biến tính, quy trình thu nhận khó khăn phải trải qua nhiều giai đoạn nên làm tăng giá thành enzyme Có nhiều phương pháp thu nhận enzyme khác Nhưng nhìn chung tuân theo nguyên tắc phải phá vỡ lớp vỏ tế bào bên vi sinh vật để thu dịch chiết enzyme thơ Sau tiến hành tinh sạch, lại bỏ thành phần khác, enzyme để tinh enzyme LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com TÀI LIỆU THAM KHẢO 1/ Hóa sinh cơng nghiệp _ Lê Ngọc Tú 2/ Hóa sinh thực phẩm _ Lê Ngọc Tú 3/ Luận văn Công nghệ Enzyme ( Đại học Đà Nẵng) 4/ Luận văn thu nhận tinh chế enzyme (Trường ĐH Nông Lâm TP.HCM) LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com ... xuất, phương pháp kiểm tra độ hoạt tính enzyme protease 4/ Kết nghiên cứu - Nắm quy trình thu nhận , tinh , kiểm tra hoạt tính loại enzyme vi sinh vật Từ đó, lựa chọn giống vi sinh vật phù hợp với... - Hiểu quy trình thu nhận, tinh sạch, kiểm tra hoạt tính loại enzyme lipase, amylase, pectinase, protease từ nguồn vi sinh vật Ứng dụng nghiên cứu nhân giống vi sinh vật, sản xuất enzyme vi sinh. .. sinh trưởng vi sinh vật ngắn (16-100 giờ) Hệ enzyme vi sinh vật vô phong phú Và phần lớn thức ăn nuôi vi sinh vật dễ kiếm rẻ - Enzyme vi sinh vật có hoạt tính mạnh, vịng 24 vi sinh vật chuyển