- Phương pháp này được dựa trên cơ sở của phản ứng trao đổi ion giữa protein
8/ Quy trình sản xuất, phương pháp kiểm tra độ hoạt tính của enzym protease:
enzym protease:
8.1/ Nguồn thu nhận:
- Nguồn vi sinh vật thu nhận enzyme Protease chủ yếu gồm: vi khuẩn, nấm mốc, xạ khuẩn.
8.1.1/ Vi khuẩn:
Lượng Protease sản xuất từ vi khuẩn được ước tính vào khoảng 500 tấn, chiếm 59% lượng enzyme được sử dụng.
Protease của động vật hay thực vật chỉ chứa một trong hai loại endopeptidase hoặc exopeptidase, riêng vi khuẩn có khả năng sinh ra cả hai loại trên, do đó Protease của vi khuẩn có tính đặc hiệu cơ chất cao. Chúng có khả năng phân hủy tới 80% các liên kết peptide trong phân tử protein.
Các chủng vi khuẩn có khả năng tổng hợp mạnh Protease là Bacillus subtilis, B.mesentericus, B.thermorpoteoliticus và một số giống thuộc chi Clostridium. Trong đó, B.subtilis S5 có khả năng tổng hợp Protease mạnh nhất. Các vi khuẩn thường tổng hợp các Protease hoạt động thích hợp ở vùng pH trung tính và kiềm yếu. Các Protease trung tính của vi khuẩn hoạt động ở khoảng pH hẹp (pH 5-8) và có khả năng chịu nhiệt thấp.
Các Protease trung tính tạo ra dịch thủy phân protein thực phẩm ít đắng hơn so với Protease động vật và tăng giá trị dinh dưỡng. Chúng cịn có khả năng ái lực cao đối với các acid amin ưa béo và thơm và được sinh ra nhiều bởi B.subtilis,
B.mesentericus, B. thermorpoteoliticus và một số giống thuộc chi Clostridium. Protease của Bacillus ưa kiềm có điểm đẳng điện bằng 11, khối lượng phân tử từ
20.000-30.000dalton. Ổn định trong khoảng pH 6-12 và hoạt động trong khoảng pH rộng 7-12.
8.1.2/ Nấm mốc
Nhiều loại nấm mốc có khả năng tổng hợp một lượng lớn Protease được ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm như các
chủng: Aspergillus oryzae, A. terricola, A. fumigatus, A. saitoi, Penicilliumchysogenum)… các loại nấm mốc này có khả năng tổng hợp cả ba loại P: acid, kiềm và trung tính. Nấm mốc đen tổng hợp chủ yếu các Protease acid, có khả năng thủy phân protein ở pH 2,5-3
Một số nấm mốc khác như: A. candidatus,
P. cameberti, P. roqueforti… cũng có khả năng tổng hợp Protease có khả năng đơng tụ sữa sử dụng trong sản xuất phomát.
8.1.3/ Xạ khuẩn
Về phương diện tổng hợp Protease, xạ khuẩn được nghiên cứu ít hơn vi khuẩn và nấm mốc. Tuy nhiên, người ta cũng đã tìm được một số chủng có khả năng tổng hợp cao như: Streptomyces grieus, S. fradiae, S. trerimosus…
Các chế phẩm xạ khuẩn được biết nhiều là pronase (Nhật) được tách chiết từ S.grieus, enzyme này có đặc tính đặc hiệu rộng, có khả năng thủy phân tới 90%
liên kết peptide của nhiều protein thành acid amin. Từ S. fradiae cũng có thể tách chiết được keratinase thủy phân karetin. Ở Mỹ, CP được sản xuất có tên là M-Zim dùng trong sản xuất da
Protease từ S. fradiae cũng có hoạt tính elastase cao, do đó chúng được dùng trong công nghiệp chế biến thịt.
8.2/
. Phương pháp thu nhận enzyme protease từ vi sinh vật
8.2.1/. Tuyển chọn và cải tạo giống vi sinh vật cho enzyme có hoạt lực cao
Để chọn giống vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp enzyme cao, người ta có thể phân lập từ mơi trường tự nhiên hoặc có thể dùng các tác nhân gây đột biến tác động lên bộ máy di truyền hoặc làm thay đổi đặc tính. Để chọn giống vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp enzyme cao, người ta có thể phân lập từ mơi trường tự nhiên hoặc có thể dùng các tác nhân gây đột biến tác động lên bộ máy di truyền hoặc làm thay đổi đặc tính di truyền để tạo thành các biến chủng có khẳ năng tổng hợp đặc biệt hữu hiệu một loại enzyme nào đó, cao hơn hẳn chủng gốc ban đầu. c tính di truyền để tạo thành các biến chủng có khẳ năng tổng hợp đặc biệt hữu hiệu một loại enzyme nào đó, cao hơn hẳn chủng gốc ban đầu. Có thể thơng qua các phương pháp sau:
- Phương pháp gây đột biến - Phương pháp biến nạp - Phương pháp tiếp hợp gene - Phương pháp tải nạp
8.2.2/ Môi trường nuôi cấy vi sinh vật tổng hợp enzyme Protease
Để tổng hợp enzyme Protease cần phải chọn mơi trường vì thành phần mơi trường dinh dưỡng có ảnh hưởng trực tiếp đến sự sinh trưởng và tổng hợp enzyme của vi sinh vật. Trong thành phần mơi trường phải có đủ các chất đảm bảo được sự sinh trưởng bình thường của vi sinh vật và tổng hợp enzyme. Đặc biệt lưu ý là để tăng sự tổng hợp enzyme người ta thường dựa vào hiện tượng cảm ứng. Vì nếu như trong thành phần mơi trường có các chất cảm ứng thì chất đó hay sản phẩm phân giải của nó sẽ kìm hãm hoặc làm yếu tác dụng kìm toả của chất kìm hãm nhằm bảo đảm khả năng sinh tổng hợp enzyme đã cho không bị cản trở.
Chất cảm ứng tổng hợp enzyme cho thêm vào môi trường nuôi thường là cơ chất tương ứng của enzyme cần tổng hợp. Thành phần chính của mơi trường: C, N, H, O. Ngồi ra các chất vơ cơ: Mn, Ca, P, S, Fe, K và các chất vi lượng khác.
8.2.2.1/Nguồn cacbon:
Thường là hợp chất hữu cơ trong đó chủ yếu là gluxit, tùy thuộc vào đặc tính của enzyme và nịi vi sinh vật mà người ta lựa chọn cho thích hợp
- Có nhiều hợp chất hydratcacbon và các hợp chất khác là nguồn cacbon thích hợp đối với nấm mốc sinh ra enzyme Protease có hoạt lực cao.
Các nguồn cacbon có tác dụng đến sinh tổng hợp Protease của Asp. oryzae 79có thể theo thứ tự: fructoza→ sacaroza→ maltoza→ glucoza→ manit→ arabinoza→ galactoza. - Tinh bột là nguồn cacbon của nhiều chủng vi khuẩn sinh tổng hợp enzyme Protease.
8.2.2.2/ Nguồn nitơ
Nguồn nitơ sử dụng rất phong phú, bao gồm 2 nhóm: vơ cơ và hữu cơ. Đối với một số loài nấm mốc thuộc họ (A. oryzae, A. awamori, A. niger, A. flavus) trên mơi trường có các nguồn nitơ hữu cơ sinh tổng hợp Protease axit cao.
Nhiều kết quả nghiên cứu cho thấy sinh tổng hợp enzyme được nâng cao khi trong mơi trường có đồng thời cả nguồn nitơ hữu cơ và nitơ vô cơ. Cho thêm vào mơi trường có cám mì, bột đậu tương đã tách chất béo, các nguồn nitơ và hữu cơ hoạt lực enzyme Protease tăng 22- 74%.
Còn trường hợp dùng các nguồn nitơ vô cơ duy nhất trong môi trường sẽ dẫn đến ngừng sinh tổng hợp Protease nói chung. Các acid amin có ảnh hưởng rõ rệt tới sinh tổng hợp enzyme bằng vi sinh vật. Glyxin, alanin, metionin và lơxin có tác dụng làm tăng hoạt lực Protease của chủng đột biến A. oryzae 251- 90 đến 6- 9% và nguyên chủng A. oryzae 132- 63 tới 7- 24%. Ngoài ra, các bazơ purin như A (adenin), G (guanin) và các dẫn xuất của chúng, ARN và các sản phẩm thuỷ phân cũng làm tăng đáng kể sinh tổng hợp proteinza VSV.
8.2.2.3/ Nguồn các nguyên tố khống và các yếu tố kích thích sinh trưởng
- Muối khoáng rất cần thiết cho hoạt động vi sinh vật. Ion Mg2+ có tác dụng sinh tổng hợp và ổn định các enzyme có hoạt tính ở nhiệt độ cao.
- Có nhiều yếu tố ảnh hưởng đối với môi trường nuôi cấy. Nhiệt độ nuôi cấy thông thường từ 25-300C. Trị số pH ban đầu của môi trường (chủ yếu ở mơi trường nước) cũng có thể gây ảnh hưởng nào đó đến sự tạo thành E, nhưng khi đó cũng cần tính đến khả năng biến đổi nhanh chóng chỉ số đó bởi VSV.
+ Độ thơng khí cũng rất cần thiết cho việc sinh tổng hợp enzyme. Vì vậy ở mơi trường bề mặt người ta thường thêm chất xốp như trấu vào, cịn ở mơi trường bề sâu (mơi trường dịch thể), thì người ta thường lắc (nếu enzyme cần lắc thì việc này cực kỳ quan trọng). Độ ẩm cũng rất quan trọng (chỉ có tác dụng ở ni cấy bề mặt), phụ thuộc vào thành phần môi trường bề mặt.
+ Khi lựa chọn môi trường cần chú ý đến cả thành phần định tính và định lượng sao cho q trình sinh tổng hợp enzyme mong muốn là cao nhất
8.2.3/ Nuôi cấy thu nhận chế phẩm enzyme Protease bằng phương pháp bề mặt
Là phương pháp tạo môi trường cho vi sinh vật phát triển trên bề mặt mơi trường. Có thể là mơi trường lỏng hoặc đặc. Phương pháp này rất thích hợp để ni cấy các loại nấm mốc do khả năng phát triển nhanh, mạnh, nên ít bị tạp nhiễm. Khi nuôi nấm mốc phát triển bao phủ bề mặt hạt chất dinh dưỡng rắn, các khuẩn ty cũng phát triển đâm sâu vào lịng mơi trường đã được tiệt trùng, làm ẩm. Đối với một số mục đích đặc biệt, người ta ni vi sinh vật trực tiếp trên bề mặt hạt gạo (sản xuất tương), hạt đậu tương (đậu tương lên men- misơ) đã được nấu chín trộn hạt cốc còn sống (làm men thuốc bắc, men dân tộc, làm tương).
Người ta thường dùng cám mì, cám gạo, ngơ mảnh… có chất phụ gia là trấu. Cám, trấu, có bề mặt tiếp xúc lớn, mơng, tạo được độ xốp nhiều, khơng có những chất gây ảnh hưởng xấu đến sự phát triển của nấm mốc. Tỉ lệ các chất phụ gia phải bảo đảm sao cho hàm lượng tinh bột trong khối nguyên liệu không được thấp hơn 20%, có thể bổ sung thêm nguồn nitơ vơ cơ ((NH4)2SO4, (NH4)2CO), photpho, nitơ hữu cơ và các chất kích thích sinh trưởng như malt, nước chiết ngơ, nước lọc bã rượu.
- Ưu, nhược điểm
+ Nồng độ enzyme tạo thành cao hơn nhiều lần so với dịch ni cấy chìm sau khi đã tách tế bào vi sinh vật. Chế phẩm dễ dàng sấy khô mà không làm giảm đáng kể hoạt tính enzyme. Chế phẩm khơ, dễ bảo quản, vận chuyển, nghiền nhỏ hoặc sử dụng trực tiếp nếu không cần khâu tách và làm sạch
enzyme. Tốn ít năng lượng, thiết bị, dụng cụ ni cấy đơn giản dễ thực hiện và dễ dàng xử lý khi bị nhiễm vi sinh vật lạ, có thể thực hiện qui mơ gia đình, trang trại cũng như ở qui mô lớn đến 20Tấn/ngày.
+ Tuy nhiên phương pháp bề mặt có năng suất thấp, khó cơ khí hố, tự động hố, cần diện tích ni lớn, chất lượng chế phẩm ở các mẻ không đồng đều. Ngồi ra phương pháp ni cấy bề mặt có một nhược điểm rất lớn là tốn nhiều diện tích. Do vậy mà phương pháp này dần được thay thế bằng nuôi cấy chìm để ni cấy vi khuẩn.
8.2.3/. Thu nhận enzym
8.2.3.1/ Tách và làm sạch chế phẩm enzym
Enzyme thường chứa ở các tế bào sinh vật gọi là các enzyme nội bào (intracellular enzyme), nhưng nó cũng có thể được các sinh vật tiết ra mơi trường sống. Đó là các enzyme ngoại bào (extracellular enzyme). Enzyme vi sinh vật thường chiết là enzyme ngoại bào.
- Các phân tử enzyme nội bào khơng có khả năng đi qua màng của tế bào và màng của các cấu tử của tế bào. Do đó để có thể chiết rút các enzyme này, bước đầu tiên là phải phá vỡ cấu trúc của các tế bào có chứa enzyme và chuyển chúng vào dung dịch.
Có thể phá vỡ cấu trúc của các tế bào bằng các biện pháp cơ học như nghiền với bột thủy tinh hoặc cát thạch anh, làm đồng hóa bằng thiết bị đồng hóa (homogenizator). Muốn tách được các enzyme trong các cấu tử của tế bào, người ta còn phải dùng các yếu tố vật lý và hóa học khác nhau như sóng siêu
âm, dùng các dung môi hữu cơ như butanol, aceton, glycerin, ethyl acetate... và chất detergent. Các hóa chất có tác dụng tốt cho việc phá vỡ các cấu tử của tế bào vì trong các cơ quan này thường chứa mỡ.
Sau khi đã phá vỡ các cấu trúc của tế bào, enzyme được chiết bằng nước cất, bằng các dung dịch đệm thích hợp hoặc các dung dịch muối trung tính.
+ Có một số yếu tố ảnh hưởng đến q trình chiết rút cần lưu ý. Trước hết đó là nhiệt độ. Để tránh mất hoạt tính hoặc thậm chí vơ hoạt, cần chiết rút và tiến hành kết tủa enzyme ở nhiệt độ thấp (từ 3 đến 50C). Các thao tác phải nhanh. Một số chất điện ly làm tăng quá trình chiết rút enzyme như NaCl, ZnCl2, CaCl2. Tác dụng của chúng còn phụ thuộc vào phương pháp dùng khi chiết rút.
- Để loại bỏ muối khống và các loại đường... là các tạp chất có phân tử lượng thấp, người ta thường dùng phương pháp thẩm tích (dialysis) đối nước hay đối các dung dịch đệm loãng hoặc bằng cách lọc qua gel sephadex.
Để loại bỏ các protein tạp (protein cấu trúc, protein trơ) và các chất có phân tử lượng cao khác người ta hay dùng kết hợp các phương pháp khác nhau: phương pháp biến tích chọn lọc nhờ tác dụng của nhiệt độ hoặc pH của môi trường, phương pháp kết tủa phân đoạn bằng muối trung tính hoặc các dung mơi hữu cơ, các phương pháp sắc ký (sắc ký hấp phụ, sắc ký trao đổi ion), điện di, phương pháp lọc gel.
-Mục đích yêu cầu: Các chế phẩm enzyme được sử dụng ở các dạng khác nhau theo mức độ tinh khiết (hoạt độ riêng). Trong một số trường hợp, canh trường ni cấy vi sinh vật có chứa enzyme được sử dụng trực tiếp dưới dạng thô không cần tách tạp chất nếu chúng không gây ảnh hưởng đáng kể đến sản phẩm và quy trình cơng nghệ sau này (Ví dụ: sản xuất rượu, nước chấm thực vật, da). Cũng có khi người ta cần sử dụng chế phẩm enzyme tinh khiết trong công nghiệp dệt, công nghiệp mạch nha, y học, nghiên cứu khoa học.
Enzyme nói chung rất dễ bị giảm hoạt tính dưới tác dụng của các tác nhân bên ngồi do đó khi tách và tinh chế enzyme để tránh sự biến hình protein ảnh hưởng lớn đến hoạt tính enzyme cần tiến hành nhanh chóng ở nhiệt độ thấp, độ pH thích hợp khơng có mặt các chất gây biến hình enzyme.
- Để trích ly enzyme ra khỏi tế bào trước hết cần phải phá vỡ thành tế bào, màng tế bào và những cấu trúc dưới tế bào bằng những phương pháp lý học hoặc hóa học. Đối với trường hợp enzyme cịn nằm trong tế bào (E nội bào ni bằng phương pháp bề mặt) thì cần phải giải phóng enzyme bằng cách phá vỡ tế bào thu nhiều cách như:
+ Nghiền nhỏ, nghiền với cát, nghiền với vụn thủy tinh, nghiền bi. + Để tế bào tự phân hủy
+ Dùng tác dụng của siêu âm hoặc tạo áp suất thẩm thấu cao, trích ly bằng muối, dung dịch muối trung tính, dung mơi hữu cơ.
+ Kết tủa enzyme bằng các chất điện ly thích hợp. - Thẩm tích
Trong q trình tinh sạch các enzyme để loại bỏ các phân tử hòa tan nhỏ khơng mong muốn khỏi dịch trích ly enzyme như amoni sulfat sau khi kết tủa, dùng một muối để khử hấp thụ enzyme trong sắc ký trao đổi ion, hoặc một phối tử cạnh tranh dùng trong sắc ký ái lực…người ta thường dùng phương pháp thẩm tích. Túi thẩm tích được cấu tạo bằng một màng bán thấm, chứa dịch chiết E, được đặt vào trong một dung dịch đệm khơng được chứa chất hịa tan cần được loại bỏ. Chất hòa tan khuếch tán ra khỏi màng cho đến khi nồng độ chất hịa tan trong túi và bên ngồi dịch đệm sẽ bằng nhau.
- Làm đặc
Trong quá trình tinh sạch enzyme, có thể phải làm đặc dịch E, nhất là sau khi qua giai đoạn sắc ký dịch chứa enzyme đã bị pha loãng ra nhiều. Làm đặc
dịch chứa enzyme bằng cách cho bốc hơi trong chân không, bằng cách thẩm thấu ngược ( tạo áp suất thẫm thấu làm cho dung dịch đi qua một màng bán thấm và giữ lại các protein E) hoặc bằng siêu lọc (dung dịch enzyme được dẫn qua một màng có lỗ nhỏ bằng áp suất hoặc bằng ly tâm).
8.2.3.2/. Các dạng chế phẩm enzyme thu được
- Thu chế phẩm kỹ thuật
Chế phẩm enzyme kỹ thuật là chế phẩm enzyme chưa được tinh chế, nó có thể chứa một hoặc vài enzyme chủ yếu tùy theo yêu cầu sử dụng, ngồi ra trong thành phần cịn có thể có các protein khơng hoạt động, các chất ổn định và các tạp chất khác. Để thu được chế phẩm enzyme kỹ thuật bước đầu người ta cô đặc các dịch enzyme có nồng độ chất khơ thấp 4-6 g/l lên tới 15 – 20 g/l ở nhiệt độ 35oC trong thiết bị có chân khơng cao. Sau đó:
+ Hoặc là ta sẽ cô đặc tiếp ở nhiệt độ 40- 45oC để đạt nồng độ chất khô 30-