- Phương pháp này được dựa trên cơ sở của phản ứng trao đổi ion giữa protein
4/ Hoạt tính của enzyme từ vi sinh vật
_ Khác với trong hóa học phân tích bình thường, trong enzyme học, người ta không định lượng enzyme một cách trực tiếp mà thường xác định gián tiếp thơng qua xác định độ hoạt động ( hoạt tính) của enzyme. Mỗi enzyme có khả năng xúc tác cho một hoặc một số phản ứng nhất định. Trong phản ứng có enzyme xúc tác, sự hoạt động của enzyme được biểu hiện bằng cách làm thay đổi các tính chất vật lý, hóa lý cũng như tính chất hóa học của hỗn hợp phản ứng. Hoạt động hay hoạt tính của enzyme càng mạnh thì lượng cơ chất được chuyển hóa hoặc lượng sản phẩm tạo thành trên một đơn vị thời gian càng lớn. Theo dõi những biến đổi đó có thể biết được chính xác mức độ hoạt động của enzyme thơng qua xác định cơ chất bị mất hay lượng sản phẩm được tạo thành trong phản ứng.
_ Có 3 nhóm phương pháp sau :
Đo lượng cơ chất bị mất đi hay sản lượng sản phẩm được tạo thành trong một thời gian nhất định ứng với một nồng độ enzyme xác định
Đo thời gian cần thiết để thu được một lượng biến thiên nhất định của cơ chất hay sản phẩm tương ứng với một nồng độ enzyme xác định
Chọn nồng độ enzyme như thế nào để trong một thời gian nhất định thu được sự biến thiên nhất định về cơ chất hay sản phẩm
_ Hoạt tính enzyme được thể hiện ở việc làm thay đổi các tính chất vật lý, hóa lý cũng như tính chất hóa học của hỗn hợp phản ứng.
4.1 Hoạt tính riêng của enzyme
Hoạt tính riêng của một chế phẩm enzyme đặc trưng cho độ tinh sạch của chế phẩm enzyme. Hoạt tính riêng được biểu thị bằng số đơn vị enzyme/mg , protein (U/mg) hoặc Kat/kg protein, trong đó hàm lượng protein được xác định theo phương pháp Lowry hoặc Bradford . Khi đã biết khối lượng phân tử của enzyme thì có thể tính hoạt tính của phân tử
4.2 Các phương pháp xác định hoạt tính enzyme
_ Cần tránh những yếu tố có thể biến tính protein enzyme
_ Các thông số nhiệt độ, pH, nồng độ ion và thành phần dung dịch đệm ảnh hưởng lên hoạt tính enzyme. Thử hoạt tính enzyme phải được tiến hành trong điều kiện thích hợp như điều kiện sinh lý, điều kiện tồn trữ thực phẩm hoặc điều kiện mà hoạt lực có thể đạt tối ưu
_ Với những enzyme cần có chất hoạt hóa hoặc chất ổn định cần phải cho các chất này vào enzyme trước khi cho cơ chất vào hỗn hợp phản ứng
_ Nồng độ cơ chất trong phản ứng enzyme phải trong giới hạn thích hợp, đủ thừa để bão hịa enzyme, nhưng khơng q cao để kìm hãm enzyme. Sau khi dừng phản ứng lượng cơ chất được chuyển hóa 20-30%
_ Thời gian xác định hoạt tính thường 5-30 phút. Tốt nhất là xác định tốc độ ban đầu của phản ứng (30-60 giây), vì giai đoạn này tốc độ phản ứng lớn nhất, sau đó bắt đầu giảm
_ Khi xác định hoạt tính phải làm mẫu đối chứng song song với mẫu thí nghiệm. Trong mẫu đối chứng enzyme phải bị bất hoạt trước khi tiếp xúc với cơ chất