- Phương pháp này được dựa trên cơ sở của phản ứng trao đổi ion giữa protein
6/ Quy trình sản xuất, phương pháp kiểm tra độ hoạt tính của enzyme amylase:
Quy trình thu nhận enzyme amylase từ Bacillus subtilis.
Tách và tinh sạch enzyme amylase từ môi trường lỏng
a. Siêu lọc
- Mục đích : Khai thác: làm giảm hàm lượng các chất có phân tử lượng nhỏ ra khỏi dung dịch enzyme thơ.
- Những biến đổi trong q trình siêu lọc
+ Biến đổi vật lý: Khối lượng riêng hỗn hợp giảm. + Biến đổi hóa học: Hàm lượng enzyme tăng.
Thiết bị: thiết bị UF Phương pháp siêu lọc dùng để tách các chất có phân tử lượng khác nhau. Các chất có phân tử lượng nhỏ như đường, muối, nước… sẽ chui qua màng, enzyme và protein phi enzyme được giữ lại trên màng.
- Nguyên lý hoạt động:
Nguyên liệu sẽ được bơm vào từ một đầu của thiết bị và được phân phối vào bên trong các ống trụ nhỏ. Dòng ra retentate sẽ tiếp tục đi hết theo chiều dài các ống trụ nhỏ và thoát ra bên ngồi các ống trụ nhỏ, sau đó được tập trung theo cửa ra chung nằm phía trên thân của thiết bị. Bên trong thiết bị membrane có thể được chia thành nhiều khoang, mỗi khoang gồm một số ống trụ nhỏ song song nằm cạnh nhau. Đầu tiên nguyên liệu sẽ được bơm vào một khoang trong thiết bị. Dịng retentate thốt ra khỏi khoang này và đi tiếp vào khoang thứ hai, còn dòng retentate thoát ra từ khoang thứ hai sẽ đi tiếp vào khoang thứ ba, … Như vậy, dịng retentate thốt ra từ khoang cuối cùng sẽ có nồng độ đạt giá trị yêu cầu.
b. Tinh sạch enzyme bằng phương pháp lọc gel
- Mục đích: tách các protein ra khỏi nhau để thu được enzyme tinh khiết. - Nguyên tắc
+ Phương pháp này được ứng dụng để tách hỗn hợp các chất dựa vào sự khác nhau về kích thước, hình dạng, cấu trúc khơng gian, phân tử lượng.
+Quá trình triển khai sắc ký được thực hiện thơng qua sự tương tác của 2 pha:
Pha tĩnh là các hạt gel có cấu trúc mở, chứa liên kết ngang tạo thành mạng lưới không gian ba chiều được nhồi cố định trong cột. Bên trong và bên ngồi hạt gel có các mao quản kích thước nhỏ. Cả cột gel được giữ cân bằng cách rửa qua dung dịch đệm.
Pha động là hỗn hợp gồm dịch enzyme và các tạp chất hịa tan khác có kích thước phân tử khác nhau được pha trong dung dịch đệm
+ Dung dịch mẫu chứa enzyme và các cấu tử hịa tan (pha động) có kích thước khác nhau được chạy qua cột. Những phân tử có kích thước lớn hơn kích thước lỗ mao quản của gel thì khơng thể đi vào bên trong hạt gel, vì thế chúng di chuyển trong khoảng không gian giữa các hạt. Những phân tử có kích thước nhỏ hơn thì có khả năng khuếch tán vào bên trong các hạt gel.
- Phương pháp thực hiện Dùng cột sắc ký nhồi chất mang là sephadex tách các chất có phân tử lượng khác nhau. Chất nào có phân tử lượng lớn khơng bị mắc kẹt trong các lỗ rây của cột nhồi sẽ chạy ra trước ta thu được nhưng phân đoạn đầu tiên và ngược lại những chất có phân tử lượng nhỏ nhất sẽ chạy ra sau cùng. Từ đây, ta thu được ta thu được các phân đoạn khác nhau.
Phương pháp xác định hoạt tính enzyme amylase
Các phương pháp xác định hoạt tính enzyme chủ yếu dựa vào lượng tinh bột bị thủy phân hay lượng đường khử tạo thành, sau đây là một số phương pháp để xác định hoạt độ của enzyme amylase:
a. Phương pháp Wolhgemuth:
Nguyên tắc: xác định lượng enzyme ít nhất có thể thủy phân 1mg tinh bột đến các sản phẩm không màu với iod.
b. Phương pháp Heinkel:
Nguyên tắc: xác định lượng tinh bột bị phân giải dựa trên cơ sơ xác định mức độ giảm cường độ màu của hỗn hợp với dung dịch iod. Đơn vị hoạt độ của enzyme là lượng enzyme có khả năng phân giải 1mg tinh bột sau 30 phút ở 300C.
c. Phương pháp Rukhliadeva Geriacheva:
Nguyên tắc: amylase có khả năng thủy phân tinh bột tạo thành các dextrin có khối lượng phân tử khác nhau, khi cho tác dụng với iod, chúng sẽ tạo màu, đo cường độ màu tạo thành ta tính được hoạt độ của amylase. Đơn vị hoạt độ của amylase là lượng enzyme xúc tác thủy phân được 1g tinh bột tạo thành dextrin có phân tử lượng khác nhau ở nhiệt độ 300C trong 1 giờ.
d. Phương pháp Smith và Rose:
Nguyên tắc: hoạt tính α – amylase được xác định dựa trên sự thay đổi màu sắc của phức tinh bột – iod trước và sau thủy phân. Mật độ quang của phức tinh bột – iod được đo ở bước sóng 595nm trên máy quang phổ. Một đơn vị hoạt tính α –
amylase là lượng enzyme cần thiết để thủy phân 10mg tinh bột trong thời gian 1 phút ở 500C và pH 5.6.
e. Phương pháp Gratreva:
Nguyên tắc: đơn vị hoạt độ amylase là lượng enzyme xúc tác chuyển hóa 1g tinh bột thành glucose sau 1 giờ. Hoạt độ amylase được tính bằng số đơn vị trên 1ml môi trường hoặc 1g chế phẩm.
f. Phương pháp Nelson:
Nguyên tắc: dưới tác dụng của amylase, tinh bột bị thủy phân tạo ra dextrin và đường khử. Vì vậy, sự tăng lượng đường khử trong hỗn hợp phản ứng sau khi enzyme tác dụng là thước đo hoạt lực enzyme. Để định lượng đường khử tạo thành có thể dung nhiều phương pháp khác nhau như phương pháp Nelson, Berrand, Luff – Schoorla cả tiến, Granxianof, …
Nguyên tắc chung: lợi dụng tính chất khử của nhóm – CHO trong phân tử đường khi tác dụng với các chất khác nhau hay phản ứng với dung dịch đồng hóa trị II tạo thành kết tủa Cu2O. Hịa tan kết tủa Cu2O bằng các chất khác nhau và định lượng Cu để suy ra lượng đường. Ở đây ta sử dụng phương pháp Nelson. Hòa tan kết tủa Cu2O trong thuốc thử arseno – molybden sẽ nhận được màu xanh da trời. So màu ở máy so màu thường bước sóng 660nm, đối chiếu đồ thị tiêu chuẩn để tính lượng đường. Đơn vị hoạt động của enzyme là lượng enzyme mà trong 30 phút ở 300C có thể phân giải tinh bột tạo thành lượng đường khử tương đương 1 micromol glucose.
g. Phương pháp xác định hoạt tính glucoamylase:
Nguyên tắc: ta sẽ xác định hoạt tính của enzyme dựa vào cường độ màu với iod khi đo ở bước sóng 520nm. Hoạt tính glucoamylase được biểu thị bằng lượng glucose giải phóng bởi enzyme trong 1 phút ở 400C từ 1g tinh bột.
Xác định độ tinh sạch của enzyme: bằng phương pháp điện di
Điện di trên gel Sodium dodecyl sulfate – polyacryamide 10% (SDS PAGE) được thực hiện theo phương pháp của Laemmli (Tipton 1992) trên thiết bị điện di
APLELEX với nguồn Electronforesis power supply ST 1006T. - Mẫu chạy điện di phải giữ trong điều kiện -200 – 10C. - Các hóa chất điện di được cung cấp bởi hãng Bioad, Mỹ.
- Gel sau khi chạy điện di được nhuộm màu với Coomassie blue G250. Hoạt tính amylase của các vạch isoform được xác định sau khi làm hồi lại hoạt tính theo phương pháp của Lark và Springhorn. Gel sau khi chạy điện di có thể được chụp ảnh hoặc được sấy bằng cách ngâm trong dung dịch sấy gel và giữ ở giữa hai lớp celophan.
Quy trình sản xuất, phương pháp kiểm tra độ hoạt tính của enzyme pectinase Quy trình sản xuất Mơi trường Hấp khử trùng Để nguội Dụng cụ nuôi cấy Phối vào dụng cụ Cấy vào môi trường Nuôi cấy trong 36h Thu nhận enzyme thô Nhân giống Giống vi sinh vật Để nguội Hấp khử trùng
Phương pháp thu nhận
Có 2 loại enzyme: nội bào và ngoại bào, mỗi enzyme địi hỏi phải có phương pháp tách và thu nhận riêng
_ Enzyme ngoại bào ( gồm pectinase) do vi sinh vật tiết ra trong môi trường nuôi cấy ngồi tế bào, thường hịa tan trong nước do đó dễ trích ly và tinh sạch
_ Enzyme nội bào: là enzyme được sản xuất ra bên trong tế bào vi sinh vật và không được tiết ra môi trường bên ngoài. Những tế bào vi sinh vật sau khi được nuôi vấy sẽ được tách ra và phá vỡ tế bào. Mục đích của việc này là giải phóng tồn bộ các chất có trong tế bào gồm cả enzyme nội bào. Hỗn hợp thu được sẽ đem ly tâm tách tạp chất và những chất có phân tử lượng lớn; cịn enzyme sẽ được kết tủa bằng cồn hay muối. Enzyme sau đó sẽ được đem tinh sạch
Từ môi trường nuôi cấy bề mặt
Từ môi trường nuôi cấy bề sâu + Phương pháp hiếu khí
_ Sự tích tụ enzyme trong mơi trường được bắt đầu khi sự phát triển của vi sinh vật đạt gần đến pha ổn định, khi mơi trường bị axit hóa mạnh và khi lượng photpho vơ cơ được sử dụng hồn tồn, pH của mơi trường ni cấy thường đạt từ 6-7.2 là thích hợp. Đối với nấm mốc, pH kìm hãm sự tổng hợp sinh khối và sự tích lũy enzyme pectinase. Khi pH dịch về phía axit, ngay cả khi pH nằm trong khoảng 4.5-
5, tuy sự tạo thành sinh khối không bị ảnh hưởng nhưng sự tạo thành enzyme pectinase bị kìm hãm
_ Vật liệu gieo cấy có thể là sợi nấm 24,32 và 48h tuổi và với hàm lượng từ 2- 10%. Đối với A.niger và A.awamori vật liệu gieo cấy là sợi nấm được ủ sơ bộ trong môi trường dinh dưỡng cho đến khi bắt đầu nứt nanh bào tử, thời gian ủ sơ bộ thường là 38-42h. Lượng sợi nấm đem gieo cấy thường là 2% . Trong quá trình ni cấy, hàm lượng các chất hịa tan trong mơi trường giảm từ 6% xuống cịn 1.5- 1.8%
_ Để thu chế phẩm khô, cần tách sợi nấm ra khỏi canh trường lỏng. cô đặc chân không canh trường lỏng đến khi hàm lượng chất khô đạt 5-8% rồi sấy khô trên thiết bị sấy phun. Điều kiện sấy phun là nhiệt độ chất tải nhiệt đi vào phải đạt 165- 1800C và đi ra đạt 60-700C. Thời gian lưu của chế phẩm enzyme trong thiết bị sấy phun phải không quá 7 giây và nhiệt độ chế phẩm sau khi sấy phải không quá 400C. Chế phẩm thu được cần phải đóng gói kín để tránh hút ẩm
+ Phương pháp yếm khí
_ Mơi trường: bã củ cải 2%, (NH4)2HPO4 0.75%, KH2PO4 0.1%, CaCO3 0.3%, nước chiết ngô 0.5%
_ Clostridium pectinofermentants 15 có khả năng tổng hợp pectinase một cách mạnh mẽ ở pha tăng trưởng của quá trình sinh trưởng và tăng đồng thời với sự tích lũy sinh khối. Sự tích lũy enzyme sẽ tối đa tương ứng với pha ổn định của sự sinh trưởng qua 55-60h, pH ban đầu của môi trường dinh dưỡng là 6.5-7. Vật liệu gieo cấy ban đầu được chuẩn bị ở trạng thái canh trường chứa bào tử và được cấy với lượng 4% theo thể tích. Q trình ni cấy được tiến hành ở nhiệt độ 350C
_ Cl.felsineum cũng có thể được ni cấy yếm khí để thu pectinase. Có thể tiến hành thu chế phẩm từ dịch lọc canh trường bằng cách kết tủa enzyme với dung môi hữu cơ hoặc với muối amoni sulfat. Nếu kết tủa bằng dung môi hữu cơ, pH của dung dịch đã xử lý 6.5-6.8. Nếu kết tủa bằng 2-2.5 thể tích aceton thì hoạt độ enzyme trong kết tủa đạt 93-95% so với hoạt độ ban đầu
_ Khi kết tủa ammonium sulfat có độ bão hịa bằng 0.2 thì sẽ thu được chế phẩm chỉ chứa pectinesterase và pectintranseliminase, khi độ bão hịa là 0.9-1 thì sẻ thu được chế phẩm chỉ chứa pectintrenseliminase và exopolygalacturonase
Tinh sạch enzyme pectinase bằng phương pháp lọc màng (cross flow
_ Tiến hành kết tủa enzyme từ 500 ml dịch chiết thu được bởi ethanol 960, nhiệt độ kết tủa 40C, thời gian kết tủa là 1 giờ. Sau đó, ly tâm 5000 vòng/phút trong 15 phút thu enzyme thơ. Hịa tan enzyme thơ này trong 500 ml dung dịch đệm Mc IIvaine pH 4,5. Tiến hành lọc 500 ml dung dịch enzyme vừa hòa tan trên bằng hệ thống lọc QuixStand Benchtop Systems ( hãng Amersham Biosciences) với bộ lọc màng (membrane) có khoảng phân đoạn 50kDa. Tốc độ bơm mẫu đầu vào lần lượt là 150rpm & 200rpm và điều chỉnh sao cho áp suất trên bề mặt màng không quá 5 Psi. Thu dịch qua lọc và xác định hiệu suất thu hồi enzyme và hoạt độ tương ứng
_ Sau khi lọc dung dịch enzyme kết quả thu được khi lọc với tốc độ bơm 150rpm thu dịch qua lọc. Kết quả thu được hiệu suất thu hồi enzyme và hoạt độ đạt 27,87% và 87,98%, độ tinh sạch tăng 3,1 lần. Khi tăng tốc độ bơm lên 200rpm thì hiệu suất thu hồi enzyme và hiệu suất hoạt độ đạt 33,33% và 73,65% độ tinh sạch chỉ tăng 2,2 lần
_ Quá trình sinh tổng hợp pectinase trên mơi trường có chất cảm ứng của chủng
Asp.niger có hoạt độ riêng cao nhất sau 72 giờ đạt 8,97-10.2 (UI/mg protein)
_ Thu nhận enzyme pectinase sau 48 giờ ni cấy và sau đó đem tiến hành tinh sạch _ Nguyên nhân là khi tăng tốc độ bơm lên 200rpm thì áp suất đầu vào tăng (5,2 Psi) làm cho dòng chảy trong bộ lọc chuyển động rối, các phân tử sẽ va đập mạnh vào nhau và đẩy chúng vào thành bộ lọc kết quả hình thành một màng mỏng xung quanh thành bộ lọc ( hay còn gọi là lớp trở lực ). Mặt khác dưới tác dụng của lực ly tâm trong dòng chảy sẽ đẩy một số phân tử trong màng mỏng theo dịch qua lọc ra phía ngồi. Vì thế tốc độ bơm đầu vào 150rpm thực hiện quá trình tinh sạch tốt hơn
Phương pháp xác định hoạt tính enzyme pectinase _ Phương pháp đông chung (Cu-pectat)
+ Thủy phân pectin dưới tác dụng pectinase. Sau đó dùng CuSO4 5% để kết tủa axit pectin dưới dạng đồng pectat (Cu-pectat). Hòa tan kết tủa bằng NH4OH 25%. Xác định lượng đồng nhờ iot. Một đơn vị hoạt động pectinase theo phương pháp này là một lượng enzyme có khả năng xúc tác thủy phân hết 1mg pectin trong thời gian 1 giờ ở điều kiện tiêu chuẩn.
_Ngồi ra, người ta cịn sử dụng các phương pháp khác như phương pháp nhớt kế, phương pháp so màu.