- Phương pháp này được dựa trên cơ sở của phản ứng trao đổi ion giữa protein
5/ Quy trình sản xuất, phương pháp kiểm tra độ hoạt tính của enzyme lipase
enzyme lipase
Tinh sạch enzyme lipase:
- Do nguồn thu lipase từ động vật kém bền nhiệt , lại có mùi hơi, sản xuất mất nhiều công sức và tốn lém. Hơn nữa, việc lây nhiễm virus động vật là mối lo ngại hang đầu. Nên việc chủ động nuôi cấy và tách chiết lipase từ vi sinh vật ngày càng chiếm ưu thế.
- Người ta sử dụng sắc kí ái lực cho độ tinh sạch cao nhất, nhưng phương pháp này tốn kém do cột đắc tiền lại không bền. Do nguyên nhân cột hoạt động trên nguyên tắc sự bắt cặp giữa enzyme và cơ chất , tạo nên phức hợp E-S. Nhưng bản thân cơ chất của enzyme được nhồi vào cột là protein, đó là nguyên nhân mà cơ chất dễ bị biến tính và khơng kết hợp được với enzyme. - Từ đó các nhà khoa học sử dụng DNA tái tổ hợp biểu hiện trong E.coli bằng
cách thiết kế gen mã hóa tổng hợp lipase gắn them các trình tự mã hóa 6 góc His ở đầu C. Từ đó mà giá thành enzyme giảm, tạo điều kiện cho việc ứng dụng rộng rại lipase. Bên cạnh đó, một số nghiên cứu còn dung phương pháp gây đột biến, làm tang khả năng biểu hiện gen, nâng cao hoạt tính enzyme. Phương pháp xác định hoạt tính enzyme lipase
- Hoạt tính lipase được xác định dựa trên lượng acid béo tự do được giải phóng. Đối với lipase 1 đơn vị hoạt độ U là lượng enzyme cần thiết xúc tác tạo thành 1µmol acid béo trong 1 phút ở điều kiện xác định. Một số phương pháp thông dụng như: + Phương pháp huẩn độ + Phương pháp quang phổ + Phương pháp sắc kí + Phương pháp phóng xạ Đối với chất dạng lỏng:
- Dầu oive đã nhũ hóa bị phản ứng thủy phân do xúc tác của lipase tạo thành acid béo (ở điều kiện nhiệt độ, pH cụ thể ), sau khi bất hoạt enzyme với etanol 99,50 bằng phương pháp chuẩn độ acid-bazo; sử dụng NaOH 0.1N; chất chỉ thị là phenolphtalein 0.1%. Khi đó, hoạt tính (HT) và hoạt tính riêng 9HTR) của lipase được tính theo cơng thức :
HT = [(a-b)*1000*0.1] (U/ml)
Trong đó: a: Thể tích NaOH 0.1N chuẩn độ ở mẫu có enzyme (ml) b: Thể tích NaOH 0.1 N chuản độ ở mẫu trắng (ml)
HTR = ∑ ĐVHT/P
Trong đó: ∑ ĐVHT: Tổng số đơn vị hoạt tính enzyme (g) P: Hàm lượng protein (mg/g)
Đối với chất dạng khơ