Phân lập toxin có hoạt tính chống đông máu từ nọc bò cạp heterometrus laoticus và toxin có hoạt tính giảm đau, kháng tăng sinh tế bào ung thư từ nọc rắn bungarus fasciatus TT

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ - TRẦN VŨ THIÊN PHÂN LẬP TOXIN CĨ HOẠT TÍNH CHỐNG ĐƠNG MÁU TỪ NỌC BỊ CẠP HETEROMETRUS LAOTICUS VÀ TOXIN CĨ HOẠT TÍNH GIẢM ĐAU, KHÁNG TĂNG SINH TẾ BÀO UNG THƢ TỪ NỌC RẮN BUNGARUS FASCIATUS Chuyên ngành: Hóa hữu Mã số: 44 01 14 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ HĨA HỌC TP.Hồ Chí Minh – 2021 Cơng trình hồn thành tại: Học viện Khoa học Công nghệ - Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam Người hướng dẫn khoa học 1: TSKH Hoàng Ngọc Anh Người hướng dẫn khoa học 2: TS Phùng Văn Trung Phản biện 1: … Phản biện 2: … Phản biện 3: … Luận án bảo vệ trước Hội đồng đánh giá luận án tiến sĩ cấp Học viện, họp Học viện Khoa học Công nghệ - Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam vào hồi … ’, ngày … tháng … năm 201… Có thể tìm hiểu luận án tại: - Thư viện Học viện Khoa học Công nghệ - Thư viện Quốc gia Việt Nam MỞ ĐẦU Tính cấp thiết luận án Các độc tố tự nhiên từ cỏ, nấm, sinh vật biển, ốc sên động vật có vai trị quan trọng trực tiếp gián tiếp phát triển thuốc Nọc độc động vật chứa nhiều độc tố nhằm để săn mồi tự vệ Rất khó để xác định xác loại nọc độc số lượng độc tố tạo Nọc độc động vật độc tố (từ rắn, bị cạp, rết, ốc, thằn lằn, ếch, cá côn trùng) khảo sát để tìm hoạt tính sinh học khả trị liệu Những độc tố thể nhiều hoạt tính dược học như: gây độc cơ, độc thần kinh, hạ huyết áp, xuất huyết, ức chế kết tập tiểu cầu, chống đông máu, kháng viêm, giảm đau, kháng ung thư diệt khuẩn Bakhle cho thấy thuốc Catopril tạo thành từ nọc loài rắn Brazil, Bothrops juraraca, lên thuốc kiểm soát hạ huyết áp trụy tim bị nhồi máu tim Cobrotoxin phân lập từ loài rắn hổ mang Đài Loan, Naja naja atra , cho có ảnh hưởng làm giảm đau Hanalgesin, độc tố thần kinh alpha (α-neurotoxin) dây dài từ loài rắn hỗ chúa (King Cobra) thể hoạt tính giảm đau chuột, tạo giảm đau nổng độ 16-32 ng/g mà không gây nhiều tác dụng phụ lên thần kinh hay Crotamine báo cáo có ảnh hưởng làm giảm đau nồng độ thấp không rõ ràng độc tính in vivo Ảnh hưởng gây giảm đau Crotamine cao Morphin khoảng 30 lần chứng minh liên quan đến chế giảm đau trung ương ngoại biên Batroxobin, enzym từ nọc lồi rắn Bothrops atrox (lồi rắn lục tìm thấy Nam Trung Mỹ) có đặc tính giống huyết khối có khả cầm máu nồng độ thấp chống đơng máu nồng độ cao Hoạt tính giảm đau chứng minh từ nọc bò cạp độc tố peptide Peptide có hoạt tính giảm đau-kháng khối u từ nọc bị cạp Bothus martense thể tính ức chế mạnh đau nội tạng ngồi da hoạt tính kháng khối u khối u E ascites tế bào xơ hóa S-180 Những độc tố beta (β-toxins) từ nọc bị cạp sử dụng cơng cụ dược lý nghiên cứu việc kích hoạt điện áp kênh ion Na+ Cardiotoxin (CTX 3), polypeptide chứa 60 amino axit với hoạt tính kháng ung thư phân lập từ rắn Naja naja atra CTX ức chế phát triển dòng tế bào K562 phụ thuộc vào nồng độ thời gian khảo sát Một độc tố protein bền nhiệt (drCT-I) có KLPT 7.2 kDa phân lập từ loài rắn lục Ấn Độ (Daboia russelli russelli) có hoạt tính chống đơng máu, gây độc tế bào chết theo chương trình apoptosis Phospholipase A2 (PLA2), phân lập từ nọc lồi Bothrops newweidii có hoạt tính gây độc tế bào dòng tế bào gây khối u ác tính B16 F10 Nọc độc từ lồi bị cạp đen Heterometrus bengalensis ức chế phát triển dòng tế bào U937 K562 Chlorotoxins lần phân lập từ nọc lồi bị cạp Leiurus quinquestriatus, có độc tính dịng tế bào khối u não, liên kết với nhiều khối u não trước khác với tính đặc hiệu 90% Bengalin, protein có KLPT cao tách từ nọc bò cạp đen Ấn Độ Heterometrus bengalensis thể hoạt tính kháng ung thư dịng tế bào U937 K562 Xuất phát từ dược tính nêu nhằm tìm hợp chất có khả trị liệu hiệu để phát triển việc điều chế thuốc tương lai, nên luận án tập trung vào nghiên cứu phân lập xác định cấu trúc số chất từ nọc bò cạp Heterometrus laoticus (phân bố An Giang) từ nọc rắn cạp nong Bungarus fasciatus (phân bố Vĩnh Phúc) Mục tiêu nghiên cứu luận án Nghiên cứu phân lập, khảo sát hoạt tính xác định cấu trúc số hợp chất có hoạt tính chống đơng máu từ nọc bị cạp H laoticus số hợp chất có hoạt tính giảm đau kháng tăng sinh tế bào ung thư từ nọc rắn cạp nong B fasciatus, nhằm ứng dụng y dược Các nội dung nghiên cứu luận án Phân lập làm số hợp chất từ nọc bò cạp H laoticus rắn cạp nong B fasciatus Khảo sát hoạt tính chống đơng máu, giảm đau, kháng tăng sinh tế bào ung thư nọc toàn phần, phân đoạn tách từ nọc bò cạp H laoticus rắn cạp nong B fasciatus Xác định cấu trúc số hợp chất có hoạt tính sinh học làm phương pháp cộng hưởng từ hạt nhân khối phổ CHƢƠNG TỔNG QUAN Trình bày tổng quan nghiên cứu nước quốc tế nọc bò cạp nọc rắn số phương pháp sử dụng để phân lập, làm xác định cấu trúc bậc toxin, peptide, protein tách từ nọc bò cạp nọc rắn CHƢƠNG PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU VÀ THỰC NGHIỆM 2.1 Đối tƣợng nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu nọc bò cạp đen H laoticus (An Giang) nọc rắn cạp nong B fasciatus (Vĩnh Phúc) 2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu thực nghiệm 2.2.1 Sơ đồ tách, làm xác định toxin từ nọc bò cạp H laoticus rắn cạp nong B fasciatus Hình 2.1 Sơ đồ tách, làm xác định toxin từ nọc bị cạp H laoticus Hình 2.2 Sơ đồ tách, làm xác định toxin từ nọc rắn cạp nong B fasciatus 2.2.2 Khảo sát hoạt tính sinh học Khảo sát hoạt tính phân đoạn toxin, protein tách mô hình: hoạt tính đơng-chảy máu mơ hình cắt chuột Barker [99], Liu [100]; Tác động giảm đau ngoại biên nghiên cứu mơ hình đau quặn acid acetic Koster [103]; Tác động giảm đau trung ương nghiên cứu mơ hình (kích thích nhiệt) nhúng đuôi chuột Lanhers Williamson [103]; Khảo sát khả gây độc tế bào ung thư lên tế bào ung thư vú MCF7 ung thư phổi A549 theo phương pháp khảo nghiệm MTT Tim Mosmann [104- 106] 2.2.3 Phân tích thống kê kết Các số liệu thống kê trình bày dạng giá trị trung bình ± SEM (Standard error of mean: sai số chuẩn giá trị trung bình) Phần mềm sử dụng thống kê Minitab 14.0, biểu đồ vẽ phần mềm SigmaPlot 11.0 Sự khác xem có ý nghĩa thống kê giá trị p < 0,05 (độ tin cậy 95%) 2.2.4 Xác định cấu trúc chất có hoạt tính sinh học KLPT cấu trúc chất có hoạt tính chống đơng máu tách từ nọc bị cạp H.laoticus xác định phương pháp khối phổ (ESI-MS) cộng hưởng từ hạt nhân (1H-NMR 13C-NMR) KLPT trình tự amino acid protein tách từ nọc rắn B.fasciatus xác định phương pháp khối phổ MALDI-TOF/TOF-MS, HR-ESI-MS/MS, hệ RP-HPLC ghép nối hệ Q Exactive HF Benchtop Orbitrap MS/MS CHƢƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BIỆN LUẬN 3.1 Kết bò cạp H laoticus 3.1.1 Sắc ký lọc gel nọc bò cạp H laoticus Từ nọc bị cạp H laoticus thơ, tiến hành chạy sắc ký lọc gel Sephadex G-50 thu phân đoạn (PĐ1 - PĐ5) với sắc ký đồ Hình 3.1 Hình 3.1 Sắc ký đồ nọc bò cạp H.laoticus Khối lượng chạy sắc ký lọc gel phân đoạn sau đông khô thể Bảng 3.1 Bảng 3.1 Khối lượng phân đoạn nọc bò cạp H laoticus sau chạy lọc gel Lượng nọc % phân đoạn/ tổng thu (mg) lượng nọc thu (PĐ1) 66,700 4,348 (PĐ2) 126,200 8,227 (PĐ3) 188,200 12,269 (PĐ4) 451,200 29,415 (PĐ5) 701,600 45,740 Phân đoạn Trong phân đoạn thu được, phân đoạn (PĐ5) chiếm tỷ lệ cao với 45,740%, phân đoạn 29,415% Qua kết sắc ký lọc gel với kết khảo sát tác động chống đông máu năm phân đoạn (PĐ1 – PĐ5) hai liều thử nghiệm 1/10 LD50 1/20 LD50 (PL2) [9] cho thấy, phân đoạn (PĐ1 – PĐ5) có ba phân đoạn có tác động đến q trình đơng – chảy máu phân đoạn: PĐ2, PĐ4 PĐ5 (Bảng 3.2 3.3) Do phân đoạn có hàm lượng nhiều KLPT tương đối nhỏ nên nghiên cứu chọn phân đoạn để tiếp tục phân lập làm nhằm xác định hoạt chất phân đoạn thứ cấp tách phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao pha đảo (RP-HPLC) khảo sát tác động chống đông máu chúng chuột 3.1.2 Tách phân đoạn nọc bò cạp H laoticus sắc ký lỏng hiệu cao pha đảo (RP-HPLC) Quá trình phân tách phân đoạn phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao pha đảo (RP-HPLC) với thơng số q trình chạy sắc ký: - Tốc độ dịng : mL/phút - Thể tích lần tiêm mẫu - Thời gian rửa giải : 100 µL : – 35% dung môi B 70 phút - Mật độ quang bước sóng  : 226 nm - Cột XDB - C18 (9,4 × 250 mm, µm) Với điều kiện trên, từ phân đoạn phân tách thành 24 phân đoạn thứ cấp (Hình 3.2) Các phân đoạn thứ cấp thu lại, đông khô bảo quản để khảo sát tác động đơng - chảy máu chuột Hình 3.2 Sắc ký lỏng hiệu cao pha đảo (RP-HPLC) ct XDB - C18 (9,4 ì 250 mm, àm) phân đoạn (PĐ5) nọc bò cạp 3.1.3 Tác động phân đoạn thứ cấp phân đoạn nọc bị cạp H laoticus lên q trình đơng chảy máu 24 phân đoạn thứ cấp phân đoạn thu sau chạy sắc ký lỏng hiệu cao pha đảo (RPHPLC) sử dụng để khảo sát tác động chống đông – chảy máu Qua kết khảo sát cho thấy, 24 phân đoạn thứ cấp tách từ phân đoạn có phân đoạn thứ cấp 5.5, 5.10, 5.11, 5.16, 5.19, 5.22 gây thời gian chảy máu thời gian đông máu dài so với chất chứng (PL5), nghĩa phân đoạn thứ cấp 5.5, 5.10, 5.11, 5.16, 5.19, 5.22 có hoạt tính tác động lên q trình đông - chảy máu Kết thể bảng 3.4 3.5 Bảng 3.4 Thời gian chảy máu phân đoạn thứ cấp có hoạt tính từ PĐ5 Thời gian khảo sát (phút) Mẫu 20 30 60 90 120 Thời gian chảy máu (giây) Chứng 64,00±3,06 27,00±0,97 67,00±3,25 69,00±5,78 80,50±2,72 PĐ 5.5 210,00±4,83 41,30±7,90 19,00±1,26 9,67±2,11 12,00±0,37 PĐ 5.10 125,00±4,91 85,00±6,66 18,00±0,52 88,50±5,49 40,00±7,06 PĐ 5.11 123,33±9,82 43,00±4,05 76,70±4,98 36,70±3,21 19,67±3,47 PĐ 5.16 139,00±5,50 54,67±3,75 16,67±1,52 46,00±5,13 30,33±4,40 PĐ 5.19 102,70±4,67 43,00±5,52 35,70±3,15 36,30±3,84 90,33±4,01 PĐ 5.22 180,00±7,42 37,70±3,44 18,00±1,71 53,33±0,56 22,33±2,09 Thời gian chảy máu (giây) Thời gian khảo sát (phút) Hình 3.3 Tác động phân đoạn thứ cấp có hoạt tính từ PĐ5 lên thời gian chảy máu Bảng 3.4 hình 3.3 cho thấy: Các phân đoạn thứ cấp ảnh hưởng đến thời gian chảy máu chuột theo chiều giảm dần sau: 5.5 > 5.22 > 5.16 > 5.10 > 5.11 > 5.19, phân đoạn thứ cấp 5.5 gây thời gian chảy máu nhiều nhất, gấp 3,3 lần so với lô chứng (phân đoạn 5.5: 210,00 giây, lô chứng: 64,00 giây), kế sau phân đoạn 5.5 phân đoạn 5.22 gây thời gian chảy máu gấp 2,8 lần so với lô chứng (phân đoạn 5.22: 180,00 giây, lô chứng: 64,00 giây), phân đoạn thứ cấp 5.19 gây thời gian chảy máu thấp nhất, gấp 1,6 lần so với lô chứng (phân đoạn 5.19: 102,70 giây, lô chứng: 64,00 giây) Bảng 3.5 Thời gian đông máu phân đoạn thứ cấp có hoạt tính từ PĐ5 Thời gian khảo sát (phút) Mẫu 20 30 60 90 120 Thời gian đông máu (giây) Chứng 293,00±3,82 287,50±6,88 371,50±0,67 268,50±5,33 366,00±9,34 PĐ 5.5 458,70±9,73 360,33±1,93 341,30±8,59 383,70±8,42 284,30±1,86 PĐ 5.10 630,50±6,35 410,00±3,61 431,00±8,05 400,50±5,36 369,50±2,28 PĐ 5.11 409,00±6,73 427,70±8,27 405,00±6,08 367,30±8,03 266,33±4,51 PĐ 5.16 481,00±6,78 381,30±2,26 424,00±7,72 368,00±5,54 395,00±3,39 PĐ 5.19 470,00±7,89 498,00±5,70 531,00±6,35 445,00±4,23 403,00±7,33 PĐ 5.22 563,70±7,46 372,30±4,44 322,30±8,53 302,33±3,84 373,70±4,63 Thời gian đông máu (giây) Thời gian khảo sát (phút) Hình 3.4 Tác động phân đoạn thứ cấp có hoạt tính PĐ5 lên thời gian đơng máu Bảng 3.5 hình 3.4 cho thấy: phân đoạn thứ cấp 5.5 gây thời gian đông máu gấp 1,6 lần so với lô chứng (phân đoạn 5.5: 458,70 giây, lô chứng: 293,00 giây), phân đoạn 5.22 gây thời gian đông máu gấp 1,9 lần so với lô chứng (phân đoạn 5.22: 563,70 giây, lô chứng: 293,00 giây), phân đoạn thứ cấp 5.19 gây thời gian đông máu gấp 1,6 lần so với lô chứng (phân đoạn 5.19: 470,00 giây, lô chứng: 293,00 giây) 3.1.4 Làm hợp chất có hoạt tính chống đông máu từ phân đoạn 5.5 5.22 Sau khảo sát tác động lên q trình đơng – chảy máu phân đoạn thứ cấp tách từ phân đoạn kết thu có phân đoạn thứ cấp ảnh hưởng đến thời gian đông - chảy máu chuột là: 5.5; 5.10; 5.11; 5.16; 5.19 5.22 Do phân đoạn 5.5 5.22 có hoạt tính chống đơng máu mạnh phân đoạn lại (đã khảo sát mục 3.1.3) nên chọn để tiếp tục tiến hành làm sạch, xác định hoạt chất hai phân đoạn khảo sát thêm hoạt tính chống đơng máu 3.1.4.1 Làm phân đoạn 5.5 Quá trình làm phân đoạn thứ cấp 5.5 với thơng số q trình chạy sắc ký: - Tốc độ dòng : mL/phút - Thể tích lần tiêm mẫu : 40 µL - Thời gian rửa giải : – 10% dung môi B 40 phút - Mật độ quang bước sóng  : 210 nm - Cột XDB - C18 (4,6 ì 250 mm, àm) Hỡnh 3.5 Sc ký đồ RP-HPLC phân đoạn thứ cấp 5.5 10 Tiến hành chạy mẫu phân đoạn 5.5 có phân đoạn 5.5.1 Tiếp tục làm phân đoạn 5.5.1 với điều kiện tương tự phân đoạn 5.5 thu toxin 5.5.1 có sắc ký đồ là: Hình 3.6 Sắc ký đồ RP-HPLC chất có hoạt tính chống đông máu 5.5.1 3.1.4.2 Làm phân đoạn 5.22 Quá trình làm phân đoạn thứ cấp 5.22 với thơng số q trình chạy sắc ký: - Tốc độ dịng : mL/phút - Thể tích lần tiêm mẫu : 40 µL - Thời gian rửa giải : 15 – 30% dung môi B 30 phút - Mật độ quang bước sóng  : 226 nm - Cột XDB - C18 (4,6 × 250 mm, µm) Hình 3.7 Sắc ký đồ RP-HPLC phân đoạn thứ cấp 5.22 Khi chạy sắc ký làm phân đoạn 5.22 có phân đoạn 5.22.3 Tiếp tục làm phân đoạn 5.22.3 với điều kiện tương tự phân đoạn 5.22 thu toxin 5.22.3 có sắc ký đồ là: Hình 3.8 Sắc ký đồ RP-HPLC chất có hoạt tính chống đơng máu 5.22.3 21 Quá trình phân tách phân đoạn BF4 sắc ký lỏng hiệu cao (RP-HPLC) với thông số trình chạy sắc ký: - Tốc độ dịng : mL/phút - Thể tích lần tiêm mẫu : 200 µL - Thời gian rửa cột : 15 % đến 45 % B 60 phút - Mật độ quang bước sóng  : 254 nm - Cột Jupiter C18 (4,6 x 250 mm, µm) Kết sắc ký lỏng hiệu cao (RP-HPLC) cột phân tích C18 thu 15 phân đoạn thứ cấp, có năm phân đoạn thứ cấp BF4.7, BF4.11, BF4.12, BF4.14 BF4.15 (Hình 3.19) chọn để khảo sát tiếp hoạt tính giảm đau Hình 3.19 Sắc ký đồ RP-HPLC phân đoạn BF4 ct Jupiter - C18 (4.6 ì 250 mm, 5àm) 3.2.6 Hoạt tính giảm đau số phân đoạn thứ cấp phân đoạn BF4 3.2.6.1 Giảm đau ngoại biên Quá trình khảo sát tác dụng giảm đau ngoại biên năm phân đoạn thứ cấp (BF4.7, BF4.11, BF4.12, BF4.14 BF4.15) với nồng độ thử nghiệm 1/10 LD50 (LD50 = 3,36 mg/kg) thu kết Bảng 3.15 Hình 3.20 Bảng 3.15 Số lần đau quặn chuột liều 0,34 mg/kg ảnh hưởng BF4.7 – BF4.15 Mẫu – 10 Thời gian khảo sát (phút) 20 – 25 Số lần đau quặn Nhóm chứng (nước muối sinh lý) 19,33 ± 1,76 8,67 ± 1,14 5,11 ± 0,79 12,63 ± 1,58* 7,38 ± 1,03 4,63 ± 1,41 14,13 ± 3,46 12,11 ± 3,17 7,44 ± 2,95* 10,75 ± 3,17 12,00 ± 2,63* 4,25 ± 1,19* 3,67 ± 1,26*# 1,33 ± 0,41**## 6,50 ± 1,68 4,78 ± 1,10* 2,00 ± 0,50* 2,22 ± 0,68* 0,67 ± 0,24**## 3,38 ± 0,80 2,33 ± 0,78* Nhóm đối chứng (Aspirin 50,0 mg/kg) BF4.7 BF4.11 BF4.12 BF4.14 BF4.15 (*) p< 0,05, (**) p