Tài liệu hạn chế xem trước, để xem đầy đủ mời bạn chọn Tải xuống
1
/ 13 trang
THÔNG TIN TÀI LIỆU
Thông tin cơ bản
Định dạng
Số trang
13
Dung lượng
1 MB
Nội dung
Chương 2
Sao chép DNA
Mục tiêu của chương
Giới thiệu về saochép DNA, nguyên tắc của saochép và các nhân tố
tham gia vào quátrìnhsaochép DNA, các hệ thống sửa sai DNA nhằm duy
trì tính chính xác của thông tin di truyền qua các thế hệ.
Số tiết: 3
Nội dung
I. Sự bền vững của DNA với thời gian và qua nhiều thế hệ
1. DNA bị biến đổi ngay cả không saochép
Hình 2.1 Sự mất amin của các base (desamination)
DNA là những phân tử rất dài, nhưng mảnh (đường kính: 20 A
o
), lại
thường xuyên chịu tác động môi trường bên trong và bên ngoài tế bào nên
dễ có những đứt gãy, biến đổi ngay cả khi không có sao chép.
31
Người ta tính ra rằng DNA của tế bào người mỗi ngày mất 5000
purin do quátrình mất purin (depurination): dưới tác dụng của nhiệt liên kết
N-glycosil bị thủy phân.
Quá trình biến đổi làm mất amin (desamination): biến cytosin thành
uracin. Mỗi ngày tế bào người có khoảng 100 biến đổi như vậy.
Con người cũng thường xuyên chịu tác động của tia tử ngoại làm tạo
ra các dimer thymine.
Hình 2.2 Sự hình thành dimer thymine dưới tác dụng của tia tử ngoại
2. Trình tự nucleotid được duy trì với mức chính xác rất cao qua nhiều thế
hệ
Dùng các nucleotid và các enzyme DNA polymerse để tổng hợp
DNA in vitro. Sai sót trong trường hợp này là 10
-5
. Như vậy saochép trong
ống nghiệm có mức chính xác cao, nhưng đối chiếu lên các sinh vật thì mức
sai sót này hãy còn quá lớn.
32
Bằng cách đánh giá tần số các đột biến mới xuất hiện trong quần thể
lớn và theo dõi biến đổi enzyme nào đó trong nuôi cấy mô tế bào, người ta
tính được rằng trong cơ thể sinh vật sai sót trong khi saochép in vivo là
1.10
-9
.
Đánh giá tốc độ biến đổi trong tiến hóa cũng khẳng định mức chính
xác rất cao trong saochép in vitro.
3. Các hệ thống bảo vệ DNA
Trong tế bào có một loạt hệ thống để bảo vệ DNA:
- Các sinh vật tiền nhân và nhân thực đều chứa các enzyme có nhiệm
vụ methyl hóa ở những điểm nhất định. Các enzyme cắt hạn chế của mỗi
dòng vi khuẩn không cắt DNA của chúng vì đã được methyl hóa ở những
điểm cần thiết, còn DNA ngoại lai vì không được methyl hóa ở những điểm
nhất định nên bị cắt.
Tế bào còn có các hệ thống sửa sai (repair system):
+ Sửa sai bắng cách cắt bỏ rồi tổng hợp sợi mới
Các enzyme DNA polymerase I, II, III đều có hoạt tính polymerase hóa, còn
có hoạt tính exonuclease theo hướng 5-3.
Hình 2.3 Sửa sai bằng cắt bỏ và tổng hợp lại đoạn bị hỏng
33
+ Sửa sai nhờ cơ chế tái tổ hợp
Ngay cả khi không có saochép vẫn có hệ thống bảo vệ: do DNA có
hai mạch, khi sai hỏng trên một mạch, có thể dựa vào mạch còn lại để tổng
hợp đoạn sai hỏng.
Một số enzyme đặc hiệu phát hiện sự bắt cặp sai, như trong trường
hợp mất purin. Có khoảng 50 enzyme chuyên phát hiện và sửa các sai hỏng
trên phân tử DNA.
Hình 2.4. Sửa sai nhờ enzyme
4. Sửa sai do phục quang hồi
Dưới tác dụng của tia tử ngoại, làm các timin đứng gần nhau sẽ gắn
lại tạo thành dimertimin.
Khi trở lại ánh sáng, ánh sáng sẽ kích thích một enzyme cắt bỏ
dimerthymin tạo timin bình thường. Hiện tượng ánh sáng kích thích một
enzyme cắt bỏ dimerthymin gọi là quang phục hồi.
34
5. Hệ thống SOS
Ở tế bào vi khuẩn hoặc tế bào eukaryote bị sai hỏng nặng do chiếu
tia UV, tia X hoặc do tác dụng của các hóa chất gây đột biến, hệ thống sửa
sai khẩn cấp được khởi động, tăng cường sửa sai. Ở E.coli, hệ thống này có
liên quan với 2 protein được mã hóa bởi gene LexA và RecA. Protein LexA
là một chất ức chế, nó gắn vào hộp SOS, chồng lấp các promotor của các
gene SOS, ngăn cản sự mã nhóm các gen của hệ thống SOS. Một vài sản
phẩm của DNA bị tổn thương sẽ làm hoạt hóa protease recA. Protein recA
bị hoạt hóa sẽ cắt bỏ protein lexA, cho phép các gen của hệ thống SOS
phiên mã. Phẩn ứng của hệ thống SOS xảy ra trong thời gian ngắn nhưng
phức tạp. Nó bao gồm các quátrình làm tăng hoạt tính tái tổ hợp, thay đổi
trong khởi sự sao chép, ức chế nuclease và kích thích phục hồi saochép và
chuyển sai hỏng thành sửa sai úp sấp (error-prone replication). Tế bào bây
giờ sẽ xảy ra sự saochép nhanh hơn bình thường.
+ Nếu sửa sai kịp, tế bào ổn định, sinh trưởng trở lại
+ Nếu không sửa sai kịp thì tế bào phải chấp nhận hoặc chết hoặc bị
đột biến
Hình 2.5 Sửa chữa do quang phục hồi
35
II. Cơ chế phân tử của saochépDNA
1. Nguyên tắc chung
- DNAsaochép theo khuôn.
Ưu điểm: + Với phân tử lớn như vậy thì việc tổng hợp theo khuôn sẽ chính
xác hơn
+ Tiết kiệm được ezyme
+ Đạt hiệu quả nhanh
- Saochép theo nguyên tắc bán bảo tồn (semi-conservative) phân tử
DNA mới được tổng hợp gồm một mạch cũ làm khuôn và một mạch mới
tổng hợp
- Quátrình tổng hợp DNA xảy ra đòi hỏi phải có “ mỗi “ (primer)
- Quátrình tổng hợp xảy ra theo chiều 5 - 3.
Hình 2.6 SaochépDNA theo nguyên tắc bán bảo toàn
36
2. Thí nghiệm tổng hợp nhân tạo DNA
Kornberg (1956) thực hiện phản ứng tổng hợp DNA in vitro. Trong
quá trình tổng hợp ông sử dụng DNA polymerase I, 4 loại desoxynucleotid
triphosphate (ATP, GTP, CTP, TTP), Mg
2+
làm xúc tác. Ngoài ra còn có ít
DNA làm khuôn mẫu.
3. Thí nghiệm chứng minh có sự tự nhân đôi theo nguyên tắc bán bảo tồn
Meselson, Stahl (1958) đã chứng minh kiểu saochép bán bảo tồn.
Nuôi E.coli nhiều thế hệ trên môi trường có nguồn nitơ đồng vị nặng N
15
.
Như vậy tất cả DNA của vi khuẩn đều mang đồng vị nặng N
15
thay cho N
14
bình thường. Sau đó tế bào được chuyển sang môi trường chỉ chứa N
14
nhẹ,
mẫu các tế bào được lấy ra theo những khoảng thời gian đều đặn và chiết
tách DNA. Bằng phương pháp ly tâm trên thang nồng độ CsCl, các loại
DNA nặng, nhẹ và lai được tách ra.
Hình 2.7 Thí nghiệm của Meselson và Stahl
37
Kết quả cho thấy DNA nặng ban đầu (thế hệ 0) chứa N
15
, sau một
lần phân chia cho thế hệ I với DNA lai có tỷ trọng nằm giữa DNA nặng N
15
và DNA nhẹ N
14
. Nói cách khác sau một lần saochép phân tử DNA mới
chứa một nữa mang N
15
và một nữa N
14
. Ở thế hệ II một nữa số phân tử
DNA là lai, nữa còn lại là DNA nhẹ N
14
. Thí nghiệm này khẳng định giả
thuyết của Watson và Crick là đúng tức 2 mạch DNA mẹ tách ra, mỗi cái
làm khuôn để tổng hợp nên mạch mới bổ sung.
4. Diễn biến saochépDNA ở nhiễm sắc thể E.coli
Quá trìnhsaochépDNA ở E.Coli diễn ra qua hai giai đoạn:
4.1. Giai đoạn khởi sự (initiation)
Hình 2.8 SaochépDNA ở vi khuẩn E.coli
38
+ Mở xoắn:
Ở E.coli quátrình bắt đầu khi một protein B đặc hiệu nhận biết điểm
khởi sự saochép (replication orgine) ori và gắn vào trình tự base đặc biệt
đó. Tiếp theo enzyme gyrase (một loại topoisomerase) cắt DNA làm tháo
xoắn ở 2 phía của protein B. Trong khi 2 phân tử enzyme gyrase chuyển
động ngược chiều nhau so với điểm ori thì 2 phân tử của enzyme helicase
tham gia tách mạch tạo chẻ ba sao chép. Helicase sử dụng năng lượng ATP
làm đứt các liên kết hydro giữa 2 base bắt cặp với nhau.
+ Các protein làm căng mạch SSB (single-strand binding protein)
gắn vào các mạch đơn DNA làm chúng tách nhau, thẳng ra và ngăn không
cho chập lại hoặc xoắn để việc saochép được dễ dàng.
+ Tổng hợp mồi (primer) dặc trưng cho quátrình kéo dài chuỗi là
DNA polymerase chỉ hoạt động khi đã có mồi, nên trước khi tổng hợp chuỗi
thì phải có quatrình tổng hợp mồi. Mồi là một đoạn khoảng 9 -10 nu, có thể
là DNA hoặc ARN.
4.2. Giai đoạn nối dài (elongation)
Do tính chất đối song song nên khi tách ra thành 2 mạch đơn khuôn
thì một mạch có đầu 3
’
, mạch kia có đầu 5
’
nên để đảm bảo hướng saochép
của DNA theo chiều 5
’
-3
’
thì sự polymer hóa dựa vào 2 mạch khuôn DNA
diễn ra khác nhau.
Mạch khuôn có đầu 3
’
được DNA polymerase III gắn vào và tổng
hợp ngay mạch bổ sung 5
’
-3
’
hướng vào chẻ ba sao chép. Mạch khuôn này
được gọi là mạch khuôn trước, còn mạch mới được tổng hợp gọi là mạch
trước (leading strand).
Ở mạch có đầu 5
’
(mạch khuôn sau) việc tổng hợp phức tạp hơn và
thực hiện từ chẻ ba saochép hướng ra ngoài để đảm bảo đúng hướng 5
’
-3
’
.
Khi mạch kép tách ra ở gần chẻ ba saochép , enzyme primase gắn mồi
(primer) ARN khoảng 10 nucleotid có trình tự bổ sung với mạch khuôn.
DNA-polymerase III nối theo mồi ARN, theo hướng ngược với chẻ ba sao
chép, tổng hợp các đoạn ngắn 1000-2000 nucleotid, gọi là các đoạn Okazaki
(người phát hiện là Reiji Okazaki). DNA polymerase nối dài đoạn Okazaki
đến khi gặp ARN mồi phía trước thì dừng lại, rồi lùi ra sau tiếp tục tổng hợp
từ ARN mồi mới được tạo nên gần chẻ ba sao chép. Tiếp theo DNA-
39
polymerase I nhờ hoạt tính exonuclease 5
’
-3
’
cắt bỏ mồi ARN, lắp các
nucleotid của DNA vào chỗ trống và thực hiện polymer hóa hướng 5
’
-3
’
.
Đoạn DNA ngắn 10 nucleotid này còn hở 2 đầu, chỗ hở được nối nhờ
enzyme ligase của DNA mạch được tổng hợp từ chẻ ba saochép hướng ra
ngoài được tổng hợp chậm hơn nên gọi là mạch sau (lagging strand).
Quá trìnhsaochépDNA ở E.coli diễn ra với tốc độ rất nhanh, có thể
đạt đến 50.000 nucleotid/phút.
III. SaochépDNA trong tế bào
1. Saochép ở nhiễm sắc thể Prokaryote
Để theo dõi saochépDNA đồng vị phóng xạ Thymidin (tiền chất
đặc hiệu cho DNA) được sử dụng. Quátrìnhsaochép xuất phát từ một điểm
ori (điểm xuất phát sao chép) và triển khai ra cả 2 phía. Khi DNA vòng tròn
đang sao chép, quan sát thấy dạng DNA hình con mắt. Chẻ ba saochép lan
dần cuối cùng tạo ra 2 phân tử DNA lai: một mạch có mang dấu phóng xạ
(thymidin-H
3
). Có trường hợp saochép chỉ xảy ra về một phía.
E.coli chỉ có một điểm xuất phát saochép ori nên cả phân tử DNA
thành một đơn vị saochép thống nhất được gọi là replicon. Bộ gen của sinh
vật tiền nhân thường chỉ có một replicon.
Hình 2.9 SaochépDNA từ một điểm về 2 phía và về một phía
40
[...]... replicon, tức có 500 điểm xuất phát sao chépQuátrìnhsaochép cũng bắt đầu từ ori rồi lan về 2 phía Tế bào có cơ chế kiểm soát nghiêm ngặt quátrìnhsao chép, điểm ori nào đã saochépqua một lần rồi thì không lặp lại trước khi toàn bộ DNA được saochép hoàn toàn Ở các eukaryote có 5 loại DNA polymerase được ký hiệu là pol α, pol β, pol γ, pol δ, pol ε Các loại DNA polymerase này không đồng nhất về... trong ty thể và tham gia tái bản DNA ở ty thể, các DNA polymerase còn lại ở trong nhân Trong nhân, DNA polymerase δ và DNA polymerase ε là 2 enzyme chính tham gia tổng hợp trên sợi khuôn dẫn đầu và sợi chậm Pol β và tiểu đơn vị bé của pol δ có hoạt tính đọc sửa Câu hỏi ôn tập 1 Hãy trình bày thí nghiệm chứng minh sao chépDNA theo nguyên tắc bán bảo toàn 2 Sao chépDNA trên 2 mạch khuôn xảy ra như... khuôn xảy ra như thế nào? 3 Các cơ chế nào đã đảm bảo sự ổn định rất cao của thông tin di truyền 4 Hãy nêu các nhân tố tham gia vào sao chépDNA 5 Trình bày diễn biến saochépDNA ở nhiễm sắc thể E.coli 6 Mục đích của cơ chế saochép từ một phân tử DNA cho ra nhiều bản sao Tài liệu tham khảo Phạm Thành Hổ (2000) Di truyền học NXB Giáo Dục Nguyễn Bá lộc (2004) Acid nucleic và sinh tổng hợp protein Trung...2 Saochép nhiễm sắc thể ở tế bào eukaryote Tế bào nhân thực có số lượng DNA lớn hơn nhiều so với tế bào tiền nhân, tạo nên nhiều nhiễm sắc thể mà mỗi cái gồm một sợi DNA thẳng kết hợp với protein Do đó sao chépDNA của tế bào nhân thực phức tạp hơn và tốc độ chậm hơn (khoảng 50 nucleotid/giây) Hình 2.10 Saochép của nhiều replicon 41 Điểm khác căn bản là DNA của tế bào nhân thực