Phát hiện một số trường hợp đột biến lặp đoạn Exon 2 xảy ra trong quá trình sao chép gen Dystrophin ở bệnh nhân loạn dưỡng cơ Duchenne ppt

12 TCNCYH 34 2 - 2005 Phát hiện một trường hợp đột biến lặp đoạn exon 2 xảy ra trong quá trình sao chép gen dystrophin ở bệnh nhân loạn dưỡng cơ Duchenne.. Thêm vào đó một cặp mồi với

12

TCNCYH 34 (2) - 2005

Phát hiện một trường hợp đột biến lặp đoạn exon 2 xảy ra trong quá trình sao chép gen dystrophin ở

bệnh nhân loạn dưỡng cơ Duchenne

Trần Vân Khánh 1

V à Tạ Thành Văn 2

1 , Viện Công nghệ sinh học, Trung tâm Khoa học tự

nhiên và Công nghệ Quốc gia 2

, Bộ môn Hóa-Hóa sinh, Trường Đại học Y khoa Hà nội Gen dystrophin là một gen có cấu trúc rất dài, điều này đã làm cho quá trình phiên mã của gen trở nên phức tạp hơn, đặc biệt là ở đầu gen 5’ Trong nghiên cứu này chúng tôi công bố một bệnh nhân loạn dưỡng cơ Duchenne có đột biến lặp đoạn exon 2 Điều rất đáng chú ý là đột biến này không xuất hiện ở ADN (genome) Chính vì vậy, chúng tôi giả thiết rằng đây là kết quả của quá trình trans-splicing xảy ra trong quá trình sao chép của gen dystrophin Nguyên nhân và cơ chế của hiện tượng này chưa được biết rõ ràng

và hiện đang được tiếp tục nghiên cứu

I Đặt vấn đề

Duchenne là một loại bệnh gây nên do

đột biến gen dystrophin Đây là một gen

lớn có chiều dài khoảng 3000 kb, nằm

trên nhiễm sắc thể X, mã hóa 14 kb

mARN là hợp phần của 79 exon [1, 2]

Hơn 90% trình tự gen là tổ hợp các intron,

một vài intron có chiều dài rất lớn điển

hình là intron 2 (khoảng 157 kb) Tại đây

thường xảy ra một số lỗi trong quá trình

hoàn thiện các tiền mARN Một trong các

khâu của quá trình hoàn thiện tiền mARN

là cắt bỏ các intron và ghép nối các exon

lại với nhau Quá trình này đòi hỏi một số

trình tự quan trọng nằm ở đầu 5’ tận

(acceptor splicing site), 3’ (donor splicing

site) và tại vị trí nhánh của intron (branch

consensus site) Ngoài ra quá trình này

còn cần một số vùng trình tự khác nằm

trong exon bao gồm vùng giàu base

purine (purine-rich region), vùng tăng

cường quá trình ghép nối (splicing

enhancer sequence- SES) và vùng trình

tự nhận biết exon (exon recognition

sequence) Gần đây người ta chứng minh rằng một số nhóm các protein tham gia vào quá trình nhận biết SES góp phần quan trọng trong quá trình hoàn thiện các tiền mARN Một số nghiên cứu đã chứng minh rằng trong quá trình này, đột biến thêm đoạn thường gặp hơn cả so với một

số đột biến khác Cho đến nay một vài exon được sao chép lại từ intron của gen dystrophin đã được công bố như exon X, exon 2a và exon 3a Các exon này lần lượt được sao chép từ intron 1, 2, 3 và hợp nhất để tạo ra cấu trúc mARN của dystrophin [3, 7] Trans- splicing là một hiện tượng ít được biết đến hơn trong quá trình hoàn thiện các tiền mARN Trong nghiên cứu này chúng tôi công bố một bệnh nhân loạn dưỡng cơ Duchenne có

đột biến lặp đoạn exon 2 Điều rất đáng chú ý là đột biến này không xuất hiện ở ADN Chính vì vậy, chúng tôi giả thiết rằng đây là kết quả của quá trình trans-splicing xảy ra trong quá trình sao chép của gen dystrophin

13

II Đối tượng và phương pháp

nghiên cứu

2.1 Đối tượng

Bệnh nhân DMD được chẩn đoán dựa

vào những triệu chứng lâm sàng và cận

lâm sàng điển hình: yếu cơ có tính chất

tiến triển, phì đại cơ cẳng chân, mất khả

năng đi lại ở tuổi 12, nồng độ CK tăng

cao trong máu ngoại vi và sinh thiết cơ có

hình ảnh điển hình của bệnh

2.2 Phương pháp nghiên cứu

ADN được tách chiết từ máu ngoại

biên theo qui trình phenol/chloroform

chuẩn Để xác định đột biến xóa đoạn,

lặp đoạn hay thêm đoạn ở mức độ ADN,

phương pháp Southern blot đã được tiến

hành dựa theo quy trình của một báo cáo

trước đây [2] mARN tổng số được tác

chiết từ máu ngoại biên và tổng hợp

cADN theo kỹ thuật của Chomczynsky

[4] Để xác định một số đột biến bất

thường xảy ra trong quá trình phiên mã,

20 cặp mồi khác nhau đã được sử dụng

Toàn bộ chiều dài gen dystrophin được

khuyếch đại từ cADN bằng phản ứng

polymerase chain reaction (PCR) Thêm

vào đó một cặp mồi với chiều xuôi bổ

xung với exon 1 (1C:

5’-ATGCTTTGGTGGGAAGAAGTAG-3’) và

chiều ngược bổ xung với exon 4 (c4r:

5’-GTTCAGGGCAGAAGTCTTG-3’) đã

được sử dụng để định vị rõ ràng hơn đột

biến lặp đoạn ở vùng 5’ tận Sản phẩm

của phản ứng PCR được điện di trên gel

agarose với nồng độ từ 2-3% Để xác

định trình tự, sản phẩm phản ứng PCR đã

được cắt ra và tinh chế từ gel sau đó được

đưa vào vector tạo dòng PT7-blue (Novagen) Trình tự gen được xác định bằng máy đọc trình tự tự động (model 373A, Applied Biosystems, Foster City, California, USA)

III Kết quả

3.1 Phản ứng khuếch đại cADN từ exon 1 đến exon 4

Sử dụng kỹ thuật PCR với 20 cặp mồi khác nhau chúng tôi đã khuyếch đại toàn

bộ chiều dài cADN của gen dystrophin Kết quả của phản ứng PCR đã cho thấy:

ở vùng 5’ của gen này có 2 vạch tương ứng với 2 sản phẩm PCR có kích thước lớn hơn bình thường Sự thay đổi này gợi

ý có sự đột biến thêm đoạn tại vùng gen tại đầu 5’ Với mục đích định vị chính xác vùng đột biến, chúng tôi đã sử dụng thêm một cặp mồi khác khuyếch đại vùng gen nhỏ hơn kéo dài từ exon 1 đến exon 4, sau đó chạy điện di trên gel với nồng độ agarose cao (3%) nhằm mục đích phân tách các sản phẩm PCR Hai sản phẩm PCR được xác định có kích thước là 387

bp và 287 bp (hình 1a) Trình tự của các nucleotide của sản phẩm PCR này đã khẳng định rằng đầu 3’ của exon 2 gắn trực tiếp với đầu 5’ của một exon 2 khác gây ra hiện tượng lặp một đoạn của exon này, bên cạnh đó 162 bp của exon X cũng được xác định Đoạn này nằm giữa exon 1 và exon 2 (hình 1b)

C P Mk

1c-c4r

387bp

287 bp

225 bp

A

} 2 sản phẩm PCR của bệnh nhân

Sản phẩm PCR bình thường tương ứng với mẫu đối chứng

}

B

Exon X

13

Hình 1: A, Sản phẩm khuyếch đại của cADN kéo dài từ exon 1 đến exon 4 Hai sản phẩm (387 và 287 bp) được khuyếch đại từ mẫu cADN của bệnh nhân (dòng P), cả 2 sản phẩm này

đều có kích thước lớn hơn so với mẫu đối chứng ( 225 bp - dòng C); C, mẫu đối chứng của người bình thường; P, bệnh nhân Mk: Marker Hae III-digested Ô 174 phage ADN B, Trình tự của vùng đột biến lặp đoạn exon 2 (gi:M18533) và exon X (gi: 306722) ở đầu 5’ tận của gen dystrophin Hình bên trái: Trình tự đầu 3’ của exon 1 gắn trực tiếp với đầu 5’ của exon X; Hình bên phải: Trình tự đầu 3’ của exon 2 gắn trực tiếp với đầu 5’ của một exon 2 khác.

3.2 Kết quả phản Southern blot xác

định đột biến trên ADN sử dụng đoạn

dò Bgl II

Exon 2 lặp đoạn ở đầu 5’ của gen

dystrophin đã được xác định trên một

bệnh nhân DMD Hiện tượng lặp đoạn

này không xác định được ở ADN

(genome) của tế bào bằng kỹ thuật

Southern blot mà chỉ xác định được ở mức độ mARN (transcript) Kết quả Southern blot của sản phẩm lai tạo exon

2 đã cho thấy: một vạch lai tạo duy nhất

có kích thước tương ứng với kích thước của sản phẩm bình thường (hình 2A) Kết quả mô tả vị trí xác định bởi đầu dò Bgl II

được diễn dải ở hình 2B

A

13

Hình 2 A, Kết quả lai tạo của phản ứng Southern blot sử dụng đoạn dò Bgl II Dòng 1: sản phẩm lai tạo của bệnh nhân; Dòng 2: sản phẩm lai tạo của mẫu đối chứng B, Quá trình trans-splicing Ba mô hình trans-splicing của gen dystrophin được chỉ dẫn bằng các dòng

kẻ khác nhau.

IV Bàn luận

Việc phân tích khởi đầu bằng kỹ thuật

Southern blot Tuy nhiên đột biến vẫn

chưa được xác định cụ thể do kỹ thuật

này chỉ dừng ở mức độ phân tích ADN

Theo nhiều báo cáo được tổng kết từ

trước đến nay thì nhiều trường hợp đột

biến không xảy ra ở ADN mà phát sinh

trong quá trình sao chép do nhiều nguyên

nhân khác nhau [3, 6, 7] Để nghiên cứu

sâu hơn ở mức độ mARN, bằng phản ứng

PCR chúng tôi đã dùng 20 cặp mồi khác

nhau khuyếch đại toàn bộ chiều dài của

gen dystrophin từ cADN Kết quả PCR đã

cho thấy một đoạn gen ở vùng 5’ tận có 2

vạch tương ứng với 2 sản phẩm PCR có

kích thước lớn hơn bình thường Điều này

cho phép chúng tôi đưa ra giả thuyết rằng

đột biến thêm đoạn hoặc lặp lại đoạn gen

đã có thể xảy ra ở vùng 5’ Để định vị rõ hơn vùng đột biến, chúng tôi sử dụng thêm một cặp mồi khác nhằm mục đích khuyếch đại vùng gen nhỏ hơn kéo dài từ exon 1 đến exon 4, sau đó chạy điện di trên gel với nồng độ agarose cao để có thể phân tích một cách chính xác các sản phẩm PCR Kết quả cho thấy hai sản phẩm PCR được xác định có kích thước là

387 bp và 287 bp Kết quả xác định trình

tự nucleotide của các sản phẩm PCR này

đã chỉ ra rằng đầu 3’ của exon 2 gắn trực tiếp với đầu 5’ của một exon 2 khác gây

ra hiện tượng lặp một đoạn của exon này, bên cạnh đó 162 bp của exon X cũng

được xác định Đoạn này nằm giữa exon

1 và exon 2 Trình tự của exon X đã được báo cáo trước đây bởi Roberts 1993 [6]

Đây là một pseudoexon và được coi như

là một hiện tượng bình thường trong quá

1 2

Ex 4 (12.8 kb) B

Ex 2 (6 kb)

Ex 3 (3 kb)

2

1 X 2 2 3 4

4

2 3 1

13

trình sao chép và hoàn thiện để tạo

mARN trưởng thành của gen dystrophin

Trong nghiên cứu này, exon 2 lặp

đoạn ở đầu 5’ của gen dystrophin đã

được xác định trên một bệnh nhân được

chẩn đoán là DMD Điều đáng chú ý là

hiện tượng lặp đoạn này không xác định

được ở ADN bằng kỹ thuật Southern blot

mà chỉ xác định được ở mức độ mARN

Kết quả Southern blot cho thấy sản phẩm

lai tại exon 2 có một vạch duy nhất có

kích thước tương ứng với kích thước của

sản phẩm bình thường Từ đó, chúng tôi

có thể kết luận rằng hiện tượng lặp đoạn

của exon 2 ở đầu 5’ tận của gen

dystrophin là do hiện tượng trans-splicing

xảy ra trong quá trình sao chép của gen

Trans-splicing là một hiện tượng xảy ra

trong quá trình hoàn thiện các tiền

mARN Sản phẩm của quá trình này phát

sinh từ 2 sản phẩm tiền mARN của

dystrophin, trong đó 2 đoạn mARN là sản

phẩm của các quá trình sao chép khác

nhau được ghép nối với nhau để tạo ra

một sản phẩm mới

Hiện tượng trans-splicing của gen này

lần đầu tiên đã được tìm thấy trên loài

khuẩn trypanosomes [8] và nó đã được

coi như là một hiện tượng khác thường

của quá trình sao chép Tiếp sau đó nó

được phát hiện trên một số loại giun tròn

(nematodes) và tế bào thực vật Điều này

chứng tỏ rằng đây là một hiện tượng khá

phổ biến và xảy ra tại rất nhiều mô khác

nhau ở thời điểm đó, một số nhà khoa

học đã nghĩ rằng quá trình trans-splicing

có thể cung cấp cho họ những ý tưởng để

nghiên cứu một số liệu pháp điều trị mới

nếu hiện tượng này chỉ xảy ra ở một số tổ

chức nhất định, đặc biệt nếu không xảy ra

trên người và động vật có vú Tuy nhiên

trans-splicing sau đó lại tiếp tục được

phát hiện ở tế bào gan chuột bởi Caudevilla [3] Tác giả này đã phát hiện

ra rằng rất nhiều dạng mARN khác nhau của gen cartidine octanoyltransferase có hiện tượng lặp đoạn của exon 2 hay exon

2 và 3 mà không xác định được ở ADN Cho đến nay hiện tượng này cũng đã

được tìm thấy trên gen của người, Fluriot

đã tìm thấy hiện tượng lặp đoạn của exon 1a ở vùng 5’ của gen estrogen receptor-á

mà hiện tượng này cũng không được xác

định ở ADN bằng Southern blot [5] Cho

đến hiện nay, trans-splicing đã được chứng minh là một hiện tượng xảy ra khá phổ biến Tuy nhiên nguyên nhân và cơ chế của hiện tượng này vẫn chưa được biết rõ ràng và hiện vẫn đang được các nhà khoa học tiếp tục quan tâm nghiên cứu

Tài liệu tham khảo

1 Trần Vân Khánh và Tạ Thành Văn Bệnh loạn dưỡng cơ Duchenne và

Becker: Đặc điểm lâm sàng và cơ chế sinh học phân tử Tạp chí thông tin Y học

2004 (đã gửi đăng)

2 Ahn, A.H., and Kunkel, L M The

structural and functional diversity of dystrophin Nat Genet 3, 283-291, (1993)

3 Caudevilla, C., Serra, D., Miliar, A., Codony, C., Asins, G., Bach, M., Hegardt, F G Natural trans-splicing in

carnitine octanoyltransferase pre-mARNs

in rat liver Proc Natl Acad Sci U S A 95, 12185-12190, (1998)

4 Dwi Pramono, Z A., Takeshima, Y., Surono, A., Ishida, T., Matsuo, M

Novel criptic exon in intron 2 of the human dystrophin gene evolved from an intron by acquiring consensus sequences for splicing at different stages of

14

anthropoid evolution Biochem biophys

Res Commun 267, 321-328, (2000)

5 Fluriot, G Natural trans-spliced

mARNs are generated from the human

estrogen receptor-alpha (hER alpha)

gene J Biol Chem 277, 26244-26251,

(2002)

6 Roberts, R G., Bentley, D R.,

Bobrow, M Infidelity in the structure of

ectopic transcripts: a novel exon in

lymphocyte dystrophin transcripts: Hum

Mutat 2, 293-299, (1993)

7 Suminaga, R., Takeshima, Y., Adachi, K., Yagi, M., Nakamura, H., Matsuo, M A novel cryptic exon in intron

3 of the dystrophin gene was incorporated into dystrophin mARN with a single nucleotide deletion in exon 5 J Hum Genet 47, 196-201, (2002)

8 Sutton, R E., Boothroyd, J C

Evidence for trans-splicing in trypanosomes Cell 47, 527-535, (1986)

Summary

Repeating exon 2 mutation caused by trans-splicing dystrophin

gene in Duchenne muscular dystrophin (DMD) patient

The Dystrophin gene is the largest human gene, mutations in this gene cause Duchenne muscular dystrophin (DMD) disease This is complex genomic unit exhibiting many errors splicing during mARN process More than 10 alternative splicing products have been identified in the 5’ region of the dystrophin gene In this study, two dystrophin transcripts including one containing exon 2 and exon X duplications, other one containing single exon 2 duplication were identified in peripheral blood lymphocytes of DMD case Interestingly, genomic Southern blot analysis ruled out the hypothesis of duplication of dystrophin at exon 2 Therefore, these data suggested that exon 2 duplication transcripts were likely generated by trans-splicing event that occurring during the mARN maturation in which RNA segments of two independent transcripts are spliced together to generate a new mARN species However, the mechanisms modulating the trans-splicing activity of the dystrophin exon 2 remain to be clarified