Phát hiện đột biến gene Dystrophin bằng các phương pháp sinh học phân tử trên bệnh nhân loạn dưỡng cơ Duchenne/Becker

Loạn dưỡng cơ Duchenne (DMD) là một trong những bệnh thần kinh cơ - di truyền phổ biến nhất với tỷ lệ mới mắc là 1/3.500 trẻ trai đẻ sống. Mục tiêu: Xác định đột biến trên gene Dystrophin.

TẠP CHÍ NHI KHOA 2016, 9, PHÁT HIỆN ĐỘT BIẾN GENE DYSTROPHIN BẰNG CÁC PHƯƠNG PHÁP SINH HỌC PHÂN TỬ TRÊN BỆNH NHÂN LOẠN DƯỠNG CƠ DUCHENNE/BECKER Ngô Mạnh Tiến*, Nguyễn Thị Phương Mai*, Nguyễn Thị Mai Hương*, Lý Thị Thanh Hà*, Ngô Thị Tuyết Nhung*, Ngô Diễm Ngọc*, Nguyễn Ngọc Khánh**, Bùi Phương Thảo**, Vũ Chí Dũng** Khoa Di truyền SHPT, Bệnh viện Nhi TW * Khoa Nội tiết-Chuyển hố-Di truyền, Bệnh viện Nhi TW ** TĨM TẮT Loạn dưỡng Duchenne (DMD) bệnh thần kinh - di truyền phổ biến với tỷ lệ mắc 1/3.500 trẻ trai đẻ sống Mục tiêu: Xác định đột biến gene Dystrophin Đối tượng phương pháp nghiên cứu: Nghiên cứu thực 564 bệnh nhân chẩn đoán nghi ngờ mắc bệnh loạn dưỡng Duchenne từ năm 2005 đến 12-2014 Bệnh Viện Nhi Trung ương Phát đột biến đoạn lặp đoạn gene Dystrophin kỹ thuật Multiplex PCR kỹ thuật MLPA (Multiplex Liation-dependent Probe Amplification) Kết quả: Trong nghiên cứu này, phát 172/564 (30.5%) trường hợp bị đột biến đoạn lặp đoạn, 157/564 (27.8%) trường hợp đột biến đoạn kỹ thuật Multiplex PCR Những trường hợp không phát thấy đột biến, thực tiếp kỹ thuật MLPA phát trường hợp đột biến đoạn trường hợp đột biến lặp đoạn Vị trí đột biến đoạn tập trung vùng hotspot gene Dystrophin, gồm đột biến vùng trung tâm (exon 45-52) chiếm 61,1% vùng đầu 5’ (exon 1-19) chiếm 29,3%, đột biến vùng cịn lại chiếm 9.63% (khơng đặc hiệu) Kết luận: Kỹ thuật Multiplex PCR kỹ thuật MLPA phát đột biến đoạn lặp đoạn gene Dystrophin có độ nhạy độ đặc hiệu cao, hiệu chẩn đoán di truyền bệnh loạn dưỡng Duchenne Từ khóa: Duchenne, DMD, Dystrophin, multiplex PCR (MPCR) ĐẶT VẤN ĐỀ Loạn dưỡng Duchenne (DMD)/ Loạn dưỡng Becker (BMD) nhóm bệnh di truyền lặn liên kết giới tính đột biến gene Dystrophin gây suy yếu cách tuần tiến dẫn đến tàn tật tử vong suy tim bội nhiễm phổi Các dấu hiệu lâm sàng bệnh nhận biết giai đoạn trẻ từ đến tuổi Các bệnh nhân coi mắc thể nặng phải ngồi xe lăn, khả (DMD) DMD bệnh thần kinh tự lại trước tuổi 12 (1) Bệnh loạn dưỡng phổ biến trẻ em với tỷ lệ mắc 1/3500 trẻ trai Becker (BMD) thể trung gian bệnh DMD đẻ sống (1) Bệnh DMD có đặc trưng thoái hoá với thời kỳ khởi phát bệnh muộn có tiến 62 PHẦN NGHIÊN CỨU triển lâm sàng chậm Tỷ lệ mắc bệnh BMD khoảng 1/18,500 trẻ trai đẻ sống (2) Gene Dystrophin (DMD) gene lớn gene người, nằm cánh Nghiên cứu sử dụng phương pháp hồi cứu, thực 564 bệnh nhân nam từ tháng đến 19 tuổi mắc DMD điều trị Bệnh viện Nhi trung ương từ 12/2005 đến 01/2015 ngắn nhiễm sắc thể X (Xp21) có độ lớn 2.4Mb Tiêu chuẩn chọn bệnh nhân dựa tiêu Gene DMD gồm 79 exon, mã hóa cho protein chuẩn cổ điển Duchenne mơ tả bao gồm: dystrophin có độ lớn 427kDa Đây loại protein trẻ trai; giảm vận động, yếu gốc chi (dấu hiệu màng bao cơ, chủ yếu tập trung xương Gowers), teo gốc chi nhiều vị trí, đối xứng hai tim Một lượng nhỏ protein Dystrophin tập trung bên, bắp chân phì đại đối xứng hai bên, điện tế bào thần kinh não Ở bệnh đồ có hình ảnh tổn thương nguồn gốc sợi cơ; men nhân DMD, protein dystrophin thường không creatine kinase huyết tăng cao 20 lần biểu hiện, bệnh nhân BMD thường so với trị số bình thường (13) có khoảng 10-40% lượng protein dystrophin Các đột biến xảy gene đột biến đoạn, đột biến điểm, chuyển đoạn đoạn nhỏ Mất đoạn lặp đoạn loại đột biến hay 2.2 Phương pháp 2.2.1 Mẫu bệnh phẩm: 2ml máu ngoại vi chống đông EDTA vô trùng gặp nhất, chiếm khoảng 65% số đột 2.2.2 Tách chiết DNA từ máu ngoại vi biến (3-5) Trong đó, đột biến đoạn hay xảy DNA đước tách chiết theo QiaAmp DNA blood vùng “hot spots” gen, chủ yếu từ exon mini kit (QiAgen) Nồng độ độ tinh DNA 44 đến exon 52 từ exon đến exon 19 (6) xác định máy Biophotometter plus Trong nghiên cứu này, sử dụng hai (Eppendorf), mẫu đạt độ tinh OD (bước phương pháp Multiplex PCR MLPA để phát sóng 260/280) 1,8-2.0 sử dụng làm đột biến gene DMD 564 bệnh nhân phản ứng nghi ngờ mắc bệnh DMD/BMD đến khám điều 2.2.3 Phản ứng Multiplex PCR trị Bệnh viện Nhi Trung ương từ năm Kỹ thuật Multiplex PCR phát đoạn 2005 đến năm 2015 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng nghiên cứu 25 exon đặc hiệu tập trung vùng “hotspots” gene 25 exon chia thành Multiplex A, B, C Trình tự mồi thiết kế theo Chamberlain cộng (7) 63 TẠP CHÍ NHI KHOA 2016, 9, Bảng Các exon Multiplex A, B, C Multiplex A Multiplex B Mutiplex C Exon Kích thước (bp) Exon Kích thước (bp) Exon Kích thước (bp) 45 547 Pm 535 49 439 48 506 410 Pb 332 19 459 43 357 16 290 17 416 50 271 41 270 51 388 13 238 32 253 360 202 42 195 12 331 47 181 34 171 44 268 60 139 196 52 113 Chu trình nhiệt tiến hành với điều trộn kỹ với 30µL PCR buffer mồi, sau kiện sau: 950C, phút; [950C, 30s; 500C, 30s; 720C, phản ứng PCR thực điều kiện luân phút] x 30 chu kỳ nhiệt PCR Các đầu dị khơng ghép nối Sản phẩm PCR điện di gel agarose với mang primer không 3%, nhuộm Ethidium nhận định kết khuếch đại Sản phẩm sau khuếch đại đèn UV điện di phân tách đoạn hệ thống ABI 3130 2.2.4 Phản ứng MLPA Kỹ thuật MLPA (MRC-Holland, Hà Lan) thực cách sử dụng đầu dò thương mại Dữ liệu phân tích phần mềm Coffalyser KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 5µL buffer AE biến tính 98oC 3.1 Phát đột biến kỹ thuật Multiplex PCR phút, trộn với 3µL hỗn hợp probe MLPA buffer Nhóm nghiên cứu sàng lọc đột biến đoạn Phản ứng lai: hỗn hợp DNA probe sau 564 trường hợp kỹ thuật Multiplex ủ 95oC phút 60oC 12 PCR phát 157/564 (27.8%) bệnh nhân có qua đêm Phản ứng nối: hỗn hợp DNA đột biến đoạn Trong có 96/157 (61.1%) probe cho thêm với 32µL hỗn hợp Ligase-65 bệnh nhân đoạn vùng hot spot trung tâm (từ buffer 54oC 15 phút bất hoạt 980C exon 45-52); 46/157 (29.3%) bệnh nhân đoạn phút Phản ứng PCR: sản phẩm sau nối vùng exon 3-19 P034 P035 50-200ng DNA mẫu pha loãng 64 PHẦN NGHIÊN CỨU Bảng Tỷ lệ đoạn vùng hot spots Stt Vị trí gene có đoạn N (%) Exon – 19 46 (29.3) Exon 32 – 44 15 (9.6) Exon 45 – 52 (vùng hospot) 96 (61.1) Tổng số 157 (100) Hình Kết điện di multiplex PCR agarose Giếng 1: marker 100bp; Giếng 2a, 2b, 2c: mẫu chứng đoạn exon 3-44; Giếng 3a, 3b, 3c: mẫu chứng không đoạn; Giếng 4a, 4b, 4c: bệnh nhân đoạn exon 41, 42, 43; Giếng 5a, 5b, 5c: bệnh nhân không đoạn; Giếng 6a, 6b, 6c: bệnh nhân đoạn exon 12, 13; Giếng 7a, 7b, 7c: mẫu không chứa DNA 3.2 Phát đột biến kỹ thuật MLPA đoạn, có trường hợp bị đột biến 61 bệnh nhân khơng tìm thấy đột biến mất đoạn exon, trường hợp đột biến đoạn kỹ thuật Multiplex PCR thực đoạn vùng hotspots (exon 65-74), tiếp kỹ thuật MLPA để phát đột 09/61 (14.75%) bệnh nhân có đột biến lặp biến đoạn nhỏ lặp đoạn Kết đoạn, có trường hợp có đột có 06/61 (9.84%) bệnh nhân bị đột biến biến lặp đoạn exon 65 TẠP CHÍ NHI KHOA 2016, 9, Bảng Tỷ lệ phát đột biến gene DMD kỹ thuật MLPA Stt Dạng đột biến N (%) Mất đoạn (9.84%) Lặp đoạn (14.75%) Không phát đột biến 46 (75.41%) Tổng số 61 (100%) Hình Điện di mao quản P034 - DMD 2a: Mẫu đối chứng khơng có đột biến (NC) 2b: Mẫu bệnh nhân lặp đoạn exon 44-50 66 PHẦN NGHIÊN CỨU Hình Điện di mao quản P035 - DMD 3a: Mẫu đối chứng khơng có đột biến (NC) 3b: Mẫu bệnh nhân lặp đoạn exon 51-60 BÀN LUẬN Có nhiều phương pháp phát đột biến gene Dystrophin PCR, Southern blot, PCR định lượng, FISH (fluorescence in situ hybridization) giải trình tự xác định đột biến điểm… Tuy phản ứng có độ đặc hiệu cao tốn Nhận biết đột biến đoạn 25 exon đặc hiệu vùng “hotspots” phát 98% tổng số đột biến đoạn gene Dystrophin (6) Trong nghiên cứu này, chúng tơi nhiên, có hai phương pháp phổ biến hiệu phát 157/564 (27,8%) bệnh nhân có đột biến thường sử dụng để phát đột biến đoạn, 96/157 (61,1%) bệnh nhân chủ đoạn lặp đoạn gene DMD phương yếu đoạn vùng hotspots (Exon 45-52) pháp Multiplex PCR MLPA Phương pháp MLPA (Multiplex ligation- Phương pháp Multiplex PCR phương pháp dependent probe amplification) phương pháp sàng lọc đoạn 25 exon vùng hot spot Đây cho phép khuếch đại nhiều đoạn gene khác phương pháp nhân đoạn nhiều exon với cặp mồi Mỗi đầu dị 67 TẠP CHÍ NHI KHOA 2016, 9, KẾT LUẬN (probe) bao gồm cặp mồi (primer), cặp mồi bắt cặp từ hai đầu vùng gene quan tâm, sau hai cặp mồi nối lại với thành trình tự đích hoàn chỉnh Phương pháp MLPA phương pháp cho phép sàng lọc đoạn lặp đoạn 79 exon chia làm hai P034-P035 (8) Với bệnh nhân có triệu chứng lâm sàng điển hình không phát đột biến 25 exon vùng hot spots, tiếp tục sử dụng kỹ thuật MLPA để phân tích - Sự kết hợp hai phương pháp Multiplex PCR MLPA phát 172/564 (30.5%) bệnh nhân DMD/BMD có đột biến đoạn lặp đoạn Các đột biến xảy chủ yếu nằm vùng hot spots - Kỹ thuật Multiplex PCR MLPA kỹ thuật có độ nhạy độ đặc hiệu cao, làm tăng tỷ lệ phát đột biến gene DMD gene DMD, kết phát thêm 06/61 (9,84%) TÀI LIỆU THAM KHẢO bệnh nhân bị đột biến đoạn và 09/61 (14,75%) bệnh nhân có đột biến lặp đoạn Theo nghiên cứu Prior cộng tỷ lệ đột biến đoạn gene Dystrophin 70% Emery AE Population frequencies of inherited neuromuscular diseases a world survey Neuromuscul Disord 1991;1(1): 19-29 (306 ca DMD 55 ca BMD có đột biến đoạn) Bushby KM, Thambyayah M, Gardner - đột biến chủ yếu tập trung vùng “hos pots” , Medwin D Prevalence and incidence of Becker chiếm tỷ lệ khoảng 80% (9) Yuge cộng (10) muscular dystrophy Lancet 1991;337(8748): nghiên cứu 138 bệnh nhân DMD với kết 1022-4 có 62% bệnh nhân bị đoạn, có Koenig M, Hoffman EP, Bertelson CJ, Monaco 68% bệnh nhân đoạn vùng hospot Nhờ AP, Feener C, Kunkel LM Complete cloning of the sử dụng kết hợp phương pháp MultiplexPCR Duchenne muscular dystrophy (DMD) cDNA and MLPA, Janssen cộng phát 53% preliminary genomic organization of the DMD tổng số bệnh nhân có đột biến đoạn lặp gene in normal and affected individuals Cell đoạn (11) Nghiên cứu Zimowski cộng 1987;50(3): 509-17 (12) phát 134/180 bệnh nhân (73.9%) bệnh Forrest SM, Cross GS, Flint T, Speer A, nhân có đoạn gene DMD phương Robson KJ, Davies KE Further studies of gene pháp MLPA Trong nghiên cứu chúng tôi, deletions that cause Duchenne and Becker kết hợp haiphương pháp Multiplex PCR muscular dystrophies Genomics 1988;2(2): 109- MLPA tăng tỷ lệ phát đột biến từ 27.8% 14 lên 30.5% làm đa dạng khả phát Den Dunnen JT, Grootscholten PM, Bakker loại đột biến đoạn lớn, đoạn E, Blonden LA, Ginjaar HB, Wapenaar MC, et al nhỏ, lặp đoạn… Sự khác tỷ lệ đoạn Topography of the Duchenne muscular dystrophy gene Dystrophin phụ thuộc vào số (DMD) gene: FIGE and cDNA analysis of 194 cases lượng exon phân tích số lượng mẫu reveals 115 deletions and 13 duplications Am J nghiên cứu Hum Genet 1989;45(6): 835-47 68 PHẦN NGHIÊN CỨU Beggs AH, Koenig M, Boyce FM, Kunkel LM Becker muscular dystrophy using CDNA probes Detection of 98% of DMD/BMD gene deletions and the polymerase chain reaction method Life by polymerase chain reaction Hum Genet Sci 1999;65(9): 863-9 1990;86(1): 45-8 11 Janssen B, Hartmann C, Scholz V, Jauch Chamberlain JS, Gibbs RA, Ranier JE, Nguyen PN, Caskey CT Deletion screening of the Duchenne muscular dystrophy locus via multiplex DNA amplification Nucleic Acids Res 1988;16(23): 11141-56 Schouten JP, McElgunn CJ, Waaijer R, Zwijnenburg D, Diepvens F, Pals G Relative quantification of 40 nucleic acid sequences by multiplex ligation-dependent probe amplification Nucleic Acids Res 2002; 30(12): e57 Prior TW, Bridgeman SJ Experience and A, Zschocke J MLPA analysis for the detection of deletions, duplications and complex rearrangements in the dystrophin gene: potential and pitfalls Neurogenetics 2005;6(1): 29-35 12 Zimowski JG, Massalska D, Holding M, Jadczak S, Fidzianska E, Lusakowska A, et al MLPA based detection of mutations in the dystrophin gene of 180 Polish families with Duchenne/Becker muscular dystrophy Neurologia i neurochirurgia polska 2014;48(6): 416-22 strategy for the molecular testing of Duchenne 13 Katharine Bushby, Richard Finkel, David muscular dystrophy J Mol Diagn 2005;7(3): 317- J Birnkrant, et al Diagnosis and management 26 of Duchenne muscular dystrophy, part 1: 10 Yuge L, Hui L, Bingdi X Detection of gene diagnosis, and pharmacological and psychosocial deletions in Chinese patients with Duchenne/ management Lancet Neurol 2010 Jan; 9(1): 77-93 ABSTRACT DETECTION MUTATION IN DYSTROPHIN GENE USING MOLECULAR TECHNIQUES IN DUCHENNE/BECKER PATIENTS Ngo Manh Tien*, Nguyen Thi Phuong Mai*, Nguyen Thi Mai Huong*, Ly Thi Thanh Ha*, Ngo Thi Tuyet Nhung*, Ngo Diem Ngoc*, Nguyen Ngoc Khanh**, Bui Phuong Thao**, Vu Chi Dung** * ** Human Genetics Department, National Hospital of Peadiatrics, Hanoi, Vietnam Endocrinology-Metabolic-Genetic Department, National Hospital of Pediatrics, Hanoi, Vietnam Overview: Duchenne muscular dystrophy (DMD) is one of the most common genetic neuromuscular diseasesat the rate of out of 3500male live births Goal: Detecting mutation in Dytrophin gene Patients and Method: 564 patients suspected of Duchenne muscular dystrophy (DMD) were collected from 2005 to 12-2014 at National Hospital of Pediatrics The detection of deletion and dulication mutation in Dystrophin gene were identified by Multiplex PCR technique and MLPA technique (Multiplex Liation-dependent Probe Amplification) Results: In this study, we have discovered 69 TẠP CHÍ NHI KHOA 2016, 9, 172/564 (30.5%) cases of deletion and duplication mutations, in which 157/564 (27.8%) cases of deletion mutations by multiplex PCR technique The remaining cases are cases deletion and cases duplication mutation by MLPA technique Most of the mutation arelocated in the hotspot of the Dystrophin gene, including mutations in the central genomic region for (exon 45-52) 61.1% and in the 5’ region (exon 3-19) 29.3%, following is the remaining of the gene 9.6% (respectively) Conclusion: Multiplex PCR technique and MLPA technique detect deletions and duplication mutations in the Dystrophin gene, have high sensitivity and specificity and efficiency in diagnosing genetic Duchenne muscular dystrophy díseases Keywords: Duchenne, DMD, Dystrophin, multiplex PCR (MPCR) 70 ... (14.75%) bệnh nhân có đột biến lặp biến đoạn nhỏ lặp đoạn Kết đoạn, có trường hợp có đột có 06/61 (9.84%) bệnh nhân bị đột biến biến lặp đoạn exon 65 TẠP CHÍ NHI KHOA 2016, 9, Bảng Tỷ lệ phát đột biến. .. (27,8%) bệnh nhân có đột biến thường sử dụng để phát đột biến đoạn, 96/157 (61,1%) bệnh nhân chủ đoạn lặp đoạn gene DMD phương yếu đoạn vùng hotspots (Exon 45-52) pháp Multiplex PCR MLPA Phương pháp. .. huyết tăng cao 20 lần biểu hiện, bệnh nhân BMD thường so với trị số bình thường (13) có khoảng 10-40% lượng protein dystrophin Các đột biến xảy gene đột biến đoạn, đột biến điểm, chuyển đoạn đoạn